無(wú)菌操作技術(shù)一

無(wú)菌操作技術(shù)一第1頁(yè)/共18頁(yè)無(wú)菌操作技術(shù)（一）—器皿的清洗、包扎、滅菌及培養(yǎng)基的配制實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?、掌握實(shí)驗(yàn)用器皿的清洗、包扎方法2、了解常用的滅菌方法—干熱滅菌、濕熱滅菌、紫外線滅菌及化學(xué)滅菌3、掌握培養(yǎng)基的配制及不同類(lèi)型滅菌器的使用。第2頁(yè)/共18頁(yè)無(wú)菌操作技術(shù)（一）—器皿的清洗、包扎、滅菌及培養(yǎng)基的配制一、實(shí)驗(yàn)用器皿的清洗及洗滌液的配制1、洗滌液的種類(lèi)及配制

（1）去垢劑溶液（常用洗滌液）。生化去垢劑（detergent）

A．中性去垢劑又稱(chēng)非離子表面活性劑，對(duì)蛋白質(zhì)的變性作用影響較少，宜于蛋白質(zhì)或酶提取之用。一般市售有聚乙二醇類(lèi)，如PEG200；多元醇類(lèi)表面活性劑，如山梨醇、司班和吐溫類(lèi)：司班-80和吐溫-20第3頁(yè)/共18頁(yè)無(wú)菌操作技術(shù)（一）—器皿的清洗、包扎、滅菌及培養(yǎng)基的配制B．陰離子去垢劑：常見(jiàn)的有十二烷基硫酸鈉和十二烷基璜酸鈉。常用于核酸的提取。C．陽(yáng)離子去垢劑：如潔爾滅、新潔爾滅、消毒凈等，消毒滅菌類(lèi)居多。第4頁(yè)/共18頁(yè)無(wú)菌操作技術(shù)（一）—器皿的清洗、包扎、滅菌及培養(yǎng)基的配制D．天然表面活性劑：又稱(chēng)為生物表面活性劑，如各種樹(shù)膠（阿拉伯膠、果膠）、明膠、皂甙、卵磷脂、瓊脂、海藻酸鈉、酪蛋白、多糖類(lèi)（如環(huán)糊精）等。E．兩性表面活性劑：在堿性水溶液中呈陰離子表面活性劑的性質(zhì)，起泡性好，去污力也強(qiáng)；在酸性溶液中則呈現(xiàn)陽(yáng)離子表面活性劑特征，其殺菌性很強(qiáng)。第5頁(yè)/共18頁(yè)無(wú)菌操作技術(shù)（一）—器皿的清洗、包扎、滅菌及培養(yǎng)基的配制（2）鉻酸洗液：[又稱(chēng)重鉻酸鉀（或鈉）——濃硫酸洗滌液，簡(jiǎn)稱(chēng)洗液]廣泛用于玻璃儀器的洗滌。其配制方法如下：

①稱(chēng)取5g重鉻酸鉀(或鈉)粉末放入250ml燒杯中，加5ml水，盡量使其溶解。然后邊攪拌，邊緩緩注入濃H2SO4l00ml，待洗液溫度冷卻至40℃以下，將其轉(zhuǎn)移到具玻塞的細(xì)頸干燥的試劑瓶?jī)?nèi)貯存?zhèn)溆谩?/p>

②稱(chēng)取10g重鉻酸鉀粉末置于500ml燒杯中，加水20ml，盡量使其溶解。然后慢慢注入濃H2SO4180ml，隨加隨攪拌。冷卻后貯于具玻塞的細(xì)頸試劑瓶中備用。

第6頁(yè)/共18頁(yè)無(wú)菌操作技術(shù)（一）—器皿的清洗、包扎、滅菌及培養(yǎng)基的配制（3）濃HCl（工業(yè)用）常用于洗去水垢或某些無(wú)機(jī)鹽沉淀。

（4）濃HNO3（常用于洗滌除去金屬離子）。

（5）1mol/LKOH溶液。

（6）8mol/L尿素洗滌液（PH1.0）適用于洗滌盛蛋白質(zhì)溶液及血樣的器皿。

（7）10-3mol/LEDTA溶液用于除去塑料容器內(nèi)壁污染的金屬離子。

（8）5%-10%磷酸三鈉（Na3PO4·12H2O）溶液（用于洗滌油污物）。

（9）氫氧化鉀（KOH）的乙醇溶液和含有高錳酸鉀的氫氧化鈉（NaOH）溶液，適用于清除容器內(nèi)壁污垢，但這兩種強(qiáng)堿性洗滌液對(duì)玻璃儀器的侵蝕性很強(qiáng)，故洗滌時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)，使用時(shí)應(yīng)小心慎重。

（10）有機(jī)溶劑：丙酮、乙醇、乙醚等可用于洗脫油脂、脂溶性染料等污痕。二甲苯可洗脫油漆類(lèi)污垢。

第7頁(yè)/共18頁(yè)無(wú)菌操作技術(shù)（一）—器皿的清洗、包扎、滅菌及培養(yǎng)基的配制2．玻璃儀器的清洗

（1）初用玻璃儀器的洗滌

新購(gòu)置的玻璃儀器表面常附著有游離的堿性物質(zhì)，可先用去垢劑（0.5%水溶液）或肥皂水洗刷，再用自來(lái)水洗凈。然后浸泡1%—2%HCl溶液中過(guò)液，次日取出用自來(lái)水充分沖洗，最后再用蒸餾水漂洗數(shù)次，置烘箱內(nèi)烘干或倒置晾干備用。

（2）使用過(guò)的玻璃儀器的洗滌

第8頁(yè)/共18頁(yè)①一般玻璃儀器洗滌

自來(lái)水沖洗→去垢劑洗滌或浸泡于0.5%去垢劑水溶液中→將器皿內(nèi)外（特別是內(nèi)壁）仔細(xì)刷洗后→自來(lái)水充分洗凈→蒸餾水漂洗數(shù)次，烘干或晾干備用。凡洗凈的玻璃器皿，其壁上不沾有水珠，否則表示尚未洗凈，應(yīng)按上述方法重新洗滌。量具玻璃儀器不能烘烤，只能晾干或風(fēng)干第9頁(yè)/共18頁(yè)無(wú)菌操作技術(shù)（一）—器皿的清洗、包扎、滅菌及培養(yǎng)基的配制②移液管（吸量管）的洗滌

移液管每次使用后須及時(shí)用流水沖洗或浸泡于冷水中，特別是吸取粘滯性較大的液體（全血、血漿、血清等）后應(yīng)立即用流水充分沖洗，以免物質(zhì)干涸和堵塞移液管。通常使用過(guò)的移液管經(jīng)自來(lái)水沖洗后，可浸泡于0.5%去垢劑溶液中或鉻酸洗液中過(guò)夜（不少于4h），然后分別用自來(lái)水充分沖洗和蒸餾水漂洗，晾干備用。

第10頁(yè)/共18頁(yè)無(wú)菌操作技術(shù)（一）—器皿的清洗、包扎、滅菌及培養(yǎng)基的配制③玻璃比色皿和石英比色皿的清洗

比色皿使用后應(yīng)立即用蒸餾水充分沖洗，倒置在清潔處晾干備用。所有比色皿均可用0.5%去垢劑溶液洗滌，必須用脫脂棉小心地清洗，然后用大量蒸餾水充分漂洗干凈，倒置晾干。但不能用氫氧化鉀的乙醇溶液及其他強(qiáng)堿洗滌液清洗比色皿，因這樣導(dǎo)致比色皿的嚴(yán)重腐蝕。

第11頁(yè)/共18頁(yè)無(wú)菌操作技術(shù)（一）—器皿的清洗、包扎、滅菌及培養(yǎng)基的配制3．塑料器皿的洗滌

新購(gòu)買(mǎi)的塑料器皿：自來(lái)水清洗后→8mol·L-1尿素溶液（PH1.0）洗滌，→蒸餾水漂洗→1mol/LKOH溶液洗滌→蒸餾水漂洗→10-3mol/LEDTA溶液洗滌，以除去污染的金屬離子→雙蒸餾水充分漂洗，倒置晾干備用。使用后塑料器皿:0.5%去垢劑溶液洗滌→自來(lái)水充分沖洗和蒸餾水漂洗晾干后即可使用。如果必要也可按堿→尿素→EDTA洗滌順序處理，以除去器皿上的污染物。第12頁(yè)/共18頁(yè)無(wú)菌操作技術(shù)（一）—器皿的清洗、包扎、滅菌及培養(yǎng)基的配制二、常用滅菌方法：干熱滅菌：在干燥環(huán)境（如火焰或干熱空氣）進(jìn)行滅菌的技術(shù)。一般有火焰滅菌法和干熱空氣滅菌法火焰滅菌：指用火焰直接燒灼的滅菌方法。該方法滅菌迅速、可靠、簡(jiǎn)便，適合于耐火焰材料（如金屬、玻璃及瓷器等）物品與用具的滅菌，不適合藥品的滅菌。干熱滅菌：該法適用于耐高溫的玻璃和金屬制品以及不允許濕熱氣體穿透的油脂（如油性軟膏機(jī)制、注射用油等）和耐高溫的粉末化學(xué)藥品的滅菌，不適合橡膠、塑料及大部分藥品的滅菌。135-140℃滅菌3-5h；160-170℃滅菌2-4h；180-200℃滅菌0.5-1h。細(xì)菌的繁殖體在干燥狀態(tài)下，80℃～100℃1小時(shí)可被殺死；芽胞需要加熱至160℃～170℃2小時(shí)才殺滅第13頁(yè)/共18頁(yè)無(wú)菌操作技術(shù)（一）—器皿的清洗、包扎、滅菌及培養(yǎng)基的配制濕熱滅菌：濕熱滅菌法是指用飽和水蒸氣、沸水或流通蒸汽進(jìn)行滅菌的方法，由于蒸汽潛熱大，穿透力強(qiáng)，容易使蛋白質(zhì)變性或凝固，所以該法的滅菌效率比干熱滅菌法高，是藥物制劑生產(chǎn)過(guò)程中最常用的滅菌方法。濕熱滅菌法可分為：煮沸滅菌法、巴氏消毒法、高壓蒸汽滅菌法、流通蒸汽滅菌法、和間歇蒸汽滅菌法。103.4千帕蒸汽壓溫度達(dá)121.3℃，維持15-20分鐘。第14頁(yè)/共18頁(yè)無(wú)菌操作技術(shù)（一）—器皿的清洗、包扎、滅菌及培養(yǎng)基的配制紫外線滅菌：是指用紫外線（能量）照射殺滅微生物的方法，紫外線不僅能使核酸蛋白變性，而且能使空氣中氧氣產(chǎn)生微量臭氧，從而達(dá)到共同殺菌作用。用于紫外線滅菌的波長(zhǎng)一般為200~300nm，滅菌里最強(qiáng)的為254nm。該方法屬于表面滅菌。該法適于照射物體表面滅菌、無(wú)菌室空氣及蒸餾水的滅菌；不適用于藥液的滅菌及固體物料的深部滅菌。由于紫外線是以直線傳播，可被不同的表面反射或吸收，穿透力微弱，普通玻璃可吸收紫外線，因此裝于容器中的藥物不能用紫外線來(lái)滅菌。第15頁(yè)/共18頁(yè)無(wú)菌操作技術(shù)（一）—器皿的清洗、包扎、滅菌及培養(yǎng)基的配制化學(xué)滅菌：用化學(xué)藥品直接作用于微生物而將其殺死的方法。1.氣體滅菌法：采用氣態(tài)殺菌劑（如臭氧、環(huán)氧乙烷、甲醛、丙二醇、甘油和過(guò)氧乙酸蒸汽等）進(jìn)行滅菌的方法。該法特別適合環(huán)境消毒以及不耐加熱滅菌的醫(yī)用器具、設(shè)備和設(shè)施的消毒。臨床供應(yīng)商常用到的環(huán)氧乙烷低溫滅菌器、過(guò)氧化氫等離子體滅菌器、低溫蒸汽甲醛滅菌器都是這中方法。亦可用于粉末注射劑，但不適合于對(duì)產(chǎn)品質(zhì)量有損害的場(chǎng)合。2.液體滅菌法：采用殺菌劑容易如進(jìn)行消毒的方法。該法常作為其他滅菌法的輔助措施，適合于皮膚、無(wú)菌器具和設(shè)備的消毒。常采用的消毒液有75%乙醇、1%聚維酮碘溶液、0.1%~0.2%苯扎溴銨（新潔爾滅）