實(shí)驗(yàn)二瓊脂糖凝膠電泳實(shí)驗(yàn)知識(shí)交流

試驗(yàn)二瓊脂糖凝膠電泳試驗(yàn)僅供學(xué)習(xí)與溝通，如有侵權(quán)請(qǐng)聯(lián)系網(wǎng)站刪除感謝僅供學(xué)習(xí)與溝通，如有侵權(quán)請(qǐng)聯(lián)系網(wǎng)站刪除感謝2【試驗(yàn)?zāi)康摹繉W(xué)習(xí)瓊脂糖凝膠電泳的根本原理；把握使用水平式電泳儀的方法；學(xué)習(xí)在含有甲醛的凝膠上進(jìn)展RNA電泳的方法。【試驗(yàn)原理】瓊脂糖凝膠電泳是基因工程試驗(yàn)室中分別鑒定核酸的常規(guī)方法。核酸是兩性電解質(zhì)，其等電點(diǎn)為〔pH8.5〕，核酸分子帶負(fù)電荷，在電場(chǎng)中向正極移動(dòng)。核酸分子在瓊脂糖凝膠中泳動(dòng)時(shí)，具有電荷效應(yīng)和分子篩效應(yīng)，但主要為分子篩效應(yīng)。因此，核酸分子的遷移率由以下幾種因素打算：DNA的分子大小。線狀雙鏈DNA分子在確定濃度瓊脂糖凝膠中的遷移速率與DNA分子量對(duì)數(shù)成反比，分子越大則所受阻力越大，也越難于在凝膠孔隙中移動(dòng)，因而遷移得越慢。DNA分子的構(gòu)象。當(dāng)DNA分子處于不同構(gòu)象時(shí),它在電場(chǎng)中移動(dòng)距離不僅和分子量有關(guān),還和它本身構(gòu)象有關(guān)。一樣分子量的線狀、開環(huán)和超螺旋質(zhì)粒DNA在瓊脂糖凝膠中移動(dòng)的速度是不一樣的，超螺旋DNA移動(dòng)得最快，而開環(huán)狀DNA移動(dòng)最慢。如在電泳鑒定質(zhì)粒純度時(shí)覺察凝膠上有數(shù)條DNA帶難以確定是質(zhì)粒DNA不同構(gòu)象引起還是由于含有其他DNA引起時(shí)，可從瓊脂糖凝膠上將DNA帶逐個(gè)回收，用同一種限制性內(nèi)切酶分別水解，然后電泳，如在凝膠上消滅一樣的DNADNA。電源電壓。在低電壓時(shí)，線狀DNA片段的遷移速率與所加電壓成正比。但是隨著電場(chǎng)強(qiáng)度的增加，不同分子量的DNA片段的遷移率將以不同的幅度增長(zhǎng)，片段越大，因場(chǎng)強(qiáng)上升引起的2kbDNA片5v/cm。DNA的電泳遷移率。在沒有離子存電導(dǎo)率最小，DNA幾乎不移動(dòng)；在高離子強(qiáng)度的緩沖液中〔如誤10×電泳緩沖液〕，則電導(dǎo)很高并明顯產(chǎn)熱，嚴(yán)峻時(shí)會(huì)引起凝膠熔化或DNA變性。溴化乙啶(Ethidiumbromide,EB)〔1〕DNA254nm紫外光EB能放射熒光，而且熒光的強(qiáng)度正比于核酸的含量，如將濃度的標(biāo)準(zhǔn)樣品作電泳對(duì)Sybergreen。DNARNA的分別鑒定；但經(jīng)甲醛進(jìn)展變性處理的瓊脂RNANorthernRNA是單鏈，其泳動(dòng)速度與一樣DNARNA分子大小的測(cè)定，而且染色后條帶更為銳利，也更結(jié)實(shí)結(jié)合于硝酸纖維素膜上，與放射性或非放射性標(biāo)記的探針發(fā)生高效雜交?！驹噭┡c器材】〔一〕材料電泳儀、水平電泳槽、樣品梳子、瓊脂糖等〔二〕試劑150TAE(1000mL)：242gTris,57.1mL 冰醋酸，18.6g EDTA。1g溴化乙啶，磁力攪拌數(shù)小時(shí)以確保其完全溶解，分裝，室溫避光保存。3DNA加樣緩沖液：0.25%溴酚藍(lán)，0.25%二甲苯青，50%甘油〔w/v〕。4RNA甲醛變性膠上樣緩沖液：0.25%溴酚藍(lán)，0.25%二甲苯青，1mMEDTA(PH8.0)，50%甘油〔w/v〕，DEPC水配制，高壓滅菌備用。5、5 醛變性膠電泳緩沖液：0.1mMOPS(PH7.0)，40mM醋酸鈉，5mMEDTA(PH8.0)，用DEPC水配制，過濾除菌，室溫避光保存。淡黃色緩沖液可正常使用，深黃色應(yīng)棄用?！静僮鞣椒ā俊惨弧吵Ｒ?guī)的水平式瓊脂糖電泳可參考下表：瓊脂糖的含量〔%〕分別線狀DNA分子的有效范圍〔Kb〕0.360-50.620-10.710-0.80.97-0.51.26-0.41.54-0.22.03-0.11x電泳緩沖液，待水合數(shù)分鐘后，置微波爐中將瓊脂糖溶化,使附于瓶壁上的瓊脂糖顆粒進(jìn)入溶液；加熱時(shí)應(yīng)蓋上封口膜,以削減水份蒸發(fā)。膠板的制備：將膠槽置于制膠板上,插上樣品梳子,1mm左500.5微克/EB(EB參與凝膠中,而是電泳后再用0.5μg/ml的EB溶液浸泡染色15分鐘)，搖勻，輕輕倒入電泳制膠板上，除掉1x電泳緩沖液，使電泳緩沖液液面剛高出瓊脂糖凝膠面；DNA1X。10μL微量移液器分別將樣品參與膠板的樣品小槽內(nèi)，每加完一個(gè)樣品，應(yīng)更換一個(gè)加樣頭，以防污染，加樣時(shí)勿碰壞樣品孔四周的凝膠面。〔留意：加樣前要先登記加樣的挨次和點(diǎn)樣量〕。4．電泳：加樣后的凝膠板馬上通電進(jìn)展電泳，DNA的遷移速度與電壓成正比，最高電壓不超過5V/cm0.5%，電泳溫度不能太高。樣品由負(fù)極〔黑色〕向正極〔紅色〕方向移1cm處時(shí)，停頓電泳。254nm的紫外燈下觀看染色后〔2〕的或已加有之?！捕砇NA電泳〔選做〕配制23mL甲醛電泳膠：0.336g瓊脂糖溶于20mLDEPC水中，冷卻至60 C，參與5mL的5x5.5mL30分鐘后使用。甲醛變性膠RNA樣品的制備：1μLRNA，5 甲醛變性膠電泳緩沖液0.5μL，甲醛0.7μL，甲酰胺2μL，65oC加熱15min，快速冰浴，加1μL上樣緩沖液和0.2μL的EB。步驟：3%30分鐘以上。膠板的制備：按常規(guī)瓊脂糖電泳法。預(yù)電泳：110min5V/cm。3-4V/cm。254nm的紫外燈下觀看電泳膠板并拍照保存圖片?！玖粢馐马?xiàng)與提示】EBEB灑到桌面EB的容器或物品必需經(jīng)特地處理后才能清洗或丟棄。簡(jiǎn)潔處理方法為：參與〔0.5mg/mL以下〕，0.25%次磷酸〔由50%0.5mol/L1天后，參與過量的1mol/LEB1/200左右。DNADNA遷移率降低。因此，假設(shè)要準(zhǔn)確地測(cè)定DNA的分子量，應(yīng)當(dāng)承受跑完電泳后再用0.5μg/ml的EB溶液浸泡染色的方法。RNARNA28SrRNA、18SrRNAmRNARNA組18SrRNA處為明顯的亮帶〔4.5kb1.9kb〕，28S/18S1.5-2.5/1；植物、昆RNA0.5-3.0kb28S/18S1/1，或者消滅拖RNA28S18SrRNA大局部已降解，則需重制備?！驹囼?yàn)安排】只需一天：上午配試劑倒膠，下午