液相色譜培訓(xùn)

液相色譜培訓(xùn)第1頁，共56頁，2023年，2月20日，星期日一、色譜起源石油醚碳酸鈣顆粒色素色譜組分第2頁，共56頁，2023年，2月20日，星期日液相色譜：以液體作為流動相的色譜分離方法適用于高沸點(diǎn)、大分子、強(qiáng)極性和熱穩(wěn)定性差的化合物的分析流動相具有運(yùn)載樣品分子和選擇性分離的雙重作用

氣相色譜：以氣體作為流動相的色譜分離方法適用于沸點(diǎn)較低、熱穩(wěn)定性好的中小分子化合物的分析流動相只起運(yùn)載樣品分子的能力

液相色譜基礎(chǔ)知識第3頁，共56頁，2023年，2月20日，星期日HPLC的分離類型正相色譜(NP-HPLC)反相色譜(RP-HPLC)反相離子對色譜(RPIC)離子交換色譜(IEC)空間排阻色譜(SEC)手性化合物分離模式(Chiralseparationmode)第4頁，共56頁，2023年，2月20日，星期日液相色譜按兩相極性不同分為:正相色譜反相色譜化合物保留時間隨流動相配比的變化不同極性的化合物出峰順序第5頁，共56頁，2023年，2月20日，星期日正相HPLC色譜柱硅膠型

氰基型

氨基型

糖類分析二醇基型蛋白質(zhì)分析SilicagelSiSi-Si-CH2CH2CH2CN-Si-CH2CH2CH2NH2-Si-CH2CH2CH2OCH(OH)-CH2(OH)ModifiedSi第6頁，共56頁，2023年，2月20日，星期日反相HPLC色譜柱C18(ODS)typeC8(octyl)typeC4(butyl)typePhenyltypeTMStypeCyanotype-Si-C18H37SiNon-polarproperty第7頁，共56頁，2023年，2月20日，星期日

色譜柱

: 非極性溶劑 : 極性水

/甲醇

/乙腈反相色譜第8頁，共56頁，2023年，2月20日，星期日液相色譜流程圖輸液泵進(jìn)樣器色譜柱柱溫箱檢測器溶劑數(shù)據(jù)處理第9頁，共56頁，2023年，2月20日，星期日流動相流動相選擇注意事項：純度：采用“HPLC”級溶劑避免使用會引起柱效損失或保留特性變化的溶劑對試樣有適宜的溶解度溶劑粘度要小與檢測器相匹配流動相配制時的順序第10頁，共56頁，2023年，2月20日，星期日溶劑等級水的等級純化水蒸餾水去離子水波長(nm)純化水去離子水因?yàn)椴患兾锏拇嬖?，去離子的吸光率較高純化水中去除了無機(jī)和有機(jī)的污染物吸光率第11頁，共56頁，2023年，2月20日，星期日水/MeOH梯度ODS柱鬼峰GradientCurve1ml/min,0-100%MeOHover10minsandholdfor15mins.溶劑等級鬼峰的出現(xiàn)第12頁，共56頁，2023年，2月20日，星期日溶劑等級溶劑的等級HPLC級優(yōu)級純分析純都經(jīng)過蒸餾和0.45um的過濾(除纖維毛,未溶解的機(jī)械顆粒)優(yōu)級純的純度比分析純大,但里面含有防腐劑和抗氧化劑HPLC級經(jīng)過0.22um的過濾,且除去有紫外吸收的雜質(zhì)微量分析、梯度洗脫第13頁，共56頁，2023年，2月20日，星期日甲醇乙睛正己烷分析純級和HPLC級溶劑的吸光度比較圖溶劑等級第14頁，共56頁，2023年，2月20日，星期日溶劑前處理過濾：0.45um或更小孔徑濾膜目的：除去溶劑中的微小顆粒，避免堵塞色譜柱，尤其是使用無機(jī)鹽配制的緩沖液。過濾膜種類水系過濾膜有機(jī)系過濾膜第15頁，共56頁，2023年，2月20日，星期日30mm內(nèi)徑：適用于大進(jìn)樣量的過濾，由0.22μm和0.45μm兩種規(guī)格,材料有纖維素,醋酸纖維,聚四氟乙烯。處理樣品體積少于50μl。13mm內(nèi)徑：適用于范圍廣的過濾，由0.22μm和0.45μm兩種規(guī)格,材料為纖維素。3mm內(nèi)徑：適用于小進(jìn)樣量的過濾，由0.22μm和0.45μm兩種規(guī)格。處理樣品體積為7μl。樣品過濾頭的類型：第16頁，共56頁，2023年，2月20日，星期日濾膜類型：聚四氟乙烯濾膜：適用于所有溶劑，酸和鹽，并無任何可溶物。醋酸纖維濾膜：不適用于有機(jī)溶劑，特別適用于水基溶液，推薦用于蛋白質(zhì)和其相關(guān)樣品。尼龍66濾膜：適用于絕大多數(shù)有機(jī)溶劑和水溶液，可用于強(qiáng)酸,70%乙醇、二氯甲烷、不適用于二甲基甲酰胺。再生纖維素濾膜：具有蛋白吸收低，同樣適用水溶性樣品和有機(jī)溶劑。第17頁，共56頁，2023年，2月20日，星期日溶劑前處理

脫氣目的：除去流動相中溶解或因混合而產(chǎn)生的氣泡一般混合溶劑中能容納的空氣量往往要比單個溶劑所能容納的空氣總量要小氣泡對測定的影響：

1）柱壓波動，流量偏小

2）基線波動

返回第18頁，共56頁，2023年，2月20日，星期日流路中形成氣泡引起的問題

改變保留時間和峰面積流動相中形成氣泡對液流的不良影響泵中形成氣泡使液流波動峰變形柱中氣泡形成和累積使流動相繞流尖峰或鋸齒狀噪聲檢測池中氣泡形成和累積產(chǎn)生基線噪聲第19頁，共56頁，2023年，2月20日，星期日輸液泵輸液泵控制方式：恒流控制恒壓控制輸液泵類型：注射泵柱塞往復(fù)泵隔膜泵第20頁，共56頁，2023年，2月20日，星期日柱塞往復(fù)泵單向閥馬達(dá)和凸輪柱塞桿柱塞桿密封圈泵頭10-100uL第21頁，共56頁，2023年，2月20日，星期日柱塞往復(fù)泵優(yōu)點(diǎn)壓力脈動小易于更換溶劑缺點(diǎn)需要更換柱塞桿密封圈第22頁，共56頁，2023年，2月20日，星期日島津VP系列輸液泵目的單元流速范圍 特性和應(yīng)用

分析

LC-10ADVP 0.001-9.999 無脈動，適于

半微量LC和LC-MS

LC-10ATVP 0.001-9.999 非凡的耐用性，適于常量分析*所有單元都既可做高壓梯度又可做低壓梯度第23頁，共56頁，2023年，2月20日，星期日等度洗脫輸液泵進(jìn)樣器色譜柱柱溫箱檢測器單一或混合溶劑第24頁，共56頁，2023年，2月20日，星期日梯度洗脫

A泵進(jìn)樣器色譜柱柱溫箱檢測器B泵AB時間B

濃度第25頁，共56頁，2023年，2月20日，星期日分析時間長分離度差

MeOH/H2O=6/4MeOH/H2O=8/2(column:ODStype)等度洗脫第26頁，共56頁，2023年，2月20日，星期日95%30%MeOH濃度梯度洗脫第27頁，共56頁，2023年，2月20日，星期日梯度洗脫：優(yōu)點(diǎn)：可提高分離度、縮短分離時間、降低最小檢測量和提高分離精度注意事項：溶劑的純度要高，否則梯度洗脫的重現(xiàn)性差梯度混合的溶劑互溶性要好梯度洗脫應(yīng)使用對流動相組成變化不敏感的選擇性檢測器（如紫外吸收檢測器或熒光檢測器），而不能使用對流動相組成變化敏感的通用型檢測器（如示差折光檢測器）第28頁，共56頁，2023年，2月20日，星期日混合器低壓梯度比例閥高壓梯度低壓梯度脫氣機(jī)高壓/低壓梯度系統(tǒng)第29頁，共56頁，2023年，2月20日，星期日返回高壓梯度系統(tǒng)梯度準(zhǔn)確度好系統(tǒng)復(fù)雜(需兩臺或三臺泵)低壓梯度系統(tǒng)系統(tǒng)簡單需在線脫氣機(jī)存在時間滯后效應(yīng)高壓/低壓梯度系統(tǒng)第30頁，共56頁，2023年，2月20日，星期日進(jìn)樣器自動進(jìn)樣器手動進(jìn)樣器原理：（六通閥）注入方式：

1）全量注入

2）部分注入返回第31頁，共56頁，2023年，2月20日，星期日手動進(jìn)樣器的原理圖

裝填狀態(tài)進(jìn)樣狀態(tài)返回第32頁，共56頁，2023年，2月20日，星期日進(jìn)樣體積檢測器響應(yīng)值定量管體積的一半3倍定量管體積全量注入部分注入進(jìn)樣體積與響應(yīng)值關(guān)系返回第33頁，共56頁，2023年，2月20日，星期日柱溫箱分析結(jié)果重現(xiàn)性好提高柱效降低柱壓保證檢測穩(wěn)定性

柱溫控制的優(yōu)點(diǎn)：第34頁，共56頁，2023年，2月20日，星期日色譜柱1）柱壓低于150kgf/cm2（15cm色譜柱）2）柱溫在40℃左右，最高使用溫度為50℃3）流動相PH使用范圍為2～7.5返回ODS柱的使用注意點(diǎn)：第35頁，共56頁，2023年，2月20日，星期日流動相注意點(diǎn)離子對試劑的使用具有緩沖鹽流動相的使用分析結(jié)束及開始流動相平衡加快平衡時間異丙醇的使用第36頁，共56頁，2023年，2月20日，星期日LC檢測器紫外可見檢測器（UV/VIS）二極管陣列檢測器（PDA）示差檢測器（RID）電導(dǎo)檢測器（CDD）熒光檢測器（RF）電化學(xué)檢測器（L-ECD）質(zhì)譜檢測器（MS）蒸發(fā)光散射檢測器（ELSD）

第37頁，共56頁，2023年，2月20日，星期日紫外可見檢測器原理：基于被分析組分對特定波長紫外光的選擇性吸收定量基礎(chǔ)：Lambert-Beer定律，A＝KCL優(yōu)點(diǎn)：1）對溫度和流速變化不敏感

2）可用于梯度分析缺點(diǎn)：僅適用于測定有紫外吸收的物質(zhì)紫外可見檢測器第38頁，共56頁，2023年，2月20日，星期日樣品池參比池光電管光電管EinEinEin光柵D2/W燈lEout紫外可見檢測器第39頁，共56頁，2023年，2月20日，星期日島津VP系列紫外檢測器功能1）設(shè)定時間程序（波長切換等）2）雙波長檢測3）比例色譜，初步判斷峰的純度4）停泵掃描，確定組分最大吸收波長NEXT第40頁，共56頁，2023年，2月20日，星期日波長切換返回第41頁，共56頁，2023年，2月20日，星期日雙波長檢測返回第42頁，共56頁，2023年，2月20日，星期日比例色譜280nm220nmratio280/220返回第43頁，共56頁，2023年，2月20日，星期日波長掃描返回第44頁，共56頁，2023年，2月20日，星期日二極管陣列檢測器（SPD－M10AVP）二十一世紀(jì)標(biāo)準(zhǔn)紫外檢測器色譜信息：保留時間常規(guī)紫外檢測器紫外光譜二極管陣列檢測器第45頁，共56頁，2023年，2月20日，星期日樣品池二極管陣列（512個單元）光柵D2/W燈每一單元可檢測一個波長下的吸光度二極管陣列檢測器第46頁，共56頁，2023年，2月20日，星期日三維譜圖時間波長吸光度色譜光譜第47頁，共56頁，2023年，2月20日，星期日二極管陣列檢測器的優(yōu)點(diǎn)1）采集三維譜圖2）峰純度檢驗(yàn)3）光譜庫檢索NEXT第48頁，共56頁，2023年，2月20日，星期日峰純度檢驗(yàn)（3點(diǎn)光譜圖比較）InitialdetectionpointFinaldetectionpointT1T3T2peaktopupslopedownslope1/21/3第49頁，共56頁，2023年，2月20日，星期日乙酰水楊酸下降點(diǎn)上升點(diǎn),頂點(diǎn)峰純度檢驗(yàn)（3點(diǎn)光譜圖比較）返回第50頁，共56頁，2023年，2月20日，星期日光譜庫檢索返回第51頁，共56頁，2023年，2月20日，星期日檢測器原理：連續(xù)測定流通池中溶液折射率變化以測定試樣各組分濃度。優(yōu)點(diǎn)：通用型檢測器缺點(diǎn)：1）對溫度和壓力變化敏感

2）不能用于梯度分析示差折光檢測器返回第52頁，共56頁，2023年，2月20日，星期日糖的色譜圖AnalyticalConditionsColumn:Shim-packCLC-NH2Mobilephase:Acetonitrile