方法比較試驗(yàn)

方法比較試驗(yàn)第1頁，共20頁，2023年，2月20日，星期五一.實(shí)驗(yàn)?zāi)康?.掌握本實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)原理；2.掌握兩種不同操作方法的操作過程；3.了解血清葡萄糖測(cè)定的臨床意義；4.學(xué)會(huì)應(yīng)用分光光度計(jì)對(duì)各組數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理。第2頁，共20頁，2023年，2月20日，星期五二.實(shí)驗(yàn)原理方法比較試驗(yàn)是將候選方法與準(zhǔn)確度已知的方法（如參考方法或經(jīng)典方法）作對(duì)比分析,同時(shí)測(cè)定一批標(biāo)本計(jì)算出兩種方法間測(cè)定結(jié)果的差值，以評(píng)價(jià)候選方法的準(zhǔn)確度，是考核候選方法是否可被采用的重要試驗(yàn)。用于檢測(cè)候選方法的恒定誤差和比例誤差，如對(duì)適當(dāng)?shù)臄?shù)據(jù)進(jìn)行分析也可以提供誤差的性質(zhì)，本實(shí)驗(yàn)以鄰甲苯胺法作為比較方法，評(píng)價(jià)GOD-POD法測(cè)定血糖的總系統(tǒng)誤差第3頁，共20頁，2023年，2月20日，星期五鄰甲苯胺法測(cè)定血糖原理：在熱的醋酸溶液中，葡萄糖醛基與鄰甲苯胺(O-T)縮合成糖基胺，經(jīng)脫水，生成希夫堿（Schiffbase），經(jīng)分子重排生成藍(lán)綠色化合物，在630nm波長處有一吸收峰，吸光度大小在一定范圍內(nèi)與血糖濃度成正比。

鄰甲苯胺+葡萄糖葡萄糖基胺希夫堿藍(lán)綠色化合物縮合脫水第4頁，共20頁，2023年，2月20日，星期五三.試驗(yàn)試劑器材1.鄰甲苯胺試劑2.GOD-POD法試劑盒3.待測(cè)血清四種含血糖濃度不同的血清：2.2mmol/L、6.7mmol/L、5.2mmol/L、3.7mmol/L.4.

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液（5.55mmol/L）5.其它：移液器、可見分光光度計(jì)、水浴箱等第5頁，共20頁，2023年，2月20日，星期五四、操作步驟1．每人隨機(jī)選擇血糖含量高低不同的病人血清標(biāo)本2份。2．將每份標(biāo)本分別用兩種方法各測(cè)定2次。將標(biāo)本按某次序排列先測(cè)一次，第2次測(cè)定時(shí)，標(biāo)本順序全部倒過來。例如，第1次序號(hào)為1、2、3、4、5、6、7、8，第2份序號(hào)為8、7、6、5、4、3、2、1。3．計(jì)算出兩法各自的測(cè)定結(jié)果第6頁，共20頁，2023年，2月20日，星期五具體操作如下：

GOD-POD法；加入物空白管S(標(biāo))U1(測(cè))U2(測(cè))DDW10ul---5mmol/L(糖標(biāo))-10ul

--待測(cè)血清--10ul10ul

試劑（酶酚）1.5ml1.5ml1.5ml1.5ml

混勻后置370C水浴15min,于505nm處比色，空白管調(diào)零，讀取吸光度值。第7頁，共20頁，2023年，2月20日，星期五O-T法(鄰甲苯胺法)；加入物空白管S(標(biāo)準(zhǔn)管)U1(測(cè))U2(測(cè))

DDW0.1ml---

5mmol/L糖標(biāo)

-0.1ml--

待測(cè)血清

--0.1ml0.1ml

鄰甲苯胺試劑

3ml3ml3ml3ml

混勻后放入沸水中煮沸5min，取出置冷水中冷卻3min，于630nm處比色，以空白管調(diào)零，讀取吸光度值。第8頁，共20頁，2023年，2月20日，星期五五、結(jié)果計(jì)算

測(cè)定管吸光度血清葡萄糖=×5mmol/L

標(biāo)準(zhǔn)管吸光度【參考范圍】空腹：3.89～6.11mmol/L；餐后2h：＜7.8mmol/L。第9頁，共20頁，2023年，2月20日，星期五數(shù)據(jù)處理1．設(shè)對(duì)比方法測(cè)定結(jié)果為X值，候選方法測(cè)定結(jié)果為Y值。若有n個(gè)標(biāo)本，則有2n對(duì)X和Y的測(cè)定結(jié)果。2．離群點(diǎn)檢查：先計(jì)算每一標(biāo)本每一方法成對(duì)結(jié)果的差值和差值的均值。以4倍的各方法差值的均值為判斷限，各方法內(nèi)標(biāo)本的成對(duì)差值都應(yīng)在限值內(nèi)，說明雙份測(cè)定結(jié)果符合要求。 若有1點(diǎn)離群點(diǎn)，剔除。若原數(shù)據(jù)僅為40例病人標(biāo)本的結(jié)果，剔除的數(shù)據(jù)應(yīng)另做實(shí)驗(yàn)補(bǔ)上。有一點(diǎn)以上離群點(diǎn)，需查原因，判斷是否保留數(shù)據(jù)。無法找出原因，則保留使用所有數(shù)據(jù)，不能隨意剔除。若最大差異超過臨床允許誤差，應(yīng)從儀器、試劑、方法上尋找原因，停止繼續(xù)實(shí)驗(yàn)。第10頁，共20頁，2023年，2月20日，星期五3．繪制散點(diǎn)圖：以X軸代表對(duì)比方法的測(cè)定值，Y軸代表被評(píng)價(jià)方法的測(cè)定值，圖中標(biāo)出斜率為1通過零點(diǎn)的直線。4．如果實(shí)驗(yàn)結(jié)果線性關(guān)系良好，繼續(xù)處理。如果呈非線性趨勢(shì)，則需要觀察是否有部分呈線性關(guān)系，尋找修正點(diǎn)，使余下的部分具線性趨勢(shì)。但應(yīng)考慮這部分是否包括了臨床上有用的范圍，是否需再多做一些在此范圍的標(biāo)本結(jié)果。如去掉非線性部分后，范圍過小，無應(yīng)用價(jià)值，則停止評(píng)價(jià)。第11頁，共20頁，2023年，2月20日，星期五

5．X、Y配對(duì)值離群點(diǎn)檢查：將每一個(gè)標(biāo)本兩個(gè)方法的前后兩個(gè)測(cè)定值一一對(duì)應(yīng)，求出第i個(gè)X與第i個(gè)Y的差值，并計(jì)算出所有標(biāo)本總的平均差值，以4倍的平均差值為判斷限值。所有差值都不應(yīng)超出限值。若有離群點(diǎn)，按步驟2中的方法處理。

6．統(tǒng)計(jì)學(xué)處理及誤差分析 直線回歸分析：對(duì)上述n個(gè)標(biāo)本，2n對(duì)（Xij、Yij）數(shù)據(jù)以回歸方程式y(tǒng)＝a+bx表示。a為回歸直線在Y軸上的截距，代表恒定誤差的大小；b為回歸系數(shù)，即直線的斜率，代表比例誤差的大小。第12頁，共20頁，2023年，2月20日，星期五a和b的計(jì)算公式分別為：如果兩方法表示的某分析物量具相同的計(jì)量單位時(shí)，理想狀態(tài)的回歸式應(yīng)為y＝x，即b=1，a=0。b≠1，a≠0分別表示兩方法間的測(cè)定標(biāo)本時(shí)的比列誤差和恒定誤差。相關(guān)性分析：相關(guān)系數(shù)r=第13頁，共20頁，2023年，2月20日，星期五

求出的相關(guān)系數(shù)還應(yīng)作相關(guān)系數(shù)的t檢驗(yàn)。相關(guān)系數(shù)(r)的t檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)公式是：

將方法比較試驗(yàn)的原始數(shù)據(jù)(x和y值)求得的相關(guān)系數(shù)r及例數(shù)(n)代入t檢驗(yàn)的統(tǒng)計(jì)學(xué)公式，即可求出相應(yīng)的tr值，再按照n-2的方法計(jì)算出自由度(v)，查t值表求得t0.05(v)及t0.01(v)相應(yīng)的t值，若tr＞t0.05(v)，P＜0.05，說明實(shí)測(cè)的相關(guān)系數(shù)(r)與0之間差異顯著，兩種測(cè)定方法的測(cè)定結(jié)果之間存在相關(guān)關(guān)系；若tr＞t0.01(v)，P＜0.01說明實(shí)測(cè)相關(guān)系數(shù)(r)與0之間有非常顯著的差異，兩種方法的測(cè)定值之間存在著高度相關(guān)關(guān)系。第14頁，共20頁，2023年，2月20日，星期五7。方法比較試驗(yàn)的數(shù)據(jù)屬于配對(duì)資料，因而可作配對(duì)資料的t檢驗(yàn)。

差值標(biāo)準(zhǔn)差

(Sd)＝自由度(V)＝n-1

差值標(biāo)準(zhǔn)差中的d代表候選方法與參考方法測(cè)定值的差值，為差值之平均值，n為配對(duì)數(shù)。判斷：若求得t值＞t0.05(v)，即P＜0.05，表示候選方法存在顯著的系統(tǒng)誤差。第15頁，共20頁，2023年，2月20日，星期五六、注意事項(xiàng)1．對(duì)比方法的選擇十分重要，一般應(yīng)選參考方法，這樣方法間的任何分析誤差均可歸于被評(píng)價(jià)的候選方法。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)中，保持候選方法和比較方法都處于完全質(zhì)量控制下，始終對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果有校準(zhǔn)措施。2．實(shí)驗(yàn)時(shí)間至少做5天，時(shí)間長一些更好；標(biāo)本至少選擇40份病人，多一份更好。實(shí)驗(yàn)的可靠性和有效性隨時(shí)間延長和更多的標(biāo)本量而增加。盡可能使50%的實(shí)驗(yàn)標(biāo)本內(nèi)分析物含量不在參考區(qū)間內(nèi)，各個(gè)標(biāo)本內(nèi)分析物含量分布越寬越好。第16頁，共20頁，2023年，2月20日，星期五3．最好使用當(dāng)天采集的標(biāo)本，若需保存標(biāo)本，應(yīng)確保它們的穩(wěn)定性。只使用一種保存條件，能符合兩個(gè)方法的要求，以免條件不一引出新的變異。4．方法學(xué)比較試驗(yàn)時(shí)，隨時(shí)將實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)點(diǎn)在分布圖，發(fā)現(xiàn)異常值即復(fù)做，及時(shí)糾正，可減少離群值出現(xiàn)的機(jī)會(huì)。5.實(shí)驗(yàn)方法在做雙份第二次實(shí)驗(yàn)時(shí)，標(biāo)本順序全部倒過來，應(yīng)在4h內(nèi)完成測(cè)定。第17頁，共20頁，2023年，2月20日，星期五七、方法學(xué)評(píng)價(jià)

對(duì)比資料的相關(guān)系(r)常用來表示兩個(gè)變量間互相關(guān)系密切的程度，并不能指明有無恒定誤差和比例誤差。直線回歸統(tǒng)計(jì)時(shí)，除了所有實(shí)驗(yàn)點(diǎn)和回歸線間的離散度會(huì)影響r值的大小外，實(shí)驗(yàn)點(diǎn)對(duì)應(yīng)的分析物含量分布寬度也會(huì)明顯影響r值的大小。若實(shí)驗(yàn)點(diǎn)過于密集，盡管離散度不大，但r值偏小。因此，可用r檢驗(yàn)X取值范圍是否適當(dāng)。一般要求r≥0.975（或r2≥0.95），認(rèn)為X范圍是適合的。若r＜0.975，應(yīng)收集更多標(biāo)本再繼續(xù)實(shí)驗(yàn)，使數(shù)據(jù)分布范圍增大。依據(jù)r值大小來判斷兩種比較方法分析結(jié)果符合程度時(shí)應(yīng)持謹(jǐn)慎態(tài)度，相關(guān)系數(shù)好，但斜率和截距仍然受離群值和非線性以及數(shù)據(jù)分布范圍的影響。第18頁，共20頁，2023年，2月20日，星期五八、可接受性判斷評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)完成以后，應(yīng)寫出書面報(bào)告，確定方法評(píng)價(jià)的結(jié)論。候選方法可否被接受，最后根據(jù)評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)中的誤差結(jié)果進(jìn)行歸納，作出判斷。根據(jù)“可允許誤差的95%限度”，計(jì)算各項(xiàng)誤差與其比較，任何一項(xiàng)指標(biāo)大于可允許誤差都不能被接受。第19頁，共20頁，2023年，2月20日，星期五只有在假設(shè)所有實(shí)驗(yàn)