植物組織培養(yǎng)基本技術(shù)

植物組織培養(yǎng)基本技術(shù)第1頁，共35頁，2023年，2月20日，星期五第一節(jié)培養(yǎng)基及其配制一、培養(yǎng)基成分培養(yǎng)基：供植物材料生長的人工配制的基質(zhì)。（一）水分：母液及培養(yǎng)基配制時，要用蒸餾水，但大規(guī)模生產(chǎn)時，可用自來水代替。（二）無機(jī)元素：根據(jù)植物需要量的多少，可分為：大量元素和微量元素。第2頁，共35頁，2023年，2月20日，星期五1.大量元素：指濃度大于0.5mmol／L的元素，包括：N、P、K、Ca、Mg、S等。N：在制備培養(yǎng)基時以NO3-N和NH4-N兩種形式供應(yīng)。常用含N物質(zhì)有KNO3、NH4NO3、(NH4)2SO4P：常用的物質(zhì)有KH2P04或NaH2P04等。K：常用的物質(zhì)有KCI、KN03、KH2P04Ca、Mg、S：

MgSO4·7H20、CaCl2·2H2O第3頁，共35頁，2023年，2月20日，星期五2、微量元素：指小于0.5mmol／L的元素，包括Fe，B，Mn，Cu，Zn，Mo，Co等。Fe：常用FeSO4·7H20，因其在pH值5.2以上，易形成Fe(OH)3的不溶性沉淀，通常FeSO4·7H20和Na2—EDTA結(jié)合成絡(luò)合物使用。B：H3BO3Mn，Cu，Zn：常用其硫酸鹽；Mo：Na2MoO4Co:CoCl2第4頁，共35頁，2023年，2月20日，星期五（三）有機(jī)營養(yǎng)物質(zhì)：

培養(yǎng)基中若只含有大量元素與微量元素，常稱為基本培養(yǎng)基（basicmedium)。為不同的培養(yǎng)目的往往要加入一些有機(jī)物以利于快速生長。常加入的有機(jī)成分主要有以下幾類：第5頁，共35頁，2023年，2月20日，星期五1、碳水化合物——碳源：可作為碳源的有蔗糖，葡萄糖和果糖最常用的碳源是蔗糖，蔗糖使用濃度在2%—5%，常用3%（30g/L），即配制一升培養(yǎng)基稱取30g蔗糖，有時可用2.5%。第6頁，共35頁，2023年，2月20日，星期五2.維生素：常用維生素有VB1(鹽酸硫胺素)、VB6(鹽酸吡哆醇)、VB3(又稱Vpp，煙酸或尼克酸)、VB5（泛酸）、Vc（抗壞血酸），有時還使用VH（生物素）、葉酸、VB12等。一般用量為0.1—1.0mg／L。

VB1對愈傷組織的產(chǎn)生和生活力有重要作用，VB6能促進(jìn)根的生長，Vpp與植物代謝和胚的發(fā)育有一定關(guān)系。Vc有防止組織變褐的作用。第7頁，共35頁，2023年，2月20日，星期五3.氨基酸：

培養(yǎng)基中最常用的氨基酸是甘氨酸，其他的如精氨酸、谷氨酸，谷酰胺、天冬氨酸、天冬酰胺、丙氨酸等也常用。有時應(yīng)用水解乳蛋白或水解酪蛋白，用量在10-1000mg／L之間。4.肌醇：使用濃度一般為50~l00mg／L，適當(dāng)使用肌醇，能促進(jìn)愈傷組織的生長以及胚狀體和芽的形成。對組織和細(xì)胞的繁殖、分化有促進(jìn)作用，對細(xì)胞壁的形成也有作用。第8頁，共35頁，2023年，2月20日，星期五5.天然有機(jī)附加物：如椰汁、香蕉汁、馬鈴薯汁、酵母提取液等。（四）植物生長調(diào)節(jié)劑：1、生長素類：（1）組培中的作用：①促進(jìn)細(xì)胞伸長；②促進(jìn)生根；③誘導(dǎo)愈傷組織的形成；④2,4-D會誘導(dǎo)某些植物不定胚的形成。第9頁，共35頁，2023年，2月20日，星期五（2）常用的生長素：吲哚乙酸（IAA）、吲哚丁酸（IBA）、萘乙酸（NAA）、2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-D）（3）常用濃度：0.1~5.0mg/L（4）需注意的問題：①IAA穩(wěn)定性差——過濾滅菌，避光保存；②生長素與細(xì)胞分裂素（CTK）配合使用：IAA/CTK比值高，促進(jìn)根的分化；IAA/CTK比值低，促進(jìn)芽的分化；IAA/CTK比值始終，形成愈傷組織，不分化③2,4-D可有效誘導(dǎo)愈傷組織的形成，但對芽的形成具有抑制作用，且使用濃度范圍較窄，稍過量對植物組織有毒害作用；④誘導(dǎo)分化、增殖和生根階段一般選用IBA和NAA第10頁，共35頁，2023年，2月20日，星期五2.細(xì)胞分裂素（CTK）：（1）作用：①促進(jìn)細(xì)胞分裂；②誘導(dǎo)芽的分化，促進(jìn)側(cè)芽萌發(fā)生長；③抑制頂端優(yōu)勢，延緩離體組織衰老；④對根的生長一般起抑制作用（2）常用的細(xì)胞分裂素：6-芐基腺嘌呤（6-BA）、激動素（KT）、玉米素（ZT）等。（3）使用濃度：一般0.1~10.0mg/L第11頁，共35頁，2023年，2月20日，星期五3.其他生長調(diào)節(jié)劑：（1）GA：赤霉素①作用：a.促進(jìn)幼苗莖的伸長和不定胚發(fā)育為小植株b.與生長素協(xié)同作用，對形成層的分化有影響：IAA/GA比值高時，有利于木質(zhì)部分化

IAA/GA比值低時，有利于韌皮部分化c.打破休眠d.抑制器官和胚狀體的形成，但二者形成后，又可促進(jìn)其生長②常用濃度：0.1-0.5mg/L第12頁，共35頁，2023年，2月20日，星期五（2）ABA：脫落酸a.促進(jìn)胚狀體的發(fā)生b.促進(jìn)胚狀體發(fā)育成熟但不萌發(fā)（五）凝固劑：瓊脂、卡拉膠等濃度：一般0.4%~0.7%（六）其他物質(zhì)1.活性炭（AC）：防止外植體褐變；降低玻璃苗的產(chǎn)生率；有利于生根，一般0.5%~3%2.抗生素：3.抗氧化物質(zhì)第13頁，共35頁，2023年，2月20日，星期五三、培養(yǎng)基的類型及特點(diǎn)1、MS培養(yǎng)基——應(yīng)用最為廣泛（1）特點(diǎn)：無機(jī)鹽和離子濃度較高，硝酸鹽含量較高（2）適用范圍：廣泛地用于植物的器官、花藥、細(xì)胞和原生質(zhì)體培養(yǎng)第14頁，共35頁，2023年，2月20日，星期五2.White培養(yǎng)基：其特點(diǎn)是無機(jī)機(jī)鹽數(shù)量較低，適用于生根培養(yǎng)，胚胎培養(yǎng)及一般的組織培養(yǎng)也可以用，應(yīng)用較廣泛。3.B5培養(yǎng)基：其主要特點(diǎn)是含有較低的銨，較高的硝酸鹽和VB1，銨對植物的生長有抑制作用。木本植物尤其適宜在B5培養(yǎng)基上生長。4.N6培養(yǎng)基：其特點(diǎn)是成分較簡單，KNO3和（NH4）2SO4含量高，廣泛應(yīng)用于小麥、水稻及其他植物的花藥培養(yǎng)和其他組織培養(yǎng)。第15頁，共35頁，2023年，2月20日，星期五三、培養(yǎng)基的配制（一）母液的配制及保存1.母液的類型：大量元素母液（N、P、S、K、Ca、Na、Mg等大量元素的無機(jī)鹽混合液）10X或20X微量元素母液（Mn、Mo、Co、Cu、Zn、B、I等微量元素的無機(jī)鹽混合液）100X鐵鹽母液（一般使用螯合鐵Fe-EDTA)100X有機(jī)營養(yǎng)母液（各種維生素和某些氨基酸的混合液）100X植物激素母液（各種植物激素單獨(dú)配制的母液）100X第16頁，共35頁，2023年，2月20日，星期五2、配制母液的注意事項(xiàng)：（1）配制無機(jī)鹽母液要防止混合各種鹽時產(chǎn)生沉淀，各種藥品必須在溶解后才能混合，而且要注意先后次序，把鈣離子、錳離子、鋇離子和硫酸根、磷酸根錯開，以免相互結(jié)合生成沉淀。另外，在混合各種無機(jī)鹽時，稀釋度應(yīng)大，混合要慢，注意攪拌。第17頁，共35頁，2023年，2月20日，星期五（2）在配制微量元素母液時也應(yīng)注意藥品的添加順序，以防止沉淀的產(chǎn)生。（3）鐵鹽由于易被氧化，易與其他混合液產(chǎn)生沉淀，因此鐵鹽應(yīng)與Na2-EDTA混合配制成螯合鐵。（4）有些生長調(diào)節(jié)物質(zhì)不溶于水，2,4-D、NAA、IAA、GA3等在配制時可先用少量95%的乙醇溶解。KT、6-BA等可先溶解于少量1mol/L的鹽酸中。葉酸則可先用少量稀氨水溶解。第18頁，共35頁，2023年，2月20日，星期五3、配制好的母液貼上標(biāo)簽

標(biāo)簽：注明母液的名稱、配制倍數(shù)、配制日期、配制人員及配1L培養(yǎng)基時應(yīng)移取的量。

注意：母液要低溫保存，儲存時間不易過長，有沉淀或霉菌，則不可再用。第19頁，共35頁，2023年，2月20日，星期五（二）培養(yǎng)基的制備方法1.確定培養(yǎng)基配方及配制量；2.根據(jù)配方和配制量計(jì)算出各種母液及糖、瓊脂的用量。3.按需吸取母液、稱量蔗糖和瓊脂。4.用60%-70%培養(yǎng)基最終容積的蒸餾水將瓊脂煮溶。5.分別加入各種母液和糖，一些不耐熱的激素在滅菌后用過濾滅菌法加入。第20頁，共35頁，2023年，2月20日，星期五6.加蒸餾水定容至最終容積，調(diào)PH值。7.分裝8.包扎9.瓶身上做標(biāo)記10.高壓滅菌：0.105MPa，121℃，20~30min第21頁，共35頁，2023年，2月20日，星期五（三）計(jì)算：1.欲配制1LMS＋6-BA0.5mg/L+NAA1.0mg/L＋3%蔗糖+0.6%瓊脂培養(yǎng)基，已知MS母液已經(jīng)配制完成，其濃度分別是：大量元素10倍，微量元素200倍，鐵鹽100倍，有機(jī)物500倍，1.0mg/ml6-BA，0.1mg/mlNAA。（1）計(jì)算各種母液、蔗糖和瓊脂的用量（2）敘述培養(yǎng)基的配制過程第22頁，共35頁，2023年，2月20日，星期五2.要配制1mol/LNaOH100ml，1mol/LHCl1000ml，則需稱取NaOH多少克，量取濃HCl多少ml？注：NaOH的摩爾質(zhì)量是40g/mol，濃鹽酸的摩爾濃度為12mol/L第23頁，共35頁，2023年，2月20日，星期五第二節(jié)外植體的選擇與消毒一、外植體的類型(一）外植體的選擇原則1.植物的基因型：決定植物組織培養(yǎng)難易程度的重要因素；2.外植體的生理狀態(tài)和發(fā)育年齡3.取材的季節(jié)4.外植體的大小5.外植體的來源6.易于消毒第24頁，共35頁，2023年，2月20日，星期五（二）外植體的類型1.帶芽的外植體——適于離體快繁，脫毒培養(yǎng)2.分化的器官和組織3.種子和胚第25頁，共35頁，2023年，2月20日，星期五二、外植體的消毒1.外植體預(yù)處理：（1）適當(dāng)修剪：莖段：將莖上的葉片、葉柄等剪去，將莖剪成帶有2~3個節(jié)的莖段；葉：大葉剪成帶葉脈的葉塊；根：修去老根死根等，剪成2~5cm的根段。第26頁，共35頁，2023年，2月20日，星期五（2）如莖、葉外被茸毛、蠟質(zhì)、不光滑等，則用軟毛刷蘸洗衣粉水刷洗（3）流水沖洗2.70%乙醇浸泡10~30s，無菌水沖洗1次3.選擇合適的消毒劑，浸泡適當(dāng)時間4.無菌水沖洗3~5次第27頁，共35頁，2023年，2月20日，星期五第三節(jié)滅菌消毒技術(shù)一、物理滅菌方法：（一）高溫滅菌：1.高壓蒸汽滅菌（1）設(shè)備：高壓蒸汽滅菌鍋（2）特點(diǎn)：簡便、迅速、滅菌徹底（3）適用范圍：耐高壓高溫的培養(yǎng)基、無菌水、無菌紙、接種工具、培養(yǎng)容器等（4）要求：0.105MPa、121℃、20~30min第28頁，共35頁，2023年，2月20日，星期五2.灼燒滅菌：（1）設(shè)備：酒精燈（2）特點(diǎn)：簡便、迅速（3）適用范圍：接種工具（4）要求：用酒精燈外焰灼燒第29頁，共35頁，2023年，2月20日，星期五3.干熱滅菌：（1）設(shè)備：電熱干燥箱、接種器械滅菌器（2）特點(diǎn)：干燥、但耗時較長（3）適用范圍：金屬接種工具，玻璃培養(yǎng)容器（4）要求：160~170℃，1~2h，如有玻璃器皿則必須待溫度降至50℃時，才能打開烘箱門，以防溫度驟降玻璃破碎。第30頁，共35頁，2023年，2月20日，星期五（二）紫外線滅菌：紫外燈，適于接種室、培養(yǎng)室及超凈工作臺的空氣和物體表面滅菌。（三）過濾滅菌：細(xì)菌過濾器、注射器，適用于高溫高壓下易分解的試劑，主要是植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)，如IAA、GA3、ZT的滅菌。第31頁，共35頁，2023年，2月20日，星期五二、化學(xué)方法（一）適用范圍：適用于外植體表面、接種器械表面、環(huán)境、空氣和操作人員皮膚的消毒。（二）常用化學(xué)消毒劑滅菌劑使用濃度(%)持續(xù)時間（min）去除的難易效果次氯酸鈣9~105~30易很好次氯酸鈉25~30易很好氯化汞0.1~15~8較難