微生物數(shù)量的測(cè)定

微生物數(shù)量的測(cè)定第1頁/共25頁微生物的生長通常以群體的生長作為指標(biāo)。群體生長表現(xiàn)為細(xì)胞數(shù)目的增加或者細(xì)胞物質(zhì)的增加。測(cè)定微生物數(shù)量的主要方法：顯微鏡直接計(jì)數(shù)法（不辨死活）平板菌落計(jì)數(shù)法（形成菌落的微生物）P32光電比濁法（不用于顏色太深的樣品）測(cè)定細(xì)胞重量法（測(cè)定絲狀真菌生長量）測(cè)定細(xì)胞總氮量或總碳量（適于濃度較高的樣品）。。。。。。

第2頁/共25頁實(shí)驗(yàn)十一、顯微鏡直接計(jì)數(shù)法第3頁/共25頁目的要求了解血球計(jì)數(shù)板的構(gòu)造、計(jì)數(shù)原理和計(jì)數(shù)方法；掌握顯微鏡下直接計(jì)數(shù)的技能。第4頁/共25頁顯微鏡直接計(jì)數(shù)法是將小量待測(cè)樣品的懸浮液置于一種特別的具有確定面積和容積的載玻片上，于顯微鏡下直接計(jì)數(shù)的一種簡便、快速、直觀的方法。直接計(jì)數(shù)法優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：直觀、快速、操作簡單。缺點(diǎn)：不能區(qū)分死菌與活菌，所得為總數(shù)；不適于對(duì)運(yùn)動(dòng)細(xì)菌的計(jì)數(shù)。第5頁/共25頁常用計(jì)菌器常用計(jì)數(shù)器有血球計(jì)數(shù)板(血細(xì)胞計(jì)數(shù)板)、Petroff-Hauser計(jì)菌器以及Hawksley計(jì)菌器等。各種計(jì)數(shù)板的計(jì)數(shù)原理相同，只是血球計(jì)數(shù)板較厚，不能使用油鏡觀察，只能計(jì)數(shù)較大的霉菌孢子和酵母菌；而后兩種計(jì)菌器細(xì)菌，可以使用油鏡觀察，因此可以直接計(jì)數(shù)細(xì)菌。第6頁/共25頁

血球計(jì)數(shù)板Petroff-Hauser計(jì)菌器Hawksley計(jì)菌器第7頁/共25頁血球計(jì)數(shù)板是一塊特制的載玻片，其上由四條槽構(gòu)成三個(gè)平臺(tái)；中間較寬的平臺(tái)又被一短橫槽隔成兩半，每一邊的平臺(tái)上各列有一個(gè)方格網(wǎng)。第8頁/共25頁血球計(jì)數(shù)板是一塊特制的載玻片，其上由四條槽構(gòu)成三個(gè)平臺(tái)；中間較寬的平臺(tái)又被一短橫槽隔成兩半，每一邊的平臺(tái)上各列有一個(gè)方格網(wǎng)。每個(gè)方格網(wǎng)共分為九個(gè)大方格，中間的大方格即為計(jì)數(shù)室。第9頁/共25頁血球計(jì)數(shù)板是一塊特制的載玻片，其上由四條槽構(gòu)成三個(gè)平臺(tái)；中間較寬的平臺(tái)又被一短橫槽隔成兩半，每一邊的平臺(tái)上各列有一個(gè)方格網(wǎng)。每個(gè)方格網(wǎng)共分為九個(gè)大方格，中間的大方格即為計(jì)數(shù)室。計(jì)數(shù)室的刻度一般有兩種規(guī)格：一種是一個(gè)大方格分成25個(gè)中方格，而每個(gè)中方格又分成16個(gè)小方格；另一種是一個(gè)大方格分成16個(gè)中方格，而每個(gè)中方格又分成25個(gè)小方格。第10頁/共25頁血球計(jì)數(shù)板是一塊特制的載玻片，其上由四條槽構(gòu)成三個(gè)平臺(tái)；中間較寬的平臺(tái)又被一短橫槽隔成兩半，每一邊的平臺(tái)上各列有一個(gè)方格網(wǎng)。每個(gè)方格網(wǎng)共分為九個(gè)大方格，中間的大方格即為計(jì)數(shù)室。計(jì)數(shù)室的刻度一般有兩種規(guī)格：一種是一個(gè)大方格分成25個(gè)中方格，而每個(gè)中方格又分成16個(gè)小方格；另一種是一個(gè)大方格分成16個(gè)中方格，而每個(gè)中方格又分成25個(gè)小方格。無論是哪一種規(guī)格的計(jì)數(shù)板，每一個(gè)大方格中的小方格都是400個(gè)。每一個(gè)大方格邊長為lmm，則每一個(gè)大方格的面積為lmm2，蓋上蓋玻片后，蓋玻片與載玻片之間的高度為0.lmm，所以計(jì)數(shù)室的容積為0.lmm3(萬分之一毫升)。第11頁/共25頁計(jì)數(shù)方法計(jì)算：1mL菌液中總菌數(shù)=A/5*25*104*B=50000*A*B1mL菌液中總菌數(shù)=A/5*16*104*B=32000*A*B其中B為稀釋倍數(shù)。使用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)時(shí)，通常數(shù)5個(gè)中方格的總菌數(shù)A，然后求每個(gè)中方格的平均值，再乘上大方格（計(jì)數(shù)室）中方格的數(shù)量，就得出一個(gè)大方格中的總菌數(shù)。數(shù)兩個(gè)大方格總菌數(shù)，平均后，再換算成每毫升菌液中微生物細(xì)胞的數(shù)量。第12頁/共25頁注意事項(xiàng)對(duì)于出芽的酵母菌，芽體達(dá)到母細(xì)胞大小一半時(shí)，即可作為兩個(gè)菌體計(jì)算。對(duì)于壓線酵母，按照數(shù)上不數(shù)下、數(shù)左不數(shù)右的原則計(jì)數(shù)第13頁/共25頁實(shí)驗(yàn)器材活材料：釀酒酵母（Saccharomycescerevisiae）培養(yǎng)液。其他器材：顯微鏡、血球計(jì)數(shù)板、電吹風(fēng)、蓋玻片（22mm×22mm）、吸水紙、計(jì)數(shù)器、滴管、擦鏡紙。第14頁/共25頁實(shí)驗(yàn)方法

1、用無菌生理鹽水將待測(cè)菌稀釋成適當(dāng)濃度的菌懸液（以每個(gè)小方格中5～10個(gè)菌為宜）。2、取潔凈的血球計(jì)數(shù)板一塊（事先鏡檢），蓋上一塊蓋玻片。3、將菌懸液搖勻，用無菌滴管吸取少許，沿蓋玻片邊緣摘入一小滴，讓菌懸液利用毛細(xì)滲透作用充滿計(jì)數(shù)區(qū)。4、加樣后靜止5min，將計(jì)數(shù)板置顯微鏡載物臺(tái)上，先用低倍鏡找到計(jì)數(shù)區(qū)，然后換高倍鏡計(jì)數(shù)。（光不宜太強(qiáng)）5、計(jì)數(shù)完畢，將血球計(jì)數(shù)板在水龍頭下流水沖洗干凈，用電吹風(fēng)吹干，鏡檢確認(rèn)計(jì)數(shù)區(qū)無殘留菌體或其它沉淀。第15頁/共25頁作業(yè)結(jié)果（填表）P55第16頁/共25頁實(shí)驗(yàn)十二、光電比濁計(jì)數(shù)法第17頁/共25頁了解光電比濁計(jì)數(shù)法的原理。學(xué)習(xí)、掌握光電比濁計(jì)數(shù)法的操作方法。目的要求第18頁/共25頁基本原理當(dāng)光線通過微生物菌懸液時(shí)，由于菌體的散射及吸收作用使光線的透過量降低。在一定范圍內(nèi)，微生物細(xì)胞濃度與透光度成反比，與光密度成正比，而光密度或透光度可以由光電池精確測(cè)出。因此，可用一系列已知菌數(shù)的菌懸液測(cè)定光密度，作出光密度-菌數(shù)標(biāo)準(zhǔn)曲線。然后，以樣品液所測(cè)得的光密度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線中查出對(duì)應(yīng)的菌數(shù)。第19頁/共25頁光電比濁計(jì)數(shù)法優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：簡便、快速、連續(xù)測(cè)定、適合自動(dòng)化。缺點(diǎn)：光密度受細(xì)胞大小、形態(tài)、培養(yǎng)液成分以及選用的波長的影響；對(duì)于不同微生物的菌懸液要選擇相應(yīng)的菌株和培養(yǎng)條件制作標(biāo)準(zhǔn)曲線；對(duì)于顏色太深的樣品或含其它具有吸光值的物質(zhì)不能用此法。第20頁/共25頁器材菌種釀酒酵母培養(yǎng)液儀器或其他用具分光光度計(jì)，血細(xì)胞計(jì)數(shù)板，顯微鏡，試管，吸水紙，無菌吸管，無菌生理鹽水等。第21頁/共25頁操作步驟標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作樣品測(cè)定每毫升細(xì)胞數(shù)光密度值第22頁/共25頁標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作1、血球計(jì)數(shù)板直接計(jì)數(shù)：首先采用血球計(jì)數(shù)直接計(jì)數(shù)釀酒酵母菌懸液。（2×108菌/mL）2、稀釋菌液：將上述已知濃度的釀酒酵母菌懸液用無菌生理鹽水進(jìn)行兩倍梯度稀釋,共稀釋6個(gè)濃度:1×108、5×107、2.5×107、1.25×107、6.25×106、3.125×106。3、測(cè)OD值：以無菌生理鹽水作為對(duì)照，于波長560nm處用1cm比色杯測(cè)定上述各菌液的OD值。4、以O(shè)D值為縱坐標(biāo)，每毫升菌數(shù)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。第23頁/共25頁樣品測(cè)定