細(xì)胞培養(yǎng)概述2010918課件

林紅五臺校區(qū)1號教學(xué)樓147室細(xì)胞培養(yǎng)概述內(nèi)容細(xì)胞培養(yǎng)基本理論細(xì)胞培養(yǎng)基本要求（無菌操作)細(xì)胞培養(yǎng)基本技術(shù)第一部分細(xì)胞培養(yǎng)基本理論細(xì)胞培養(yǎng)概述細(xì)胞培養(yǎng)簡史細(xì)胞類型及其形態(tài)生長特點(diǎn)和生長過程醫(yī)學(xué)中泛指的體外培養(yǎng)（InVitro）

細(xì)胞培養(yǎng)（cellculture）模擬機(jī)體內(nèi)生理?xiàng)l件，將細(xì)胞從機(jī)體中取出，在人工條件下使其生存、生長、繁殖和傳代，進(jìn)行細(xì)胞生命過程、細(xì)胞癌變、細(xì)胞工程等問題的研究。群體培養(yǎng)（massculture）

將大量細(xì)胞置于培養(yǎng)瓶中，讓其貼壁或懸浮生長，形成均勻的單層細(xì)胞或單細(xì)胞懸液。

克隆培養(yǎng)（cloneculture）

即將少數(shù)的細(xì)胞加入培養(yǎng)瓶中，貼壁后彼此間隔距離較遠(yuǎn)，經(jīng)過繁殖每一個(gè)細(xì)胞形成一個(gè)集落，稱為克隆。ht-1080人皮膚纖維肉瘤細(xì)胞株組織培養(yǎng)（tissueculture）

指把活體的組織取出，分成小塊，直接置于培養(yǎng)瓶底或通過膠原纖維血漿支持物的培養(yǎng)瓶底來進(jìn)行培養(yǎng)。特點(diǎn)：

組織不失散，細(xì)胞保持原有的組織關(guān)系。形成生長(cutgrowth)或形成由扁薄細(xì)胞構(gòu)成的單層細(xì)胞培養(yǎng)物。在體外生長時(shí)，細(xì)胞間呈相互依存、互相影響的關(guān)系。器官培養(yǎng)（organculture）將活體中器官或器官一部分取出，在體外生長、生存，并使其保持器官原有的結(jié)構(gòu)和功能特征的培養(yǎng)。特點(diǎn)：培養(yǎng)的器官在合適的條件下能生長和分化，存活數(shù)周或1年。觀察受限，只能用組織切片的方法觀察或用透射電鏡、掃描電鏡觀察。細(xì)胞培養(yǎng)定義優(yōu)點(diǎn)：1．活細(xì)胞：同時(shí)、大量、均一性、重復(fù)性；2．可控制：各種物理、化學(xué)、生物等因素可調(diào)控；3．研究方法多樣：倒置、熒光、電子、激光共焦顯微鏡、流式細(xì)胞術(shù)、免疫組織化學(xué)、原位雜交、同位素標(biāo)記；4．應(yīng)用廣：不同物種、年齡、組織，正?；虍惓＃[瘤）；缺點(diǎn)：人工所模擬的條件與體內(nèi)實(shí)際情況仍不完全相同；當(dāng)細(xì)胞被置于體外培養(yǎng)后，生活在缺乏動態(tài)平衡的環(huán)境中，時(shí)間久了，必然發(fā)生變化。

動物細(xì)胞體外培養(yǎng)的歷史可追溯到1907年，美國生物學(xué)家Harrison在無菌條件下，以淋巴液為培養(yǎng)基成功地在試管中培養(yǎng)了蛙胚神經(jīng)組織達(dá)數(shù)周，創(chuàng)立了體外組織培養(yǎng)法。在隨后的近一個(gè)世紀(jì)里，隨著細(xì)胞生物學(xué)、培養(yǎng)系統(tǒng)及培養(yǎng)方法等領(lǐng)城的不斷豐富和完善，動物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)得到了很大的發(fā)展。發(fā)展至今已成為生物、醫(yī)學(xué)研究和應(yīng)用中廣泛采用的技術(shù)方法，利用動物細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)具有重要醫(yī)用價(jià)值的酶、生長因子、疫苗和單抗等，已成為醫(yī)藥生物高技術(shù)產(chǎn)業(yè)的重要部分。大規(guī)模動物細(xì)胞培養(yǎng)在生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)化進(jìn)程中顯示出強(qiáng)大的潛力。細(xì)胞培養(yǎng)簡史Historicaleventsinthedevelopmentofcellculture1878:ClaudeBernardproposedthatphysiologicalsystemsofanorganismcanbemaintainedinalivingsystemafterthedeathofanorganism.1885:Rouxmaintainedembryonicchickcellsinasalineculture.1897:Loebdemonstratedthesurvivalofcellsisolatedfrombloodandconnectivetissueinserumandplasma.1903:Jollyobservedcelldivisionofsalamanderleucocytesinvitro.1907:Harrisoncultivatedfrognervecellsinalymphclotheldbythe'hangingdrop'methodandobservedthegrowthofnervefibersinvitroforseveralweeks.Hewasconsideredbysomeasthefatherofcellculture.1910:Burrowssucceededinlongtermcultivationofchickenembryocellinplasmaclots.Hemadedetailedobservationofmitosis.Contd..1940s:Theuseoftheantibioticspenicillinandstreptomycininculturemediumdecreasedtheproblemofcontaminationincellculture.1948:EarleisolatedmouseLfibroblastswhichformedclonesfromsinglecells.Fischerdevelopedachemicallydefinedmedium,CMRL1066.1952:GeyestablishedacontinuouscelllinefromahumancervicalcarcinomaknownasHeLa(HelenLane)cells.Dulbeccodevelopedplaqueassayforanimalvirusesusingconfluentmonolayersofculturedcells.1954:Abercrombieobservedcontactinhibition:motilityofdiploidcellsinmonolayercultureceaseswhencontactismadewithadjacentcells.1955:Eaglestudiedthenutrientrequirementsofselectedcellsincultureandestablishedthefirstwidelyusedchemicallydefinedmedium.1961:HayflickandMoorheadisolatedhumanfibroblasts(WI-38)andshowedthattheyhaveafinitelifespaninculture.1964:LittlefieldintroducedtheHATmediumforcellselection.1965:Hamintroducedthefirstserum-freemediumwhichwasabletosupportthegrowthofsomecells.Contd..1965:HarrisandWatkinswereabletofusehumanandmousecellsbytheuseofavirus.1975:KohlerandMilsteinproducedthefirsthybridomacapableofsecretingamonoclonalantibody.1978:Satoestablishedthebasisforthedevelopmentofserum-freemediafromcocktailsofhormonesandgrowthfactors.1982:Humaninsulinbecamethefirstrecombinantproteintobelicensedasatherapeuticagent.1985:Humangrowthhormoneproducedfromrecombinantbacteriawasacceptedfortherapeuticuse.1986:LymphoblastoidγIFNlicensed.1987:Tissue-typeplasminogenactivator(tPA)fromrecombinantanimalcellsbecamecommerciallyavailable.1989:Recombinanterythropoietinintrial.1990:Recombinantproductsinclinicaltrial(HBsAG,factorVIII,HIVgp120,CD4,GM-CSF,EGF,mAbs,IL-2).細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展細(xì)胞的多形性

細(xì)胞形態(tài)上表現(xiàn)為多種多樣，如呈圓形、橢圓形、正方形、柱形、扁平形、梭形、星形和多邊形等。此外，有些細(xì)胞如吞噬細(xì)胞沒有固定的形態(tài)。由不同生長方式造成的差異

呈懸浮生長時(shí)，因生長在液體環(huán)境中，胞內(nèi)滲透壓高于周圍液體環(huán)境，因此胞體基本呈圓形。呈貼附于支持物上生長的細(xì)胞，開始為圓形，很快過渡成扁平形，并逐漸恢復(fù)至原先的細(xì)胞形態(tài)。細(xì)胞來源成纖維型細(xì)胞（Fibroblast-likedcells）上皮型細(xì)胞（Epithelium-likedcells）其它，不定型細(xì)胞培養(yǎng)的形態(tài)與結(jié)構(gòu)上皮細(xì)胞

來源于皮膚及其衍生物、乳腺、肝、消化道上皮等組織的細(xì)胞，由上皮性腫瘤(鱗狀細(xì)胞癌)等的培養(yǎng)的細(xì)胞均呈上皮樣。形態(tài)為扁平的多角形，胞質(zhì)近中央處有圓形的細(xì)胞核。細(xì)胞緊密相靠、互相銜接成片，極性不明顯。口腔上皮細(xì)胞細(xì)胞生長方式和類型按生長方式貼壁型細(xì)胞（Monolayercells）懸浮型細(xì)胞（Suspensioncells）絕大多數(shù)有機(jī)體細(xì)胞屬貼壁型細(xì)胞，只有少數(shù)細(xì)胞類型如某些腫瘤細(xì)胞和白細(xì)胞可在懸浮狀態(tài)下生長。按細(xì)胞形態(tài)(貼壁細(xì)胞）成纖維型細(xì)胞（Fibroblast-likedcells）上皮型細(xì)胞（Epithelium-likedcells）其它，不定型處于體外培養(yǎng)狀態(tài)下的貼附生長型細(xì)胞在形態(tài)上表現(xiàn)單一而失去了在體內(nèi)原有的某些特征。形態(tài)各異反映其胚層起源。如來源于內(nèi)外胚層的細(xì)胞多呈上皮型；來自中胚層的則易呈成纖維細(xì)胞型。成纖維型細(xì)胞皮型細(xì)胞游走型細(xì)胞多形型細(xì)胞貼壁型生長細(xì)胞或錨著依存性細(xì)胞（anchorage-dependentcells）生長方式和類型成纖維型細(xì)胞胞體呈梭形或不規(guī)則三角形，中央有卵圓形核，胞質(zhì)向外伸出2～3個(gè)長短不同的突起，細(xì)胞呈放射狀、火焰狀或漩渦狀生長。生長方式和類型上皮型細(xì)胞胞體呈扁平不規(guī)則多角形，中有圓形核，細(xì)胞緊密相連成單層膜。生長方式和類型游走型細(xì)胞在支持物上散在生長，胞質(zhì)經(jīng)常伸出偽足或突起，呈活躍的游走或變形運(yùn)動，運(yùn)動速度快而不規(guī)則，細(xì)胞形態(tài)不穩(wěn)定，有時(shí)難以與其他型細(xì)胞相區(qū)別。生長方式和類型多形型細(xì)胞由于難以確定其形態(tài)而得名。如吞噬細(xì)胞常屬此類。生長方式和類型懸浮型生長細(xì)胞由于懸浮在培養(yǎng)液中生長，生存空間大，可維持對數(shù)生長期，也允許長時(shí)間生長，傳代繁殖方便，能繁殖更多細(xì)胞，飽和度大，可達(dá)高密度，適合大量生產(chǎn)，有工業(yè)應(yīng)用價(jià)值。傳代時(shí)只需稀釋，無需消化處理，易于收獲，便于做細(xì)胞代謝等研究。更多精彩圖片請上網(wǎng)搜索，如“生物秀”。細(xì)胞培養(yǎng)的形態(tài)與結(jié)構(gòu)細(xì)胞的形態(tài)與培養(yǎng)條件的關(guān)系初代培養(yǎng)的正常二倍體細(xì)胞，除大體形態(tài)外，其構(gòu)造和生物學(xué)性狀與原體內(nèi)細(xì)胞極相近，細(xì)胞均質(zhì)性和透明度都很強(qiáng)。若隨體外培養(yǎng)時(shí)間延長及反復(fù)傳代，細(xì)胞會出現(xiàn)輪廓增強(qiáng)、核仁增多，甚至出現(xiàn)雙核或多核等變化。細(xì)胞培養(yǎng)的形態(tài)與結(jié)構(gòu)細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的觀察（電鏡）三層膜結(jié)構(gòu)、脂質(zhì)雙分子層由微絲、微管構(gòu)成的骨架系統(tǒng)CSS線粒體、溶酶體、高爾基復(fù)合體、中心體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)有雙層結(jié)構(gòu)的核膜，核內(nèi)有一個(gè)或數(shù)個(gè)核仁，也能看到核孔細(xì)胞培養(yǎng)的形態(tài)與結(jié)構(gòu)用普通顯微鏡觀察，細(xì)胞功能健康活躍時(shí)，呈現(xiàn)均質(zhì)而透明的，結(jié)構(gòu)極不明顯。用相差顯微鏡觀察，可看清細(xì)胞的輪廓和內(nèi)部結(jié)構(gòu)。用固定染色法和特殊技術(shù)可顯示細(xì)胞器等結(jié)構(gòu)。觀察正常情況下的細(xì)胞用anti-vimentin和TRITC染中間絲vimentin蛋白（紅色），F(xiàn)ITC-Phalloidin染F-actin（綠色），DAPI染核（藍(lán)色）。（熒光顯微鏡40X）細(xì)胞培養(yǎng)的形態(tài)與結(jié)構(gòu)一般顯微鏡下細(xì)胞輪廓會增強(qiáng)，反差增大。用相差顯微鏡可看到在胞質(zhì)中出現(xiàn)顆粒、脂滴和空泡等，反差很大的暗色小顆粒是變形的線粒體。觀察功能不良的細(xì)胞四貼壁型細(xì)胞的生長特點(diǎn)貼壁型細(xì)胞的生長特點(diǎn)貼附和伸展接觸抑制生長的密度限制貼附和伸展（attachedandstrench)多數(shù)體外培養(yǎng)細(xì)胞的基本生長特點(diǎn)。

接觸抑制（Contactinhibition）細(xì)胞相互接觸時(shí)，將停止增長；細(xì)胞停留在細(xì)胞周期的G0期；正常細(xì)胞并不互相重疊生長，但轉(zhuǎn)化的細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞卻可以繼續(xù)生長導(dǎo)致細(xì)胞重疊堆積生長。生長的密度限制（DensityInhibition）

（又稱：密度依賴性調(diào)節(jié)）

正常細(xì)胞接觸匯合成單層后，雖發(fā)生接觸抑制，只要營養(yǎng)充分，細(xì)胞仍然能夠進(jìn)行增殖分裂，因此細(xì)胞數(shù)量仍在增多。但當(dāng)細(xì)胞密度進(jìn)一步增大，培養(yǎng)液中營養(yǎng)成分減少，代謝產(chǎn)物增多時(shí)，細(xì)胞因營養(yǎng)的枯竭和代謝物的影響，則發(fā)生密度抑制導(dǎo)致細(xì)胞分裂停止。而轉(zhuǎn)化細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞的密度依賴性調(diào)節(jié)常常降低，能生長至較高的終末細(xì)胞密度。生長過程單個(gè)細(xì)胞的生長過程——細(xì)胞周期（cellcycle）細(xì)胞系的生長過程——培養(yǎng)細(xì)胞的生命周期（LifeSpanofCultureCells）每代細(xì)胞的生長過程細(xì)胞系的生長過程原代培養(yǎng)（初代培養(yǎng)）期傳代期衰退（老）期原代培養(yǎng)（PrimaryCulture）期也稱初代培養(yǎng)。即從體內(nèi)取出組織按種培養(yǎng)到第一次傳代階段，一般持續(xù)1~4周。此期細(xì)胞呈活躍的移動，可見細(xì)胞分裂，但不旺盛。初代培養(yǎng)細(xì)胞與體內(nèi)原組織在形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能活動上相似性大。細(xì)胞群是異質(zhì)的（Heterogeneous），也即各細(xì)胞的遺傳性狀互不相同，細(xì)胞相互依存性小。如把這種細(xì)胞群稀釋分散成單細(xì)胞，在軟瓊脂培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，細(xì)胞克隆形成率（CloningEfficiency）很低，即細(xì)胞獨(dú)立生存性差。

原代培養(yǎng)

（primary

culture）從動物機(jī)體取出的進(jìn)行培養(yǎng)的細(xì)胞群。生長緩慢，繁殖一定的代數(shù)后（一般10代以內(nèi)）停止生長。

克?。╟lone）亦稱無性繁殖系或無性系。對細(xì)胞來說，克隆是指由同一個(gè)祖先細(xì)胞通過有絲分裂產(chǎn)生的遺傳性狀一致的細(xì)胞群。

細(xì)胞系（cell

line）從腫瘤組織培養(yǎng)建立的細(xì)胞群或培養(yǎng)過程中發(fā)生突變或轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，在培養(yǎng)條件下可無限繁殖

細(xì)胞株（cell

strain）從原代培養(yǎng)細(xì)胞群中篩選出的具有特定性質(zhì)或標(biāo)志的細(xì)胞群，能夠繁殖50代左右，在培養(yǎng)過程中其特征始終保持。原代培養(yǎng)期與細(xì)胞系

TheAmericanTypeCultureCollection(ATCC)ATCC（AmericanTypeCultureCollection）為美國典型培養(yǎng)物保藏中心，是世界上最大的﹑保存生物種類和數(shù)量最多的機(jī)構(gòu)，保存微生物﹑藻類、原生動物、細(xì)胞株等約29000株。細(xì)胞株價(jià)格一般在4000人民幣/株左右，一般1到2個(gè)月到貨，基本上以凍存管的形式提供。TheEuropeanCollectionofAnimalCellCulture(ECACC)NationalInstituteofHealth(NIH),USANationalCancerInstitute(NCI),USA細(xì)胞系資源傳代培養(yǎng)期（Passage）在培養(yǎng)條件較好情況下，細(xì)胞增殖旺盛，并能維持二倍體核型，呈二倍體核型的細(xì)胞稱二倍體細(xì)胞系（DiploidCellLine）。細(xì)胞應(yīng)在初代培養(yǎng)期或傳代后早期凍存。一般情況下當(dāng)傳代10～50次左右，細(xì)胞增殖逐漸緩慢，以至完全停止，細(xì)胞進(jìn)入衰退期。體外培養(yǎng)的細(xì)胞增殖能力不是無限的，傳代次數(shù)有一定的界限，稱為“Hayflick極限”。傳代次數(shù)與物種壽命有關(guān)：小鼠壽命3年，傳代12次；龜壽命200年，傳代140次。傳代次數(shù)與個(gè)體年齡成反比：人胚胎，40-60代；幼年，20-40代；成年，10-30代；早老病兒童，2-10代。

細(xì)胞傳代次數(shù)（PassageNumber）衰退（老）期（senescence）一般有限細(xì)胞系在此期的細(xì)胞增殖緩慢，并逐