生物正交氧化還原體系的構建及意義,生物化學論文

生物正交氧化還原體系的構建及意義,生物化學論文細胞內(nèi)代謝經(jīng)過除以碳骨架構造改變?yōu)橹鞯奈镔|轉化外，通常還伴隨輔因子介導的能量轉移。物質轉化和能量轉移高度耦合，顯著增加了代謝系統(tǒng)的復雜度。氧化復原輔因子通過在氧化態(tài)和復原態(tài)之間循環(huán)再生傳遞電子，將物質轉化途徑關聯(lián)成復雜的代謝網(wǎng)絡[1].據(jù)不完全統(tǒng)計，在微生物中僅吡啶核苷酸輔酶〔nicotinamideadeninedinucleotide〔phosphate〕，NAD〔P〕〕及其復原態(tài)介入的生化反響就超過1000種[2],這還不包括它們介入的其他生物學經(jīng)過。傳統(tǒng)生物化學研究提供了大量生物學元件[3,4],系統(tǒng)生物學研究建立了各種代謝模型[5,6],分子生物學發(fā)展提供了有效的遺傳操作方式方法，使設計和構建新的高效、受控的物質轉化途徑成為可能。然而，輔因子在代謝網(wǎng)絡中的節(jié)點作用使各種生化反響建立起復雜的互相作用網(wǎng)絡，極大地影響了外源途徑在底盤細胞代謝環(huán)境中的功能。以氧化復原代謝為例，新途徑可能毀壞宿主內(nèi)源氧化復原平衡，進而抑制生長，使新途徑難以產(chǎn)生預期效果[7].人工構建的外源途徑對底盤細胞中天然代謝網(wǎng)絡的互相干擾，十分是氧化復原環(huán)境的干擾，是影響外源合成途徑與底盤細胞適配性的重要因素。通過調(diào)節(jié)胞內(nèi)輔因子水平，如控制酶的表示出水平、優(yōu)化代謝途徑、改造酶的輔因子偏好性以及敲除競爭代謝途徑等，能夠優(yōu)化外源途徑與底盤細胞的適配性，在一定程度上提高代謝調(diào)控效率[8~10].但輔因子擾動的生物學效應的可控性和可預見性低。例如，琥珀酸生產(chǎn)需要維持胞內(nèi)較高NADH水平，但高NADH水平影響菌株對培養(yǎng)條件的適應性[11].設計脂肪酸生產(chǎn)菌株時需要使脂肪酸合成途徑與宿主NADPH供應能力相匹配，但由于無法確定擾動NADPH水平對代謝造成的全局性影響，無法預測適宜的外源基因表示出強度，需要挑選不同表示出強度的啟動子表示出外源基因[12].輔因子關聯(lián)作用導致的復雜性也是限制代謝途徑可移植性的重要因素。例如，在大腸桿菌〔Escherichiacoli〕中構建的高效丁醇合成途徑,移植到藍細菌〔Cyanobacteria〕中就難以到達積累丁醇的效果，由于藍細菌傾向于積累NADPH而非NADH[13,14].因而，提高人工代謝途徑在底盤細胞中的適配性、可預見性和可移植性需要降低代謝系統(tǒng)，十分是輔因子依靠型氧化復原系統(tǒng)的復雜度。1正交氧化復原體系為降低代謝系統(tǒng)復雜度，可設計獨立于生長代謝的合成途徑及獨立的輔因子循環(huán)再生體系。這種在復雜代謝體系中執(zhí)行系統(tǒng)子功能，并且其執(zhí)行經(jīng)過獨立于系統(tǒng)其他組件的子系統(tǒng)稱為正交體系。正交體系的設計構建經(jīng)過即正交化[15].正交氧化復原體系是指電子傳遞獨立于系統(tǒng)其他氧化復原輔因子系統(tǒng)的一種氧化復原體系。當前主要有兩種策略可用于構建正交氧化復原體系：〔ⅰ〕在空間上分隔輔因子依靠型體系，即空間正交氧化復原體系〔ⅱ〕構建利用人工輔因子代替天然輔因子的體系，即生物正交氧化復原體系[8,15].設計構建正交氧化復原體系，是減少外源途徑對底盤細胞中天然代謝網(wǎng)絡的干擾，提高外源合成途徑與底盤細胞適配性的重要策略。下面綜述正交氧化復原體系的設計和應用特點。2空間正交氧化復原體系空間正交氧化復原體系通過將相關的酶及輔因子限定在特定區(qū)域，提高局部底物和輔因子濃度、減少或避免與其他子系統(tǒng)的互相作用[16,17],當前主要通過構建融合蛋白和設計蛋白錨定支架實現(xiàn)，并已有多個成功應用的報道。另外，近期發(fā)現(xiàn)，細胞內(nèi)可構成一些特殊的微區(qū)室〔microcompartment〕，能夠有效限制輔因子或代謝中間體擴散，進而避免胞內(nèi)輔因子水平干擾微區(qū)室內(nèi)氧化復原代謝[18,19].利用微區(qū)室可以構建空間正交氧化復原體系[15].蛋白融合技術通過基因工程手段將多個酶用短肽序列連接構成融合蛋白，通過調(diào)整連接肽特性和酶的連接方向控制酶的空間定位〔圖1A〕，優(yōu)化級聯(lián)催化經(jīng)過中底物和能量傳遞[20].蛋白錨定支架技術通過調(diào)整支架上的錨定位點距離、各種錨定位點的數(shù)量和連接肽特性3種方式調(diào)整酶的空間定位和比例〔圖1B〕，可降低代謝網(wǎng)絡對目的途徑的影響，提高目的途徑底物和輔因子的局部濃度，減少與環(huán)境的互相影響[21].兩種空間正交氧化復原體系構建策略都遭到連接肽特性的影響，由于連接肽及蛋白構造和功能的多樣性，需要通過挑選確定適宜的連接肽柔性和長度，優(yōu)化酶的空間定位[2,22].連接肽通常使用柔性序列GGGGS〔G4S〕[23~26],通過調(diào)整其拷貝數(shù)改變連接肽長度，但有時利用剛性氨基酸延長連接肽效果更好，如將惡臭假單胞菌〔Pseudomonasputida〕細胞色素P450〔P450cam〕、假單胞氧還蛋白〔putidaredoxin,PdX〕和假單胞氧還蛋白復原酶〔putidaredoxinreductase,PdR〕分別與硫磺礦硫化葉菌〔Sulfolobussolfataricus〕的增殖細胞核抗原〔proliferatingcellnuclearantigen,PCNA〕融合時，比擬兩組連接肽G4S-〔P5〕n-G4S〔n=1~5〕和〔G4S〕n〔n=1~6〕效果，以G4S-〔P5〕4-G4S連接時活性最高〔〔6.50.3〕mol/〔Lmin〕〕，而〔G4S〕n〔n=1~6〕最高活性〔G4S〕5約為5mol/〔Lmin〕[22].相比于柔性，調(diào)節(jié)連接肽長度效果通常更顯著，上述實例中最適連接肽長度對應活性比n=1時提高兩倍。長度選擇也是最常見的連接肽優(yōu)化方式。在P450單加氧酶CinA的C-末端融合黃素氧還蛋白CinC,催化桉樹醇轉化為2-羥基-桉樹醇，發(fā)現(xiàn)當連接肽長度為10個氨基酸時產(chǎn)量最高，少于4個氨基酸時檢測不到催化活性[2].除了連接肽特性，空間正交氧化復原體系構建還需要綜合優(yōu)化多種因素以在提高體系獨立性的同時獲得更好的催化活性。構建融合蛋白要考慮融合方向對催化效率的影響.將丙酮丁醇梭菌〔Clostridiumacetobutylicum〕來源的氫酶〔hydrogenase,H2ase〕融合鐵氧還蛋白〔ferredoxin,FD〕促進產(chǎn)氫時，用2個氨基酸殘基連接時，F(xiàn)D連在H2ase的C-末端對產(chǎn)氫經(jīng)過無促進作用，而連在N-末端氫氣產(chǎn)量提高約3倍[26].這是由于H2ase與FD作用位點在氫酶N-末端，N-末端融合更利于兩個蛋白互相作用。這種融合蛋白組合的催化效率也受連接肽長度的影響，以14個氨基酸殘基連接效果最好，產(chǎn)氫效率提高近5倍，延長至46個氨基酸殘基幾乎沒有促進作用[26].與蛋白融合技術相比蛋白錨定支架技術可更自若地設計酶的空間分布和計量關系[27,28].仍以上述H2ase與FD生物轉化產(chǎn)氫途徑為例：將真核信號轉導相關的PDZ〔postsynapticdensityproteinof95kilodaltons,disclarge,zonaoccludens-1〕，SH3〔sarcomahomology3〕和GBD〔gelatinbindingdomain〕3種構造域整合到支架蛋白上，通過配體肽段將催化生物合成的酶特異性結合到支架蛋白的對應位置，這種設計能夠通過調(diào)整H2ase和FD在支架上的結合位置、酶與支架配體間連接肽的長度、結合域數(shù)量等調(diào)整酶的空間分布與比例[26].結合域在支架上間距靠近時產(chǎn)氫效率高；結合域相對位置一樣，F(xiàn)D與支架蛋配體白的連接肽長度分別為10,20,40個氨基酸時，延長肽鏈長度可使氫氣產(chǎn)量提高3~5倍；通過調(diào)整支架蛋白上的PDZ,SH3和GBD結合域比例調(diào)整FD:H2ase比率，比率越小產(chǎn)氫效率越高[26].除了蛋白，DNA,RNA等大分子可以作為蛋白錨定支架[20,29,30],并且隨著DNA合成技術發(fā)展及對DNA,RNA構造預測能力的提高，基于核酸的支架遭到更多重視。利用DNA整合NAD〔P〕H:黃素單核苷酸〔flavinmononucleotide,FMN〕氧化復原酶和熒光素酶，復原力NADH經(jīng)過NAD〔P〕H:FMN氧化復原酶傳遞給FMN,然后傳遞給熒光素酶，與分別連在兩條不同DNA鏈上的游離狀態(tài)相比，連在同一DNA鏈上時活性提高到2~3倍[31].支架能夠是單個分子，可以以是可自組裝的蛋白亞基。如將前述P450cam,PdX,PdR和亞磷酸脫氫酶分別與PCNA