專題三核酸電泳技術(shù)課件

專題二核酸電泳技術(shù)瓊脂糖或聚丙烯酰胺凝膠電泳是分子克隆的核心技術(shù)之一，它用于分離、鑒定和純化DNA片段。該技術(shù)操作簡(jiǎn)單而迅速，并且能分離用其他方法如密度梯度離心等不能滿意分離的DNA片段。此外，凝膠中DNA的位置可以用低濃度熒光插入染料如溴化乙錠或SYBRGold染色直接觀察到，甚至含量少至20pg的雙鏈DNA在紫外線激發(fā)下也能直接檢測(cè)到。需要的話，這些分離的DNA條帶可以從凝膠中回收，用于各種各樣的目的。瓊脂糖凝膠的分離范圍很大。50bp到百萬(wàn)bp長(zhǎng)的DNA都可以在不同濃度和構(gòu)型的瓊脂糖凝膠中分離。小片段DNA(50～20000bp)最適合在恒定強(qiáng)度和方向的電場(chǎng)中水平方位的瓊脂糖凝膠內(nèi)電泳分離。在這些條件下，DNA泳動(dòng)速率通常隨DNA片段長(zhǎng)度的增加而減少，但與電場(chǎng)強(qiáng)度成正比。然而這一簡(jiǎn)明的相關(guān)性當(dāng)DNA片段長(zhǎng)度超過(guò)一個(gè)最大極限值時(shí)立即被破壞，這種情況主要是由于凝膠的構(gòu)成和電場(chǎng)強(qiáng)度決定的。當(dāng)線狀雙螺旋DNA的半徑超過(guò)凝膠的孔徑時(shí)就達(dá)到它分辨率的極限。此時(shí)，DNA不再被凝膠按其大小篩分，而必須以一端在前的方式在介質(zhì)中遷移，就像通過(guò)曲折而又空間有限的管子。這種遷移模式稱作“蠕行”。決定DNA在瓊脂糖凝膠中遷移速率的因素DNA分子的大小

雙鏈DNA分子在凝膠基質(zhì)遷移的速率與其堿基對(duì)數(shù)的常用對(duì)數(shù)成反比。分子越大，遷移得越慢，因?yàn)槟Σ磷枇υ酱?，也因?yàn)榇蠓肿油ㄟ^(guò)凝膠孔徑的效率低于較小的分子。瓊脂糖濃度

給定大小的線狀DNA片段在不同濃度的瓊脂糖凝膠中遷移速率不同。在DNA電泳遷移率的對(duì)數(shù)和凝膠濃度之間存在線狀相關(guān)。

DNA的構(gòu)象

超螺旋環(huán)狀(I型)、切口環(huán)狀(Ⅱ型)和線狀(Ⅲ型)DNA在瓊脂糖凝膠中以不同速率遷移。上述三種類型的相對(duì)遷移率主要取決于瓊脂糖凝膠的濃度和類型，但是電流強(qiáng)度、緩沖液離子強(qiáng)度和I型超螺旋絞緊的程度或密度也影響相對(duì)遷移率。在一些條件下，I型DNA比Ⅲ型遷移得更快；在另一些條件下，順序可能顛倒。絕大多數(shù)情況下，區(qū)分不同構(gòu)象DNA的需求都很簡(jiǎn)單，主要是區(qū)分未處理的環(huán)狀DNA樣品和單一位點(diǎn)經(jīng)限制酶作用線狀化的同一DNA樣品。凝膠和電泳緩沖液中的溴化乙錠

溴化乙錠插入雙鏈DNA造成其負(fù)電荷減少、剛性和長(zhǎng)度增加。因此線狀DNA-染料復(fù)合物在凝膠中的遷移率約降低15％。所用的電壓

低電壓下DNA片段遷移率與所用的電壓成正比。電場(chǎng)強(qiáng)度升高時(shí)，高分子質(zhì)量片段的遷移率遂不成比例的增加。所以，當(dāng)電壓增大時(shí)瓊脂糖凝膠分離的有效范圍反而減小。要獲得大于2kbDNA片段的良好分辨率，則所用電壓不應(yīng)高于5～8V／cm。電泳緩沖液

DNA的泳動(dòng)受電泳緩沖液的組成和離子強(qiáng)度的影響。缺乏離子(如用水替代電泳槽及凝膠中的緩沖液)則電導(dǎo)率降至很低，DNA不是全然不動(dòng)，就是遷移極慢。高離子強(qiáng)度時(shí)，如錯(cuò)用了10×電泳緩沖液，電導(dǎo)率升高，即使應(yīng)用適中的電壓也會(huì)產(chǎn)生大量的熱能。最嚴(yán)重時(shí)凝膠會(huì)熔化，DNA會(huì)變性。瓊脂糖標(biāo)準(zhǔn)(高熔點(diǎn))瓊脂糖

制造它的原料是兩種海藻，Gelidium和Gracilaria。這兩種瓊脂糖的凝點(diǎn)和熔點(diǎn)有所不同，但是在實(shí)際應(yīng)用中每種來(lái)源的瓊脂糖都可以用于分析或分離1-25kb范圍的DNA片段。新類型的標(biāo)準(zhǔn)瓊脂糖具有高凝膠強(qiáng)度和低電內(nèi)滲(EEO)，可以灌制濃度低至0.3％的凝膠。這種凝膠用于電泳能方便地分離高分子質(zhì)量DNA(直到60kb)。它在任何濃度下DNA遷移速度均比通用的標(biāo)準(zhǔn)瓊脂糖快10％-20％。這一增加在百萬(wàn)堿基大小DNA的PFGE中將明顯地節(jié)省時(shí)間。低熔點(diǎn)／凝點(diǎn)瓊脂糖

通過(guò)羥乙基化修飾的瓊脂糖在較低的溫度熔化，羥乙基化替代的程度決定準(zhǔn)確的熔化和凝結(jié)溫度。低熔點(diǎn)／凝點(diǎn)瓊脂糖主要用于DNA的快速回收，因?yàn)榇蠖鄶?shù)該類型瓊脂糖在65℃熔化，這個(gè)溫度遠(yuǎn)低于雙鏈DNA的解鏈溫度。這種特性使它還可以用于DNA的簡(jiǎn)單純化和酶處理；在熔化的凝膠中用核酸直接進(jìn)行細(xì)菌轉(zhuǎn)化。化學(xué)修飾的瓊脂糖比等濃度的標(biāo)準(zhǔn)瓊脂糖有更高的篩分能力。該發(fā)現(xiàn)使瓊脂糖的分辨力接近聚丙烯酰胺凝膠，因此可用于PCR產(chǎn)物、小片段DNA和小RNA(<lkb)的分離?，F(xiàn)在它能分辨少至4bp的DNA和分離200-800bp范圍內(nèi)相差2％的DNA片段。電泳緩沖液電泳緩沖液載樣緩沖液有三個(gè)作用：增加樣品密度以保證DNA沉入加樣孔內(nèi)；使樣品帶有顏色便于簡(jiǎn)化上樣過(guò)程；其中的染料在電場(chǎng)中以可以預(yù)測(cè)的泳動(dòng)速率向陽(yáng)極遷移。溴酚藍(lán)在瓊脂糖凝膠中遷移速率是二甲苯氰FF的2.2倍，這一特性與瓊脂糖濃度無(wú)關(guān)。在0.5×TBE瓊脂糖凝膠電泳中溴酚藍(lán)遷移速率約與長(zhǎng)300bp的線狀雙鏈DNA相同，而二甲苯氰FF約與長(zhǎng)4000bp的DNA相同。上述關(guān)系在濃度范圍0.5％～1.4％的瓊脂糖凝膠中基本不受濃度變化的影響。用哪種載樣緩沖液是個(gè)人的習(xí)慣。DNA大小標(biāo)準(zhǔn)品通常使用已知分子質(zhì)量的DNA樣品，它們是經(jīng)限制性酶消化已知序列的質(zhì)?；蚴删wDNA獲得的。瓊脂糖和聚丙烯酰胺凝膠電泳用的分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)可以從市場(chǎng)購(gòu)得，或者實(shí)驗(yàn)室自己制備。一般最好有兩套分子質(zhì)量范圍的標(biāo)準(zhǔn)，一個(gè)是1kb到大于20kb的高分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，一個(gè)是100-1000bp的低分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)貯備液用凝膠載樣緩沖液稀釋后用于每次電泳實(shí)驗(yàn)。溴化乙錠溴化乙錠首先于20世紀(jì)50年代合成成功，主要是作為一種有效的殺錐蟲制劑而發(fā)展起來(lái)的菲啶化合物。溴化乙錠在篩選過(guò)程中脫穎而出。它的殺錐蟲效能是其母化合物的10～50倍，并對(duì)小鼠無(wú)毒，且與早期的菲啶化合物不同，對(duì)牛不具有光致敏作用。直到最近，溴化乙錠在熱帶及亞熱帶國(guó)家仍被廣泛應(yīng)用于牛錐蟲病的治療和預(yù)防。溴化乙錠平面基團(tuán)的固定位置以及它與堿基的高度臨近使被結(jié)合的染料所產(chǎn)生的熒光與在自由溶液狀態(tài)的染料相比增強(qiáng)20～25倍。254nm的紫外線首先被DNA吸收，然后被傳送到染料；而302nm以及366nm的射線直接被染料自行吸收。這些被吸收的能量將在590nm的橙紅色可見光譜區(qū)以0.3的量子產(chǎn)額被重新釋放出來(lái)。大部分商品化的紫外線光源產(chǎn)生302nm的紫外線。溴化乙錠-DNA復(fù)合物在受到紫外線照射激發(fā)所產(chǎn)生的熒光，在302nm的紫外線下明顯要比366nm的要強(qiáng)，但要比短波紫外線(254nm)的稍弱。然而，302nm紫外線所造成染料的光褪色效應(yīng)以及造成DNA的斷裂和缺口明顯要較254nm紫外線少得多。凝膠中DNA的染色溴化乙錠被廣泛地用于瓊脂糖凝膠中DNA片段的定位，通常將它以0.5μg/ml的濃度被加入到膠中以及電泳緩沖液中。盡管加入溴化乙錠會(huì)導(dǎo)致線性雙鏈DNA的電泳遷移率減慢～15％，但卻可在紫外燈下直接檢查凝膠。由于溴化乙錠-DNA復(fù)合物的熒光強(qiáng)度要比未結(jié)合的染料強(qiáng)很多，少量的DNA(～10ng／條帶)也能從存在游離狀態(tài)溴化乙錠的凝膠中被檢測(cè)出來(lái)。當(dāng)需要知道DNA片段的準(zhǔn)確大小(如DNA限制酶酶切圖譜的鑒定)，凝膠應(yīng)該在無(wú)EB情況下電泳，電泳結(jié)束后用EB染色。染色時(shí)，將凝膠浸入含有EB(0.5μg/ml)的電泳緩沖液中，室溫下染色30～45min。染色完畢后，通常不需要脫色。但是在檢測(cè)小量DNA(<10ng)片段時(shí)，通常要將染色后的凝膠浸入水中或1mmol/LMgSO4中，室溫脫色20min更易觀察到。雙鏈DNA的定量分析一種快捷和靈敏的方法是應(yīng)用溴化乙錠分子的插入可通過(guò)紫外線照射產(chǎn)生熒光。由于熒光的亮度與DNA的含量成相關(guān)，DNA的含量可通過(guò)樣品在590nm處的光量度與一系列標(biāo)準(zhǔn)品的對(duì)照來(lái)估算。瓊脂糖凝膠電泳的程序準(zhǔn)備好制膠用的模具，置于水平支架或臺(tái)面上。配制足量的電泳緩沖液(1×TAE或0.5×TBE)用以灌滿電泳槽和配制凝膠

配膠和灌滿電泳槽使用同一批緩沖液很重要。因?yàn)殡x子強(qiáng)度或pH很小的差別也會(huì)在凝膠前部產(chǎn)生紊亂，嚴(yán)重影響DNA片段的泳動(dòng)。根據(jù)欲分離DNA片段大小用電泳緩沖液配制適宜濃度瓊脂糖溶液：應(yīng)準(zhǔn)確稱量瓊脂糖干粉加到盛有定好量的電泳緩沖液的三角燒瓶或玻璃瓶中。在沸水浴或微波爐內(nèi)加熱至瓊脂糖熔化。

警惕：微波爐加熱過(guò)長(zhǎng)，瓊脂糖溶液會(huì)變得過(guò)熱或劇烈沸騰。

僅加熱所有瓊脂糖顆粒完全溶解需要的最短時(shí)間。通常未溶解的瓊脂糖呈小透明體或半透明碎片懸浮在溶液中。溶解較高濃度的瓊脂糖需要較長(zhǎng)的加熱時(shí)間。要查看煮沸后是否由于蒸發(fā)而溶液體積減少，如有必要用水恢復(fù)原體積。用隔離手套或夾子轉(zhuǎn)移三角燒瓶或玻璃瓶到55℃水浴。待熔化的凝膠稍冷卻后加入溴化乙錠，終濃度為0.5μg/ml。輕輕地旋轉(zhuǎn)以充分混勻凝膠溶液。瓊脂糖溶液正在冷卻時(shí)，用一個(gè)合適的梳子形成加樣孔。梳齒的位置應(yīng)在托盤底面上0.5～1.0mm，這樣瓊脂糖澆灌到托盤時(shí)將形成符合要求的加樣孔。

多數(shù)凝膠托盤都有適宜放梳子的側(cè)壁或外側(cè)支架。如果沒有或不合適，梳齒可能會(huì)太接近托盤底面，在拔出梳子時(shí)易穿透加樣孔的底部。樣品液將從凝膠和加樣孔之間泄漏。應(yīng)用低濃度瓊脂糖(<0.6％)或低凝點(diǎn)瓊脂糖時(shí)這種問(wèn)題尤其容易發(fā)生。澆灌溫?zé)岬沫傊侨芤哼M(jìn)入模具。

凝膠適宜厚度為3-5mm。需檢查在梳齒下或梳齒間應(yīng)無(wú)氣泡。用微量移液器及一次性吸頭，將樣品混合液緩慢加至浸沒凝膠的加樣孔內(nèi)。分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)分別加至樣品孔的左側(cè)和右側(cè)的兩個(gè)孔內(nèi)。關(guān)上電泳槽蓋，接好電極插頭。DNA應(yīng)向陽(yáng)極(紅色插頭)側(cè)泳動(dòng)。給予1～5V/cm的電壓，其中距離以陽(yáng)極至陰極之間的測(cè)量為準(zhǔn)。

如電極插頭連接正確，陽(yáng)極和陰極由于電解作用將產(chǎn)生氣泡，并且?guī)追昼妰?nèi)溴酚藍(lán)從加樣孔遷移進(jìn)入膠