微生物數(shù)量的測定

微生物數(shù)量的測定第1頁/共25頁微生物的生長通常以群體的生長作為指標。群體生長表現(xiàn)為細胞數(shù)目的增加或者細胞物質的增加。測定微生物數(shù)量的主要方法：顯微鏡直接計數(shù)法（不辨死活）平板菌落計數(shù)法（形成菌落的微生物）P32光電比濁法（不用于顏色太深的樣品）測定細胞重量法（測定絲狀真菌生長量）測定細胞總氮量或總碳量（適于濃度較高的樣品）。。。。。。

第2頁/共25頁實驗十一、顯微鏡直接計數(shù)法第3頁/共25頁目的要求了解血球計數(shù)板的構造、計數(shù)原理和計數(shù)方法；掌握顯微鏡下直接計數(shù)的技能。第4頁/共25頁顯微鏡直接計數(shù)法是將小量待測樣品的懸浮液置于一種特別的具有確定面積和容積的載玻片上，于顯微鏡下直接計數(shù)的一種簡便、快速、直觀的方法。直接計數(shù)法優(yōu)缺點優(yōu)點：直觀、快速、操作簡單。缺點：不能區(qū)分死菌與活菌，所得為總數(shù)；不適于對運動細菌的計數(shù)。第5頁/共25頁常用計菌器常用計數(shù)器有血球計數(shù)板(血細胞計數(shù)板)、Petroff-Hauser計菌器以及Hawksley計菌器等。各種計數(shù)板的計數(shù)原理相同，只是血球計數(shù)板較厚，不能使用油鏡觀察，只能計數(shù)較大的霉菌孢子和酵母菌；而后兩種計菌器細菌，可以使用油鏡觀察，因此可以直接計數(shù)細菌。第6頁/共25頁

血球計數(shù)板Petroff-Hauser計菌器Hawksley計菌器第7頁/共25頁血球計數(shù)板是一塊特制的載玻片，其上由四條槽構成三個平臺；中間較寬的平臺又被一短橫槽隔成兩半，每一邊的平臺上各列有一個方格網。第8頁/共25頁血球計數(shù)板是一塊特制的載玻片，其上由四條槽構成三個平臺；中間較寬的平臺又被一短橫槽隔成兩半，每一邊的平臺上各列有一個方格網。每個方格網共分為九個大方格，中間的大方格即為計數(shù)室。第9頁/共25頁血球計數(shù)板是一塊特制的載玻片，其上由四條槽構成三個平臺；中間較寬的平臺又被一短橫槽隔成兩半，每一邊的平臺上各列有一個方格網。每個方格網共分為九個大方格，中間的大方格即為計數(shù)室。計數(shù)室的刻度一般有兩種規(guī)格：一種是一個大方格分成25個中方格，而每個中方格又分成16個小方格；另一種是一個大方格分成16個中方格，而每個中方格又分成25個小方格。第10頁/共25頁血球計數(shù)板是一塊特制的載玻片，其上由四條槽構成三個平臺；中間較寬的平臺又被一短橫槽隔成兩半，每一邊的平臺上各列有一個方格網。每個方格網共分為九個大方格，中間的大方格即為計數(shù)室。計數(shù)室的刻度一般有兩種規(guī)格：一種是一個大方格分成25個中方格，而每個中方格又分成16個小方格；另一種是一個大方格分成16個中方格，而每個中方格又分成25個小方格。無論是哪一種規(guī)格的計數(shù)板，每一個大方格中的小方格都是400個。每一個大方格邊長為lmm，則每一個大方格的面積為lmm2，蓋上蓋玻片后，蓋玻片與載玻片之間的高度為0.lmm，所以計數(shù)室的容積為0.lmm3(萬分之一毫升)。第11頁/共25頁計數(shù)方法計算：1mL菌液中總菌數(shù)=A/5*25*104*B=50000*A*B1mL菌液中總菌數(shù)=A/5*16*104*B=32000*A*B其中B為稀釋倍數(shù)。使用血球計數(shù)板計數(shù)時，通常數(shù)5個中方格的總菌數(shù)A，然后求每個中方格的平均值，再乘上大方格（計數(shù)室）中方格的數(shù)量，就得出一個大方格中的總菌數(shù)。數(shù)兩個大方格總菌數(shù)，平均后，再換算成每毫升菌液中微生物細胞的數(shù)量。第12頁/共25頁注意事項對于出芽的酵母菌，芽體達到母細胞大小一半時，即可作為兩個菌體計算。對于壓線酵母，按照數(shù)上不數(shù)下、數(shù)左不數(shù)右的原則計數(shù)第13頁/共25頁實驗器材活材料：釀酒酵母（Saccharomycescerevisiae）培養(yǎng)液。其他器材：顯微鏡、血球計數(shù)板、電吹風、蓋玻片（22mm×22mm）、吸水紙、計數(shù)器、滴管、擦鏡紙。第14頁/共25頁實驗方法

1、用無菌生理鹽水將待測菌稀釋成適當濃度的菌懸液（以每個小方格中5～10個菌為宜）。2、取潔凈的血球計數(shù)板一塊（事先鏡檢），蓋上一塊蓋玻片。3、將菌懸液搖勻，用無菌滴管吸取少許，沿蓋玻片邊緣摘入一小滴，讓菌懸液利用毛細滲透作用充滿計數(shù)區(qū)。4、加樣后靜止5min，將計數(shù)板置顯微鏡載物臺上，先用低倍鏡找到計數(shù)區(qū)，然后換高倍鏡計數(shù)。（光不宜太強）5、計數(shù)完畢，將血球計數(shù)板在水龍頭下流水沖洗干凈，用電吹風吹干，鏡檢確認計數(shù)區(qū)無殘留菌體或其它沉淀。第15頁/共25頁作業(yè)結果（填表）P55第16頁/共25頁實驗十二、光電比濁計數(shù)法第17頁/共25頁了解光電比濁計數(shù)法的原理。學習、掌握光電比濁計數(shù)法的操作方法。目的要求第18頁/共25頁基本原理當光線通過微生物菌懸液時，由于菌體的散射及吸收作用使光線的透過量降低。在一定范圍內，微生物細胞濃度與透光度成反比，與光密度成正比，而光密度或透光度可以由光電池精確測出。因此，可用一系列已知菌數(shù)的菌懸液測定光密度，作出光密度-菌數(shù)標準曲線。然后，以樣品液所測得的光密度，從標準曲線中查出對應的菌數(shù)。第19頁/共25頁光電比濁計數(shù)法優(yōu)缺點優(yōu)點：簡便、快速、連續(xù)測定、適合自動化。缺點：光密度受細胞大小、形態(tài)、培養(yǎng)液成分以及選用的波長的影響；對于不同微生物的菌懸液要選擇相應的菌株和培養(yǎng)條件制作標準曲線；對于顏色太深的樣品或含其它具有吸光值的物質不能用此法。第20頁/共25頁器材菌種釀酒酵母培養(yǎng)液儀器或其他用具分光光度計，血細胞計數(shù)板，顯微鏡，試管，吸水紙，無菌吸管，無菌生理鹽水等。第21頁/共25頁操作步驟標準曲線的制作樣品測定每毫升細胞數(shù)光密度值第22頁/共25頁標準曲線的制作1、血球計數(shù)板直接計數(shù)：首先采用血球計數(shù)直接計數(shù)釀酒酵母菌懸液。（2×108菌/mL）2、稀釋菌液：將上述已知濃度的釀酒酵母菌懸液用無菌生理鹽水進行兩倍梯度稀釋,共稀釋6個濃度:1×108、5×107、2.5×107、1.25×107、6.25×106、3.125×106。3、測OD值：以無菌生理鹽水作為對照，于波長560nm處用1cm比色杯測定上述各菌液的OD值。4、以OD值為縱坐標，每毫升菌數(shù)為橫坐標，繪制標準曲線。第23頁/共25頁樣品測定