第五章愈傷組織培養(yǎng)

第五章愈傷組織的培養(yǎng)第一節(jié)愈傷組織的誘導(dǎo)和分化第二節(jié)愈傷組織中的形態(tài)發(fā)生第三節(jié)人工種子現(xiàn)在是1頁\一共有70頁\編輯于星期四第一節(jié)愈傷組織的誘導(dǎo)和分化1愈傷組織的誘導(dǎo)2影響愈傷組織誘導(dǎo)形成的主要因素現(xiàn)在是2頁\一共有70頁\編輯于星期四愈傷組織(callus)：離體組織或器官進(jìn)行離體培養(yǎng)時(shí)，進(jìn)行細(xì)胞分裂，形成一種高度液泡化的無定形的薄壁細(xì)胞。FromembryocultureFromroot1愈傷組織的誘導(dǎo)現(xiàn)在是3頁\一共有70頁\編輯于星期四現(xiàn)在是4頁\一共有70頁\編輯于星期四現(xiàn)在是5頁\一共有70頁\編輯于星期四2愈傷組織的形成從外植體脫分化形成典型的愈傷組織大致可分為三個(gè)時(shí)期：愈傷組織形成起始期分裂期形成期現(xiàn)在是6頁\一共有70頁\編輯于星期四2.1起始期：細(xì)胞準(zhǔn)備進(jìn)行分裂的時(shí)期。外植體的細(xì)胞處在靜止?fàn)顟B(tài)。一些刺激因素(如機(jī)械損傷、改變光照強(qiáng)度、增加氧等)和激素的誘導(dǎo)作用，使外植體細(xì)胞的合成代謝活動(dòng)加強(qiáng)，蛋白質(zhì)和核酸的合成,誘導(dǎo)細(xì)胞開始分裂?，F(xiàn)在是7頁\一共有70頁\編輯于星期四起始期細(xì)胞內(nèi)發(fā)生的變化激素的誘導(dǎo)作用，使外植體細(xì)胞的合成代謝活動(dòng)加強(qiáng)，蛋白質(zhì)和核酸的合成增加,誘導(dǎo)細(xì)胞開始分裂。每個(gè)細(xì)胞的蛋白質(zhì)總增加量可達(dá)200%酶活性增強(qiáng)，氣體交換增加，如氧氣的吸收增加細(xì)胞的大小沒有多大改變現(xiàn)在是8頁\一共有70頁\編輯于星期四2.2分裂期:分裂期：外植體細(xì)胞經(jīng)過誘導(dǎo)以后脫分化，不斷分裂增生子細(xì)胞的過程。脫分化：細(xì)胞由靜止期進(jìn)入分裂期，恢復(fù)分裂機(jī)能現(xiàn)在是9頁\一共有70頁\編輯于星期四分裂期外植體的特征:細(xì)胞分裂快，結(jié)構(gòu)疏松，缺少有組織的結(jié)構(gòu)，維持其不分化的狀態(tài)，顏色淺而透明?，F(xiàn)在是10頁\一共有70頁\編輯于星期四外層細(xì)胞在外源激素的作用下，迅速分裂，使得外層細(xì)胞數(shù)目增加，細(xì)胞體積縮小，細(xì)胞的核和核仁增大到最大。逐步回到分生組織狀態(tài)。

隨著細(xì)胞不斷分裂和生長，細(xì)胞總干重、蛋白質(zhì)和核酸量大大增加，新細(xì)胞壁合成極快。細(xì)胞分裂快，結(jié)構(gòu)疏松，缺少有組織的結(jié)構(gòu)，維持其不分化的狀態(tài)，顏色淺而透明。細(xì)胞的主要表現(xiàn):現(xiàn)在是11頁\一共有70頁\編輯于星期四2.3形成期：指在分裂期的末期，細(xì)胞內(nèi)開始出現(xiàn)一系列形態(tài)和生理上的變化，從而使愈傷組織內(nèi)產(chǎn)生不同形態(tài)和功能的細(xì)胞?，F(xiàn)在是12頁\一共有70頁\編輯于星期四細(xì)胞分裂部位和方向發(fā)生改變：內(nèi)部細(xì)胞發(fā)生分裂，形成像維管束或類似分生組織，組成的鳥巢狀結(jié)構(gòu)。細(xì)胞的體積相對穩(wěn)定，不再減少。出現(xiàn)了各種類型的細(xì)胞：如管胞、纖維細(xì)胞、薄壁細(xì)胞、分生細(xì)胞、色素細(xì)胞等。生長旺盛的愈傷組織呈乳白色、白色或淺綠色，老化的多轉(zhuǎn)化為黃色或褐色。細(xì)胞特點(diǎn)：現(xiàn)在是13頁\一共有70頁\編輯于星期四現(xiàn)在是14頁\一共有70頁\編輯于星期四

RedWhitecallus

GreencallusYellowcallus根據(jù)愈傷色澤劃分為：愈傷組織的分類

現(xiàn)在是15頁\一共有70頁\編輯于星期四

易碎的愈傷堅(jiān)硬的愈傷

生根的愈傷

滲出粘性多糖的愈傷

根據(jù)愈傷質(zhì)地劃分為：現(xiàn)在是16頁\一共有70頁\編輯于星期四文心蘭的根（a）莖（b）葉（c）誘導(dǎo)的愈傷組織根據(jù)愈傷發(fā)生部位：現(xiàn)在是17頁\一共有70頁\編輯于星期四胚性愈傷組織表面呈顆粒狀、組織結(jié)構(gòu)緊湊、再生力強(qiáng)。非胚性愈傷組織表面粗糙、組織結(jié)構(gòu)疏松。

根據(jù)愈傷難易程度：胚性愈傷組織容易形成胚狀體非胚性愈傷組織誘導(dǎo)率可達(dá)100％，胚性愈傷組織誘導(dǎo)率相對較低?，F(xiàn)在是18頁\一共有70頁\編輯于星期四愈傷組織生長周期愈傷組織生長周期為2－4周。在培養(yǎng)基上生長一段時(shí)間以后，由于營養(yǎng)物質(zhì)枯竭，水分散失，或有毒代謝物的積累，導(dǎo)致愈傷組織停止生長，甚至老化變黑、死亡。轉(zhuǎn)移到新鮮培養(yǎng)基：定期地將它們分成小塊，接種到新鮮的培養(yǎng)基上，可以長期保持旺盛的生長。現(xiàn)在是19頁\一共有70頁\編輯于星期四第一節(jié)愈傷組織的誘導(dǎo)和分化1愈傷組織的誘導(dǎo)2影響愈傷組織誘導(dǎo)形成的主要因素現(xiàn)在是20頁\一共有70頁\編輯于星期四（1）不同植物和外植體誘導(dǎo)愈傷組織能力的差異。不同植物種類、同一植物不同器官來源及其生理狀況、年齡的外植體的脫分化（形成愈傷組織）能力有很大差別。煙草、胡蘿卜等植物的脫分化比較容易，禾本科植物的脫分化比較難；花的脫分化比較容易，莖、葉的脫分化比較難；幼嫩組織的脫分化比較容易，成熟的老組織脫分化比較難。2影響愈傷組織誘導(dǎo)形成的主要因素現(xiàn)在是21頁\一共有70頁\編輯于星期四（2）培養(yǎng)基種類對愈傷組織誘導(dǎo)的影響。誘導(dǎo)愈傷組織常用的培養(yǎng)基為MS和B5。（3）外源激素對愈傷組織誘導(dǎo)的影響---重要因素。（4）培養(yǎng)條件對愈傷組織誘導(dǎo)的影響:

濕度條件、溫度條件、光照條件?，F(xiàn)在是22頁\一共有70頁\編輯于星期四2,4-D和BA濃度對銀膠菊莖段愈傷組織生長的影響處理（2,4-D:BA）愈傷組織形成情況0:0僅有，不生長0:0.1有限的生長，顯綠色0：0.2生長不良0.05:0大塊、綠色，平均直徑為10mm0.05:1生長不良，稍帶褐色0.05:2生長不良，稍帶褐色0.1:0大塊，綠色至淺褐色0.1:0.1大塊，綠色至淺褐色0.1:0.2稍小于0.1:0.1比例，變褐現(xiàn)在是23頁\一共有70頁\編輯于星期四

各種生長素對黃瓜各外植體愈傷組織誘導(dǎo)的效應(yīng)（各種生長素濃度為10μmol/L）生長素愈傷組織形成種子下胚軸果皮IBA無愈傷組織形成愈傷組織增殖強(qiáng)IBA濃度為1μmol/L時(shí)愈傷組織生長良好NAA無愈傷組織形成所有外植體均產(chǎn)生愈傷組織愈傷組織增殖強(qiáng)2,4-D所有外植體均產(chǎn)生愈傷組織2,4-D濃度為1μmol/L時(shí)愈傷組織生長良好愈傷組織增殖強(qiáng)NOA萘氧乙酸無愈傷組織形成愈傷組織增殖中等愈傷組織增殖中等NOP萘氧丙酸無愈傷組織形成愈傷組織增殖中等愈傷組織增殖強(qiáng)愈傷組織增殖強(qiáng)現(xiàn)在是24頁\一共有70頁\編輯于星期四現(xiàn)在是25頁\一共有70頁\編輯于星期四第五章愈傷組織的培養(yǎng)第一節(jié)愈傷組織的誘導(dǎo)和分化第二節(jié)愈傷組織中的形態(tài)發(fā)生第三節(jié)人工種子現(xiàn)在是26頁\一共有70頁\編輯于星期四1愈傷組織形態(tài)發(fā)生方式愈傷組織器官發(fā)生通過體細(xì)胞胚胎/胚狀體途徑再生植株第二節(jié)愈傷組織中的形態(tài)發(fā)生現(xiàn)在是27頁\一共有70頁\編輯于星期四2愈傷組織器官發(fā)生

先不定芽，在莖基部長根先長根后長芽在不同部位分別形成根和芽

現(xiàn)在是28頁\一共有70頁\編輯于星期四現(xiàn)在是29頁\一共有70頁\編輯于星期四無機(jī)鹽混合物類營養(yǎng)條件有機(jī)物類植物激素類天然復(fù)合物類外因滲透壓酸堿度影響因子環(huán)境條件濕度溫度光照內(nèi)因遺傳性生理狀態(tài)

影響愈傷組織器官發(fā)生的因素：

植物激素的作用

外植體自身因素現(xiàn)在是30頁\一共有70頁\編輯于星期四（1）外植體自身因素（內(nèi)因）

①母體植株的遺傳基礎(chǔ)被子植物比裸子植物容易，被子植物中茄科、秋海棠科、景天科、苦苣苔科和十字花科植物成功報(bào)道最多；無性繁殖植物比有性繁殖植物的容易；同種植物不同品種（基因型）的培養(yǎng)效果不同現(xiàn)在是31頁\一共有70頁\編輯于星期四②外植體的類型

影響培養(yǎng)的難易：一般生理狀態(tài)年輕，來源于生長活躍或生長潛力大的組織和器官的細(xì)胞容易培養(yǎng)。

現(xiàn)在是32頁\一共有70頁\編輯于星期四例：百合：鱗莖的鱗片分化能力：外層>中層>內(nèi)層現(xiàn)在是33頁\一共有70頁\編輯于星期四現(xiàn)在是34頁\一共有70頁\編輯于星期四

高：有利于根的形成和愈傷組織的形成；適中：有利于根芽的分化；低：有利于芽的形成生長素細(xì)胞分裂素＝適宜的植物激素配比在器官分化中有著重要的作用。

（2）植物激素的作用（外因）現(xiàn)在是35頁\一共有70頁\編輯于星期四蘆薈的植物組織培養(yǎng)過程1234567891011現(xiàn)在是36頁\一共有70頁\編輯于星期四芽（單芽、叢芽）現(xiàn)在是37頁\一共有70頁\編輯于星期四1愈傷組織形態(tài)發(fā)生方式愈傷組織器官發(fā)生通過體細(xì)胞胚胎/胚狀體途徑再生植株第二節(jié)愈傷組織中的形態(tài)發(fā)生現(xiàn)在是38頁\一共有70頁\編輯于星期四3.1胚狀體/體細(xì)胞胚（embryoid）：指植物細(xì)胞、組織或器官的離體培養(yǎng)中，起始于一個(gè)非合子細(xì)胞，并經(jīng)過胚胎發(fā)育過程分化出的類似胚一樣的細(xì)胞群。經(jīng)過：球形胚－心形胚－魚雷形胚－成熟胚3體細(xì)胞胚發(fā)生途徑現(xiàn)在是39頁\一共有70頁\編輯于星期四DevelopmentoftheArabidopsisEmbryo現(xiàn)在是40頁\一共有70頁\編輯于星期四

石龍芮胚狀體發(fā)生的過程

現(xiàn)在是41頁\一共有70頁\編輯于星期四香蕉心形體細(xì)胞胚玫瑰心形體細(xì)胞胚現(xiàn)在是42頁\一共有70頁\編輯于星期四現(xiàn)在是43頁\一共有70頁\編輯于星期四3.2體細(xì)胞胚的產(chǎn)生方式1）直接在器官上發(fā)生2）懸浮培養(yǎng)細(xì)胞發(fā)生途徑3）愈傷組織發(fā)生途徑:幼胚、胚和子葉4）單細(xì)胞發(fā)生途徑：花藥培養(yǎng)中的小孢子發(fā)育成4）原生質(zhì)體發(fā)生途徑胚性愈傷組織現(xiàn)在是44頁\一共有70頁\編輯于星期四1）生長素2）其他植物生長物質(zhì)的作用3）氨源形態(tài)的影響4）其他培養(yǎng)條件對胚狀體發(fā)生的影響3.3體細(xì)胞胚狀體誘導(dǎo)的影響因素現(xiàn)在是45頁\一共有70頁\編輯于星期四3.4體細(xì)胞胚狀體誘導(dǎo)的影響因素1）生長素形成體細(xì)胞胚的關(guān)鍵是除去或降低培養(yǎng)基中的生長素成分（如2,4-D）。愈傷組織在生長素0.5～1mg/L的培養(yǎng)基上分化形成分生細(xì)胞團(tuán)（稱胚性細(xì)胞團(tuán)）；轉(zhuǎn)移到生長素含量很低或沒有生長素的培養(yǎng)基上，就能發(fā)育為胚狀體?，F(xiàn)在是46頁\一共有70頁\編輯于星期四原因：2,4-D等生長素可以誘導(dǎo)內(nèi)源乙烯（Eth）產(chǎn)生；內(nèi)源Eth不影響愈傷增殖，但抑制愈傷組織進(jìn)一步分化成胚。乙烯也會(huì)導(dǎo)致纖維素酶或（和）果膠酶活性的增強(qiáng)，從而破壞胚性細(xì)胞團(tuán)，使原胚不能發(fā)生組織分化?，F(xiàn)在是47頁\一共有70頁\編輯于星期四2）其他植物生長物質(zhì)的作用細(xì)胞分裂素有利于胚狀體的形成0.1μg·L-1玉米素促進(jìn)胡蘿卜體細(xì)胞胚發(fā)生。GA3、ABA抑制成胚；現(xiàn)在是48頁\一共有70頁\編輯于星期四3）氨源形態(tài)的影響還原N（NH4+）氧化N（NO3-）有機(jī)氮（氨基酸、水解酪蛋白等）野生胡蘿卜葉柄節(jié)段的培養(yǎng)中，只有在含一定數(shù)量還原態(tài)氮的培養(yǎng)基時(shí)，才能有胚胎發(fā)生，用NH4+

和水解酪蛋白優(yōu)于NO3-

或谷氨酰胺?，F(xiàn)在是49頁\一共有70頁\編輯于星期四4）其他培養(yǎng)條件對胚狀體發(fā)生的影響液體培養(yǎng)適宜pH5-6光照：不需要光或半天光照時(shí)間溫度25℃左右現(xiàn)在是50頁\一共有70頁\編輯于星期四光照強(qiáng)度50-60μEm2s-1光照強(qiáng)度5-10μEm2s-1(圖光對大豆不同品種子葉體細(xì)胞胚發(fā)生的影響)現(xiàn)在是51頁\一共有70頁\編輯于星期四3.4體細(xì)胞胚途徑再生植物的優(yōu)點(diǎn)1）數(shù)量比不定芽多2）獲得速度快3）結(jié)構(gòu)完整4）胚狀體可制成人工種子，便于運(yùn)輸和保存；5）胚狀體的有性后代遺傳性更接近母體植株?，F(xiàn)在是52頁\一共有70頁\編輯于星期四第五章愈傷組織的培養(yǎng)第一節(jié)愈傷組織的誘導(dǎo)和分化第二節(jié)愈傷組織中的形態(tài)發(fā)生第三節(jié)人工種子現(xiàn)在是53頁\一共有70頁\編輯于星期四人工種子是指外面包裹一層有機(jī)薄膜的植物胚狀體。

胚狀體或芽：有生命的物質(zhì)結(jié)構(gòu)。人工胚乳：供胚狀體維持生命力。人工種皮：保護(hù)作用。1定義與結(jié)構(gòu)

第三節(jié)人工種子現(xiàn)在是54頁\一共有70頁\編輯于星期四1）結(jié)構(gòu)完整，體積小，便于貯藏與運(yùn)輸，可直接播種，易于機(jī)械化操作；2）不受季節(jié)限制，不受環(huán)境制約，胚狀體數(shù)量多、繁殖快、有利于工廠化生產(chǎn)；人工種子的優(yōu)點(diǎn):3)有利于繁殖生育周期長、自交不親合、珍貴稀有的一些植物，也可大量繁殖無病毒材料；4)加入抗生素、農(nóng)藥、菌肥等成分，提高人工種子活力和品質(zhì)；5)由無性繁殖體系產(chǎn)生胚，固定雜種優(yōu)勢?，F(xiàn)在是55頁\一共有70頁\編輯于星期四2制作人工種子制作過程胚狀體人工胚乳其他物質(zhì)人工種皮包埋技術(shù)現(xiàn)在是56頁\一共有70頁\編輯于星期四第一步胚狀體誘導(dǎo)1）選取目標(biāo)植物2）誘導(dǎo)愈傷組織3）愈傷組織增生4）胚狀體誘導(dǎo)現(xiàn)在是57頁\一共有70頁\編輯于星期四胚狀體同步增殖：DNA合成抑制劑低溫處理調(diào)節(jié)滲透壓分離過篩調(diào)節(jié)植物激素配比現(xiàn)在是58頁\一共有70頁\編輯于星期四第二步人工胚乳制作人工胚乳的成分無機(jī)鹽混合物碳水化合物：淀粉和糖蛋白質(zhì)各種附加成分：如固氮細(xì)菌、殺蟲劑、殺菌劑、除草劑和植物激素等現(xiàn)在是59頁\一共有70頁\編輯于星期四第三步人工種皮制作1）包埋介質(zhì)的選擇：無毒、透氣、保水性好有足夠硬度（不脹大），保證安全（不泄露營養(yǎng)物）包埋材料：瓊脂、瓊脂糖、藻酸鹽、明膠、淀粉、動(dòng)物膠、角叉膠、刺槐豆膠、阿拉伯樹膠、果膠、蛋白膠、黃芪膠等種類?，F(xiàn)在是60頁\一共有70頁\編輯于星期四2）包埋技術(shù)

用褐藻酸鈉等水溶性凝膠經(jīng)與Ca2+進(jìn)行離子交換后凝固，用于包