枯草桿菌生物興趣小組

枯草桿菌生物興趣小組第1頁，共37頁，2023年，2月20日，星期五目錄1、認識枯草桿菌2、革蘭氏染色法3、枯草桿菌的培養(yǎng)4、枯草桿菌的培養(yǎng)第2頁，共37頁，2023年，2月20日，星期五認識枯草桿菌第3頁，共37頁，2023年，2月20日，星期五枯草芽孢桿菌

（枯草桿菌一般指枯草芽孢桿菌）枯草芽孢桿菌，是芽孢桿菌屬的一種。單個細胞0.7～0.8×2～3微米，著色均勻。無莢膜，周生鞭毛，能運動。革蘭氏陽性菌，芽孢0.6～0.9×1.0～1.5微米，橢圓到柱狀，位于菌體中央或稍偏，芽孢形成后菌體不膨大。菌落表面粗糙不透明，污白色或微黃色，在液體培養(yǎng)基中生長時，常形成皺醭。需氧菌?？衫玫鞍踪|(zhì)、多種糖及淀粉，分解色氨酸形成吲哚。在遺傳學研究中應用廣泛，對此菌的嘌呤核苷酸的合成途徑與其調(diào)節(jié)機制研究較清楚。廣泛分布在土壤及腐敗的有機物中，易在枯草浸汁中繁殖，故名。第4頁，共37頁，2023年，2月20日，星期五水上形態(tài)在枯草桿菌豐富的水體里，水的表面張力比較大，可以在吹出來的泡泡的小圈上形成一層膜。第5頁，共37頁，2023年，2月20日，星期五枯草桿菌培養(yǎng)基電鏡圖片形態(tài)特征第6頁，共37頁，2023年，2月20日，星期五革蘭氏染色法第7頁，共37頁，2023年，2月20日，星期五細菌介紹芽孢具有厚而致密的壁，透性差，含水量低，折光性強，不易著色。在加熱條件下加入著色力強的染料，讓芽孢、菌體與染料作用較長時間，使芽孢染上顏色，再使菌體的顏色脫去；然后再用另一種與前者顏色不同的對比度強的染料對菌體復染，使芽孢和菌體分別呈現(xiàn)出不同的顏色，因而能更明顯地襯托出芽孢，以便觀察。莢膜是一層覆蓋在某些細菌細胞壁表面的粘性物質(zhì)，主要成分是多糖類。莢膜與染料的親合力較差，不易著色。莢膜的通透性好，某些染料可透過莢膜而使菌體著色。因此，常采用負染色法將菌體和背景著色而莢膜不著色，因而莢膜在菌體周圍呈一透明無色圈。細菌鞭毛非常纖細，直徑10-20nm，只能在電子顯微鏡下才能觀察到。但采用特殊的染色法在光學顯微鏡下也能見到。其原理是：在染色前先用媒染劑處理，使媒染劑沉積在鞭毛上，將鞭毛加粗，然后再進行染色，便能在油鏡下看見鞭毛的形狀和著生方式。

第8頁，共37頁，2023年，2月20日，星期五原理第9頁，共37頁，2023年，2月20日，星期五第10頁，共37頁，2023年，2月20日，星期五基本原理革蘭氏染色法是一種鑒別性的染色方法。結(jié)果細胞保留初染劑籃紫色的細菌為革蘭氏陽性菌；如果細胞為復染劑的顏色（紅色），則為革蘭氏陰性菌。其機理是由于細菌細胞壁的化學組成及結(jié)構(gòu)不同和通透性不同的緣故。細菌的革蘭氏染色受菌齡、培養(yǎng)基pH值和染色技術(shù)等因素的影響，并非固定不變。第11頁，共37頁，2023年，2月20日，星期五三、器具材料

1.器材：顯微鏡、擦鏡紙、二甲苯、香柏油、接種環(huán)、酒精燈、火柴、吸水紙、載破片、蓋玻片。2.染色液及試劑:結(jié)晶紫染色液、路戈氏碘液、95%的酒精、番紅染色液、蒸餾水。

堿性復紅染色液、5%孔雀綠染色液。3.菌種；培養(yǎng)18小時至20小時的枯草芽孢桿菌、蘇云金桿菌、大腸桿菌的新鮮斜面菌種。培養(yǎng)24小時至36小時的枯草桿菌或蘇云金桿菌、巨大芽孢桿菌。第12頁，共37頁，2023年，2月20日，星期五細菌先經(jīng)堿性染料結(jié)晶染色，而經(jīng)碘液媒染,在媒染處理時，媒染劑與染料形成不溶性化合物，可增加染料和細菌的親和力。第13頁，共37頁，2023年，2月20日，星期五實驗過程1、

取載玻片用紗布擦干，載玻片的一面用marker筆畫一個小圈（用來大致確定菌液滴的位置）。涂菌的部位在火焰上烤一下，除去油脂。

2、

涂片：

液體培養(yǎng)基：左手持菌液試管，在酒精燈火焰附近5cm左右打開管蓋；右手持接種環(huán)在火焰中燒灼滅菌，等冷卻后從試管中沾取菌液一環(huán)，在潔凈無脂的載玻片上涂直徑2mm左右的涂膜，最后將接種環(huán)在火焰上燒灼滅菌。

固體培養(yǎng)基：先在載玻片上滴一滴無菌水，再用接種環(huán)取少量菌體，涂在載玻片上，使其薄而均勻。

3、

晾干：讓涂片在空氣中自然干燥。

4、

固定：讓菌膜朝上，通過火焰2-3次固定（以不燙手為宜）。5、

染色：將固定過的涂片放報紙上，滴加草酸銨結(jié)晶紫液，染1min。

6、

水洗：用水緩慢沖洗涂片上的染色液，用吸水紙吸干。簡單染色結(jié)束可觀察細胞形態(tài)。

8、

脫色：吸去殘留水，連續(xù)滴加95%乙醇脫色20-30s至流出液無紫色，立即水洗。

9、

復染：滴加蕃紅復染3-5min，水洗。至此，革蘭氏染色結(jié)束。

第14頁，共37頁，2023年，2月20日，星期五觀察莢膜和鞭毛標本片周生莢膜一端生一束第15頁，共37頁，2023年，2月20日，星期五枯草桿菌繁殖第16頁，共37頁，2023年，2月20日，星期五1.1培養(yǎng)基

牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基：5g牛肉膏，10g蛋白胨，5gNaCl，1000mL蒸餾水，pH7.2—7.5。牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基：5g牛肉膏，10g蛋白胨，5gNaCl，20g瓊脂,1000mL蒸餾水，pH7.2—7.5。1號培養(yǎng)基：3g木屑,0.4g葡萄糖,0.2g蛋白胨,0.2g酵母膏,0.2gCaCO3,0.1gKH2PO4,16mL水。2號培養(yǎng)基：3g稻草,0.4g葡萄糖,0.2g蛋白胨,0.2g酵母膏,0.2gCaCO3,0.1gKH2PO4,16mL水。3號培養(yǎng)基：3g玉米芯,0.4g葡萄糖,0.2g蛋白胨,0.2g酵母膏,0.2gCaCO3,0.1gKH2PO4,16mL水。4號培養(yǎng)基：3g糠殼,0.4g葡萄糖,0.2g蛋白胨,0.2g酵母膏,0.2gCaCO3,0.1gKH2PO4,16mL水。第17頁，共37頁，2023年，2月20日，星期五為了更好地探究枯草桿菌繁殖的適宜條件，對培養(yǎng)基進行優(yōu)化：1.2培養(yǎng)基的優(yōu)化1.2.1培養(yǎng)方法1.2.2檢測方法1.2.3含水量對枯草芽孢桿菌生長的影響1.2.4稻草粗細程度對枯草芽孢桿菌生長的影響1.2.5氮源對枯草芽孢桿菌生長的影響1.2.6碳源對枯草芽孢桿菌生長的影響1.2.7碳氮比對枯草芽孢桿菌生長的影響1.2.8pH對枯草芽孢桿菌生長的影響第18頁，共37頁，2023年，2月20日，星期五1.2.1培養(yǎng)方法先用接種環(huán)接種1環(huán)試管菌種到牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，200r/min，37℃培養(yǎng)24h，進行擴大培養(yǎng)和活化，然后再取1mL液體種接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)48h。第19頁，共37頁，2023年，2月20日，星期五1.2.2檢測方法活菌的檢測方法：稱量大概5g發(fā)酵48h后的培養(yǎng)基溶解在50mL無菌水中,200r/min，20min搖散得10，再用5mL無菌吸管吸取5mL到45mL無菌水中，搖勻得10，依次這樣稀釋到一個適當?shù)南♂尪龋?.1mL稀釋液到無菌牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基中并涂勻，37℃培養(yǎng)24h，然后數(shù)培養(yǎng)皿上的菌落數(shù)[7]。芽孢率的檢測方法：稱量大概5g發(fā)酵48h后的培養(yǎng)基溶解在50mL無菌水中,200r/min，20min搖散得10，再用5mL無菌吸管吸取5mL到45mL無菌水中，搖勻得10，依次這樣稀釋到10，取0.02mL滴到載玻片上，涂勻，用酒精燈烘干，然后用酚酞染色1min，用清水沖洗，再用酒精燈烘干，鏡檢，找?guī)讉€清晰的畫面，數(shù)畫面中的芽孢數(shù)和桿數(shù)，取其平均值，即可得到其芽孢率。第20頁，共37頁，2023年，2月20日，星期五1.2.3含水量對枯草芽孢桿菌生長的影響麥麩與稻草的比例確定以后，即可得其含水量為67%，分別以75%，71%，63%，59%，55%代替其含水量作為發(fā)酵培養(yǎng)基，在其它成分和條件不變的情況下培養(yǎng)48h，檢測各處理后的活菌數(shù)和芽孢率，計算得其單位質(zhì)量的干重的發(fā)酵培養(yǎng)基的芽孢數(shù)，以確定最佳的含水量。1.2.4稻草粗細程度對枯草芽孢桿菌生長的影響分別以稻草粗細程度為<0.5mm,0.5～1.0mm,1.0～1.5mm,>1.5mm,混合樣作為發(fā)酵培養(yǎng)基，其它組分不變，相同發(fā)酵條件下培養(yǎng)48h,檢測各的活菌數(shù)和芽孢率，以確定稻草的最佳粗細程度。1.2.5氮源對枯草芽孢桿菌生長的影響在相等的N含量的條件下，分別用蛋白胨，酵母膏，豆餅粉，尿素，（NH）SO及不同組合作為N源，其它成分不變，相同條件下培養(yǎng)48h,檢測活菌數(shù)和芽孢率，以確定最佳N源。第21頁，共37頁，2023年，2月20日，星期五1.2.5碳源對枯草芽孢桿菌生長的影響確定N源后，在保持C含量不變的情況下，分別用葡萄糖，蔗糖，玉米粉，玉米淀粉，大米粉作為C源制作發(fā)酵培養(yǎng)基，其它組分不變，相同條件下培養(yǎng)48h，測定活菌數(shù)和芽孢率，確定最佳C源。1.2.7碳氮比對枯草芽孢桿菌生長的影響確定好碳源和氮源之后，改變碳源和氮源的比例，分別采用0:1,1:3，1:2，1:1，2:1，3:1，4:1，5:1，7:1,1:0的C/N比(原料質(zhì)量比)配制發(fā)酵培養(yǎng)基，其它成分不變，在相同的條件下培養(yǎng)48h，檢測發(fā)酵料中和活菌數(shù)和芽孢率，以確定最佳的C/N比。1.2.8pH對枯草芽孢桿菌生長的影響改變發(fā)酵培養(yǎng)基中的pH值，分別以pH值為5.5，6.0，6.5，7.0，7.5，8.0，8.5作為發(fā)酵培養(yǎng)基，其它成分不變，在相同的發(fā)酵條件下培養(yǎng)48h，檢測活菌數(shù)和芽孢率，得最佳pH。第22頁，共37頁，2023年，2月20日，星期五枯草桿菌的應用第23頁，共37頁，2023年，2月20日，星期五……在生活中的應用第24頁，共37頁，2023年，2月20日，星期五1.枯草芽孢桿菌菌體生長過程中產(chǎn)生的枯草菌素、多粘菌素、制霉菌素、短桿菌肽等活性物質(zhì)，這些活性物質(zhì)對致病菌或內(nèi)源性感染的條件致病菌有明顯的抑制作用

第25頁，共37頁，2023年，2月20日，星期五枯草芽孢桿菌在生物防治領域中的應用枯草芽孢桿菌作為植物病害生防細菌之一，具有較強的防病作用。美國用枯草芽孢桿菌QST713菌株開發(fā)出活菌制劑殺菌劑SerenadeTM，用于防治多種作物的白粉病、霜露病、疫病、灰霉病等病害，用于防治葉部病害(灰霉病、白粉病)和根部病害(枯萎病、根腐病、黑斑病等)，用于防治番茄晚疫病、灰霉病和小麥白粉病，還可作為增產(chǎn)促進劑。澳大利亞開發(fā)的B.subtilisA-B對麥類和胡蘿卜立枯病等具有很好的防治和增產(chǎn)作用。第26頁，共37頁，2023年，2月20日，星期五2.枯草芽孢桿菌迅速消耗環(huán)境中的游離氧，造成腸道低氧，促進有益厭氧菌生長，并產(chǎn)生乳酸等有機酸類，降低腸道PH值，間接抑制其它致病菌生長第27頁，共37頁，2023年，2月20日，星期五研究證明，枯草芽孢桿菌的活菌制劑可以作為口服液用于治療腸炎、支氣管炎和腹瀉等多種疾病，也用來預防和治療燒傷面的感染。最近，科學家發(fā)現(xiàn)從枯草芽孢桿菌提取到的淀粉酶、纖維素酶能夠補充體內(nèi)消化酶的不足，恢復正常消化機能；蛋白酶能夠分解發(fā)炎部位纖維蛋白的凝結(jié)物，消除傷口周圍的壞疽、腐肉和碎屑。日本人日常生活中食用的納豆就是利用枯草芽孢桿菌生產(chǎn)的，研究表明，納豆中含有的溶栓酶(納豆激酶)對心血管疾病有很好的預防和治療作用；而同樣由枯草芽孢桿菌合成的聚谷氨酸可用作藥物緩釋材料和醫(yī)用高分子纖維材料等。第28頁，共37頁，2023年，2月20日，星期五英文名稱：CombinedBacillusSubtilisandEnterococcusFaeciumGranuleswithMultivitamines，Live是否處方藥：非處方藥劑型：顆粒藥品類型：生物制品通用名稱：枯草桿菌二聯(lián)活菌顆粒化學成分：每袋(1克)含活菌凍干粉37.5毫克,內(nèi)有活菌1.5億個。含有兩種活菌—枯草桿菌和腸球菌，可直接補充正常生理菌叢，抑制致病菌，促進營養(yǎng)物質(zhì)的消化、吸收，抑制腸源性毒素的產(chǎn)生和吸收，達到調(diào)整腸道內(nèi)菌群失調(diào)的目的。本品還有嬰幼兒生長發(fā)育所必須的多種維生素、微量元素及礦物質(zhì)鈣，可補充因消化不良或腹瀉所致的缺乏。藥理作用第29頁，共37頁，2023年，2月20日，星期五3.刺激動物免疫器官的生長發(fā)育，激活T、B淋巴細胞，提高免疫球蛋白和抗體水平，增強細胞免疫和體液免疫功能，提高群體免疫力第30頁，共37頁，2023年，2月20日，星期五4．枯草芽孢桿菌菌體自身合成α-淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、纖維素酶等酶類，在消化道中與動物體內(nèi)的消化酶類一同發(fā)揮作用。第31頁，共37頁，2023年，2月20日，星期五枯草芽孢桿菌在工業(yè)酶生產(chǎn)中的應用枯草芽孢桿菌生境多樣，可利用的營養(yǎng)物質(zhì)種類十分豐富，這決定了其自身含有豐富的產(chǎn)酶系統(tǒng)，具備生產(chǎn)多種酶的應用潛力。研究資料表明，枯草芽孢桿菌能夠產(chǎn)生蛋白酶、淀粉酶、纖維素酶、葡聚糖酶、植酸酶、果膠酶和木聚糖酶等十幾種酶。在過去的10年，利用基因工程技術(shù)，枯草芽孢桿菌幾乎可以在短期內(nèi)大量生產(chǎn)任何種源的新酶，從而省略了大量的原始菌種改造、馴化、毒理學實驗等工作；利用蛋白質(zhì)工程技術(shù)，能夠在生產(chǎn)新酶之前對該酶的性質(zhì)進行改良和調(diào)整，從而改善酶的活性或者賦予酶新的所需性質(zhì)。這些新技術(shù)的應用使新酶種的開發(fā)周期大大縮短，難度和成本降低，產(chǎn)品更加穩(wěn)定有效。第32頁，共37頁，2023年，2月20日，星期五5．能合成維生素B1、B2、B6、煙酸等多種B族維生素，提高動物體內(nèi)干擾素和巨噬細胞的活性。第33頁，共37頁，2023年，2月20日，星期五What'smore第34頁，共37頁，2023年，2月20日，星期五

枯草芽孢桿菌在水產(chǎn)養(yǎng)殖領域中的應用枯草芽孢桿菌在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應用起步較晚，由于它能分泌蛋白酶等多種酶類和抗生素，使池底積累的大量殘余餌料、排泄廢物、動植物殘體以及有害氣體(氨、硫化氫等)，使之先分解為小分子(多肽、高級脂肪酸等)，后分解為更小分子的有機物(氨基酸、低級脂肪酸、單糖、環(huán)烴等)，最終分解為二氧化碳、硝酸鹽和硫酸鹽等，從而有效地改善水質(zhì)，同時還能為以單細胞藻類為主的浮游植物提供營養(yǎng)物質(zhì)