人體染色體觀察

人體X染色質(zhì)觀察生76劉森2007030073同組人：李逸群周斐廖若西袁堂謐蔣超劉鐵軍實(shí)驗(yàn)?zāi)康?．通過實(shí)驗(yàn)掌握鑒定人類X染色質(zhì)的方法，在顯微鏡下正確識(shí)別Barr小體的特征及其所在位置。了解X染色體失活的有關(guān)理論假說以及失活染色體尚的基因所控制的遺傳形狀的特點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)原理雌性個(gè)體細(xì)胞的2條X染色體中，有一條在間期是處在不活動(dòng)的異固縮狀態(tài)，從而形成了X染色質(zhì)又稱Barr小體。后來人們知道這和情況在哺乳類動(dòng)物的雌性個(gè)體都存在，即雌性哺乳類動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)的X染色體在間期內(nèi)僅有一條呈松散狀態(tài)，參加細(xì)胞生理活動(dòng)，另一條則保持固縮狀態(tài)。Barr小體出現(xiàn)在哺乳動(dòng)物雌性個(gè)體細(xì)胞的細(xì)胞核邊緣，這主要是因?yàn)檫@條染色體處在失活狀態(tài)，在DNA復(fù)制時(shí)總是落后于其他染色質(zhì)所致。劑量補(bǔ)償效應(yīng)是指XY型性別決定的生物，由X性染色體上的基因決定的性狀在兩性的表現(xiàn)幾乎相同。也就是說X染色體上的基因的表達(dá)產(chǎn)物在雌雄動(dòng)物的細(xì)胞中是等量的。這種劑量補(bǔ)償效應(yīng)可以通過兩種途徑實(shí)現(xiàn)：一是X染色體的轉(zhuǎn)錄速率的差異，即雌性動(dòng)物細(xì)胞中的兩條X染色體的轉(zhuǎn)錄速率低于雄性細(xì)胞中單條X染色體的轉(zhuǎn)錄速率，因而造成雌性和雄性細(xì)胞的總體表達(dá)水平接近；二是雌性細(xì)胞中有一條X染色體在功能上是失活的。1966年，M.F.Lyon根據(jù)許多研究結(jié)果提出了X染色體失活的假說，主要內(nèi)容為：在正常的雌性哺乳動(dòng)物的體細(xì)胞中，一條X染色體在遺傳上有活性，而另一條處于失活狀態(tài)。這種失活發(fā)生在胚胎發(fā)育的早期，失活是隨機(jī)的。但是一旦發(fā)生了失活，這個(gè)細(xì)胞的后代將處于失活狀態(tài)。X染色體上的雜合基因?qū)⒊霈F(xiàn)嵌合現(xiàn)象。Lyon假說雖然可以解釋一些問題但不是全部，實(shí)驗(yàn)器材光學(xué)顯微鏡，載玻片，蓋玻片，牙簽，吸水紙，離心機(jī)，吸管，固定液，2.0g/L甲苯銨藍(lán)染色液，生理鹽水。實(shí)驗(yàn)步驟1．取材：先漱口三次，將口腔內(nèi)雜物漱出。然后用牙簽的鈍面刮取口腔頰部粘膜細(xì)胞，將其放人盛有3ml生理鹽水的離心管中，輕輕搖動(dòng)使細(xì)胞分散于生理鹽水中。2．離心收集細(xì)胞：以1600r/min離心1Omin。3．固定：離心結(jié)束后，輕輕將上清液除去。留下的沉淀物用固定液固定10min。4．離心：1200r/min離心1Omin。5．制備細(xì)胞懸液：去掉上清液，根據(jù)細(xì)胞沉淀量加入1ml新配制的固定液，用吸管吹打成細(xì)胞懸液。6．滴片：用吸管將細(xì)胞懸液滴在載玻片上，在空氣中干燥。7．酸解：當(dāng)載玻片上的固定液全部揮發(fā)后，在載玻片上滴加5MHCl，處理10min，然后用清水漂洗幾遍。8．染色：在2.0g/L甲苯胺藍(lán)染色液中染色30min。染色結(jié)束后，用清水漂洗以去掉浮色，在空氣中自然干燥。9．鏡檢：在油鏡下依次觀察細(xì)胞核著色均勻、核膜完整的細(xì)胞若干。10．辨認(rèn)Barr小體，區(qū)分樣品來源：在油鏡下觀察Barr小體，通過統(tǒng)計(jì)50個(gè)細(xì)胞中Barr小體的數(shù)量來判斷此樣品來自男性還是女性。全組辨別完后，在助教處核對答案。實(shí)驗(yàn)結(jié)果樣品來源辨別我們組原有7管樣品，3男4女。離心前有同學(xué)誤以為已離心，將8－7倒掉。因?yàn)?－7中唾液含量較多，泡沫明顯，可以判斷來源，故讓該同學(xué)重新取樣。第一次離心時(shí)，8－3、8－4兩管由于轉(zhuǎn)速偏高，碎在了離心機(jī)里，因來源不明，征求老師意見后重取1男1女2份樣品，標(biāo)為8－8，8－9。故我組7份樣品為8－1、8－2、8―5、8－6、8－7、8－8、8－9。男性樣品特征：染色均勻，比較干凈，核膜明顯，沒有Barr小體似的膜內(nèi)緣深染物質(zhì)。女性樣品特征：染色均勻且較深，能比較明顯地看到部分細(xì)胞核膜內(nèi)緣有深染的物質(zhì)，呈卵形、短棒形。最后小組判斷結(jié)果是8－5、8－6、8－9為男性樣品，與老師開始時(shí)編號(hào)一致。Barr小體數(shù)量統(tǒng)計(jì)我一開始鏡檢的是份男性樣品，后借來組內(nèi)一份女性樣品觀察，共觀察58個(gè)核著色均勻、核膜完整的細(xì)胞，其中陽性22個(gè)，陰性36個(gè)，陽性率為37.9％。討論Marker筆的油性助教收回每組的所有樣品后，會(huì)打亂重新編號(hào)，重新發(fā)給同學(xué)。這時(shí)注意不要用手涂marker的位置，以防m(xù)arker筆油性不好，編號(hào)被抹掉，無法核對答案。我們組有2個(gè)管的標(biāo)記被擦掉，所幸還有微弱痕跡，可以用來識(shí)別。離心機(jī)轉(zhuǎn)速選擇書上說1000rpm，老師課上講需要更高的轉(zhuǎn)速，大約1200rpm～1500rpm。我們組在離心時(shí)使用了1600rpm，結(jié)果非常悲慘，有2個(gè)玻璃離心管禁不住強(qiáng)大的離心力，碎在了離心機(jī)內(nèi)。導(dǎo)致我們重新制了2管樣品，全組受此影響5點(diǎn)多才結(jié)束。盲實(shí)驗(yàn)這次我們采取了盲實(shí)驗(yàn)的模式，即男女生混合編組，取樣后交給助教，助教登記男女后打亂順序、改變標(biāo)記，重新進(jìn)行編號(hào)再發(fā)還組員。全體組員經(jīng)過鑒定得出結(jié)果后再找助教核對，如一致則繼續(xù)進(jìn)行數(shù)量統(tǒng)計(jì)，不一致的話需要繼續(xù)鑒定。這種實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｊ浇o原本枯燥的鑒定實(shí)驗(yàn)帶來了很多樂趣，通過鑒定未知樣品，避免了同學(xué)知道樣品來源后先入為主的判斷。而且這樣一來一組同學(xué)要緊密合作，同時(shí)可以互相指導(dǎo)，增加了教學(xué)實(shí)驗(yàn)的收獲。細(xì)菌污染我借來的那份女性樣品中，在油鏡下可以清楚地看到一些微生物，比如弧菌、桿菌、球菌，個(gè)體較口腔上皮細(xì)胞小許多。而我看的那份男性樣品視野比較干凈，沒有細(xì)菌的污染?？谇恢猩畹奈⑸锎_實(shí)比較多，建議以后實(shí)驗(yàn)前的午飯后可以刷牙，取樣前再用清水漱口3次，第一根牙簽刮取的樣品舍棄，從第二根開始收集。這樣可以有效的避免細(xì)菌污染。即使污染了也沒太大關(guān)系，只要能看到足夠數(shù)量可以用于統(tǒng)計(jì)的細(xì)胞就行。另外，也熟悉了一下微生物觀察的基本知識(shí)，還告訴我們?nèi)梭w中是存在大量細(xì)菌的，不要忽視他們的存在，否則會(huì)得病的。女性樣品的陽性率我的實(shí)驗(yàn)結(jié)果是37.9％，從網(wǎng)上查的資料顯示各試驗(yàn)室觀察的陽性率從30％－50％不等，都遠(yuǎn)低于100％。首先不是每個(gè)經(jīng)過處理的細(xì)胞都能將Barr小體成功深染；其次不同人的判斷標(biāo)準(zhǔn)不一樣，對“深染”的掌握尺度不同。因此造成陽性率較低。思考題1．什么是劑量補(bǔ)償效應(yīng)？劑量補(bǔ)償效應(yīng)是指XY型性別決定的生物，由X性染色體上的基因決定的性狀在兩性的表現(xiàn)幾乎相同。也就是說X染色體上的基因的表達(dá)產(chǎn)物在雌雄動(dòng)物的細(xì)胞中是等量的。這種劑量補(bǔ)償效應(yīng)可以通過兩種途徑實(shí)現(xiàn)：一是X染色體的轉(zhuǎn)錄速率的差異，即雌性動(dòng)物細(xì)胞中的兩條X染色體的轉(zhuǎn)錄速率低于雄性細(xì)胞中單條X染色體的轉(zhuǎn)錄速率，因而造成雌性和雄性細(xì)胞的總體表達(dá)水平接近；二是雌性細(xì)胞中有一條X染色體在功能上是失活的。2．Barr小體分析技術(shù)在人類遺傳學(xué)工作中有什么用途？Barr小體的臨床意義在于鑒別性別。例如運(yùn)動(dòng)員參加女子項(xiàng)目，可通過檢查其白細(xì)胞中有無巴氏小體而確定其性別?，F(xiàn)在已不用此技術(shù)為判別標(biāo)準(zhǔn)。3．制片過程中使用HCl酸解的目的是什么？主要是為了使口腔上皮細(xì)胞分散，利于下面的染色和觀察。4．描繪所觀察到的Barr小體的形態(tài)特征和在細(xì)胞中的分布狀況。呈卵形