植物細胞懸浮培養(yǎng)課件

植物細胞培養(yǎng)制藥意義 藥用植物是天然藥物的寶庫

植物細胞培養(yǎng)是生產(chǎn)藥物的可能途徑目前采用植物細胞培養(yǎng)生產(chǎn)的藥物主要包括

（1）苷（甙）類：包括皂苷（人參皂苷、三七皂苷、柴胡皂苷、著芋皂苷等）、強心苷（強心醇苷、毛地黃毒配質(zhì)衍生物等）、甘草甜苷、香豆精苷等。（2）甾醇：包括菜油甾醇、豆甾醇、谷甾醇、膽甾醇、異巖藻甾醇等。

強心苷類（側(cè)鏈為不飽和內(nèi)酯環(huán)）甾醇（3）生物堿：吡啶、喹啉、異喹啉等。（4）醌類：包括蒽醌、萘醌等。（5）蛋白質(zhì)類：胰島素、氨基酸、蛋白酶抑制劑。植物病毒抑制劑、植物抗生素等。（6）黃酮類：具有C6-C3-C6結(jié)構(gòu)，生物合成前體是苯丙氨酸和丙二酸單酰輔酶A。多為治理心血管疾病和高血壓的藥物成分。小檗堿蒽醌黃酮利用途徑生產(chǎn)次生代謝產(chǎn)物的優(yōu)點不受季節(jié)、環(huán)境、病蟲害影響.不占耕地，適用于貧瘠的地方代謝產(chǎn)物生產(chǎn)可以在可控條件下進行,可以通過細胞株篩選、特定生物轉(zhuǎn)化途徑與代謝調(diào)控提高目標產(chǎn)物含量.技術(shù)路線

目標植物選擇→愈傷組織誘導→→液體培養(yǎng)→→培養(yǎng)條件的優(yōu)化→→反應(yīng)器擴大培養(yǎng)→愈傷組織誘導→→固體、液體培養(yǎng)→→高產(chǎn)細胞系篩選→→生物合成途徑的研究→器官分化（發(fā)狀根）→→固體液體培養(yǎng)條件的優(yōu)化→→反應(yīng)器擴大培養(yǎng)→→有效成分提取、分離植物細胞培養(yǎng)是在離體條件下，將分離的植物細胞通過繼代培養(yǎng)增殖，獲得大量細胞群體的一種技術(shù)。是人工種子、原生質(zhì)體培養(yǎng)、花藥培養(yǎng)等的支撐技術(shù)。培養(yǎng)類型按培養(yǎng)對象來說，可分為原生質(zhì)體培養(yǎng)和單細胞培養(yǎng)；按培養(yǎng)基類型可分為固體培養(yǎng)和液體培養(yǎng)；按培養(yǎng)方式可分為懸浮細胞培養(yǎng)和固定化細胞培養(yǎng)。植物單細胞分離和初步培養(yǎng)單細胞獲得：機械法；酶解法；愈傷組織法單細胞培養(yǎng)：平板培養(yǎng)(platingculture)看護培養(yǎng)法（nursingculture)飼養(yǎng)層培養(yǎng)(feedinglayerculture)單細胞分離方法機械法具體做法：將葉片輕輕研碎、過濾離心、收集凈化從未分化的疏松易碎的愈傷組織，通過搖床振蕩獲得分散的單細胞或小細胞團優(yōu)點：細胞不受酶傷害；有利于進行細胞的生理和生化研究。細胞平板培養(yǎng)（platingculture)指將一定密度的懸浮細胞接種到一薄層固體培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)的技術(shù)。Bergman(1960)首創(chuàng)單細胞的分離：一般采用酶分離法，小細胞團不能超過6個細胞。單細胞懸浮液的制備：分離的單細胞經(jīng)培養(yǎng)基洗滌2次以后，調(diào)整密度為5×103個/毫升植板：將1份已調(diào)整好密度的單細胞懸浮液與4份35℃的固體培養(yǎng)基充分混合均勻，然后均勻地平鋪于培養(yǎng)皿中，其厚度為5mm左右。細胞平板培養(yǎng)（platingculture)平板培養(yǎng)的效果一般用植板率來衡量。植板率是能長出細胞團的單細胞在接種單細胞總和中所占的比例。每個平板形成的細胞團數(shù)植板率＝每個平板接種的細胞總數(shù)細胞平板培養(yǎng)（platingculture)優(yōu)點： ①單細胞在培養(yǎng)基中分布均勻，便于在顯微鏡下對細胞進行定點觀察，是單細胞株篩選和突變體篩選的常用方法。 ②由于它具有篩選效率高、篩選量大、操作簡便等優(yōu)點，被廣泛應(yīng)用于細胞分裂、分化、生理生化、遺傳變異、次生代謝產(chǎn)物合成等。缺點：通氣狀況不好，排泄物質(zhì)易積累造成毒害或影響組織吸收?？醋o培養(yǎng)（nurseculture）Muir(1953)首創(chuàng)此法獲得煙草單細胞體系。優(yōu)點：簡便易行，效果好。缺點：不能在顯微鏡下追蹤細胞分裂、生長過程。微室培養(yǎng)(microchamberculture)在人工制造的無菌小室中，將一滴懸浮細胞液培養(yǎng)在少量培養(yǎng)基上，使其分裂增殖形成細胞團的方法。由Jones等在1960年設(shè)計的。優(yōu)點：可對培養(yǎng)細胞連續(xù)進行顯微觀察，了解一個細胞的生長、分裂、分化等過程缺點：培養(yǎng)基少，營養(yǎng)和水分難以保持，pH變動幅度大，培養(yǎng)細胞僅能短期分裂。細胞起始密度：30～80個/室。雙層濾紙植板培養(yǎng)Horsch等（1980）建立培養(yǎng)皿培養(yǎng)基飼養(yǎng)細胞層培養(yǎng)細胞看護濾紙轉(zhuǎn)移濾紙固體培養(yǎng)固體培養(yǎng)是在培養(yǎng)基中加入一定量的凝固劑，經(jīng)加熱溶解后，分別裝入培養(yǎng)用的容器中，冷卻后凝結(jié)成固體培養(yǎng)基。優(yōu)缺點簡便易行、所占空間小生長的不平衡，易出現(xiàn)極化現(xiàn)象易堆積生長過程中排出的有害物質(zhì)有些生理生化指標測定不方便常用的固化劑瓊脂、明膠（10%）等液體培養(yǎng)1．成批培養(yǎng)法batchculture細胞和培養(yǎng)基一次性加入到培養(yǎng)容器或生物反應(yīng)器內(nèi)進行培養(yǎng),在培養(yǎng)過程中培養(yǎng)液體積不變,不添加營養(yǎng)成分,待細胞增長和產(chǎn)物積累到適當?shù)臅r間,一次性收獲細胞、產(chǎn)物和培養(yǎng)液的培養(yǎng)方法.2.半連續(xù)培養(yǎng)法semi-continuousculture重復(fù)分批式培養(yǎng)或換液培養(yǎng).在細胞增長和產(chǎn)物形成過程中,每間隔一段時間從中取出部分培養(yǎng)液或細胞,剩余的細胞作為種子,再用新的培養(yǎng)液補足到原體積,使生物反應(yīng)器內(nèi)的總體積不變.特點:細胞可持續(xù)指數(shù)生長,并可保持產(chǎn)物和細胞在一較高的濃度水平,培養(yǎng)過程中可延續(xù)很長時間.可進行多次收獲.操作簡便,生產(chǎn)效率高.3．連續(xù)培養(yǎng)法(continuousculture)連續(xù)培養(yǎng)法是在細胞達最大密度之前，以一定速度向生物反應(yīng)器連續(xù)添加新鮮培養(yǎng)基，同時含有細胞的培養(yǎng)液以相同的速度連續(xù)從生物反應(yīng)器流出，以保持培養(yǎng)體積恒定的培養(yǎng)方式。該法的理論基礎(chǔ)是根據(jù)Monod公式，即生長速度取決于基質(zhì)的濃度。μ＝μmax·S/(Ks+S) μ=特定生長速度；μmax=特定最大生長速度；Ks=飽和系數(shù)；S=基質(zhì)濃度兩階段連續(xù)培養(yǎng)法于第一反應(yīng)器中投入生長培養(yǎng)基并連續(xù)加入該培養(yǎng)基，而于第二反應(yīng)器中投入生產(chǎn)培養(yǎng)基。

懸浮培養(yǎng)（Suspensionculture）懸浮培養(yǎng)是細胞培養(yǎng)的基本方法，是將單個游離細胞或小細胞團在液體培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)增殖的技術(shù)。特點1.培養(yǎng)細胞可不斷增殖，且生長速度快。2.液體狀態(tài)下便于細胞和營養(yǎng)物質(zhì)的充分接觸和交換，細胞狀態(tài)可以相對保持一致。細胞懸浮培養(yǎng)的建立愈傷組織的誘導懸浮系的建立與繼代培養(yǎng)懸浮細胞的生長動態(tài)懸浮細胞同步化愈傷組織的誘導選擇適宜的外植體：幼胚、下胚軸、子葉。選擇適宜的培養(yǎng)基：較高激素濃度；必要的附加物質(zhì)。要求：松散性好、增殖快、再生能力強。其外觀一般是色澤呈鮮艷的乳白或淡黃色，呈細小顆粒狀，疏松易碎懸浮系的建立與培養(yǎng)callus150~250mlflaskcentrifugeisolationsubculture1g/10mlmedium100~120rmpculturetransfer1time/3d80rpm成功的懸浮細胞培養(yǎng)體系特征懸浮培養(yǎng)分散性良好，細胞團較小，一般在30～50個細胞以下。均一性好，細胞形狀和細胞團大小大致相同。懸浮系外觀為大小均一的小顆粒，培養(yǎng)基清澈透亮，細胞色澤呈鮮艷的乳白或淡黃色。細胞生長迅速，懸浮細胞的生長量一般2～3天便可增加一倍。懸浮細胞的生長動態(tài)懸浮細胞生長的衡量根據(jù)不同培養(yǎng)時間的細胞數(shù)變化，或細胞質(zhì)量變化。生長速率(p)：不同時間細胞密度(x)的自然對數(shù)與起始密度(x0)的自然對數(shù)之差與培養(yǎng)時間(t)的比值 p＝(lnx-lnx0)/t鮮重：真空減壓過濾后稱重，反應(yīng)細胞生長情況干重：鮮細胞烘干至衡重，反應(yīng)細胞質(zhì)量影響懸浮細胞生長的因素起始愈傷組織的質(zhì)量接種細胞密度：懸浮細胞的起始密度一般在0.5~2.5×105個細胞/毫升。接種初期的細胞密度過低往往使延遲期加長。最低有效密度：即能使細胞分裂、增殖的最低接種量。培養(yǎng)條件：培養(yǎng)基、方式、溫度、繼代周期。影響懸浮細胞生長的因素培養(yǎng)基應(yīng)用條件培養(yǎng)基（生長過愈傷組織或懸浮細胞的液體培養(yǎng)基）提供單細胞生長和分裂所需的特殊代謝物。基本培養(yǎng)基成分的調(diào)節(jié)視不同的培養(yǎng)目的而定培養(yǎng)基設(shè)計時,一般均以誘導愈傷組織形成的培養(yǎng)基為基礎(chǔ)進行調(diào)整。常用的培養(yǎng)基有MS、B5、LS、N6等。植物激素和其他附加成分的應(yīng)用。影響懸浮細胞生長的因素培養(yǎng)方式：搖瓶，反應(yīng)器（氣動式、攪拌式）；分批培養(yǎng)，半連續(xù)培養(yǎng)和連續(xù)培養(yǎng)溫度25℃繼代周期指具有一定起始密度的細胞,從開始培養(yǎng)到細胞數(shù)目和總重量增長停止的一個過程。培養(yǎng)周期的長短是由起始細胞密度、延遲期的長短、生長速率等決定。繼代培養(yǎng)（Subculture）：繼初代培養(yǎng)之后的連續(xù)數(shù)代的擴繁殖培養(yǎng)過程。懸浮培養(yǎng)細胞的同步化細胞同步化：同一懸浮培養(yǎng)體系的所有細胞都同時通過細胞周期的某一特定時期。植物細胞在懸浮培養(yǎng)中容易團聚并進入不同程度的分化狀態(tài)，因此，要達到完全同步化是十分困難的。同一培養(yǎng)體系的植物細胞經(jīng)常不能處于同一細胞周期，這種差異使懸浮細胞分裂、代謝以及生理生化狀態(tài)等復(fù)雜化。通過一定的理化措施可以使同一體系中的細胞達到相對同步化。什么措施？細胞周期饑餓法饑餓導致的細胞分裂受阻常常是使細胞不能合成DNA，即不能進入S期，或細胞分裂不能進行，即不能進入M期。因此，通過饑餓法可以獲得處于G1和G2期的同步化細胞。氮饑餓時，通常獲得G1期的同步化細胞磷和碳饑餓時，獲得G1和G2期的同步化細胞。將饑餓細胞轉(zhuǎn)入完整培養(yǎng)基中繼代培養(yǎng)時，細胞分裂又可重新恢復(fù)。抑制劑法通過一些DNA合成抑制劑處理細胞，使細胞滯留在DNA合成前期，當解除抑制后，即可獲得處于同一細胞周期(G1)的同步化細胞。常用抑制劑主要有5-氟脫氧尿苷(FudR)和羥基尿(HU)。用羥基尿處理獲得同步化細胞的方法在小麥、玉米、西芹等植物細胞培養(yǎng)中已有成功應(yīng)用。利用破壞微管的藥物將細胞阻斷在中期，常用的藥物有秋水仙素和秋水仙酰胺，后者毒性較小。分選法依據(jù)：細胞體積大小方法常規(guī)分選方法是梯度離心精細的分選可采用流式細胞儀優(yōu)點操作簡單分選細胞維持了自然生長狀態(tài)，不會有其它處理帶來的副作用缺點分選精細度較差低溫處理可以提高培養(yǎng)體系中細胞同步化的程度Okamura等曾采用此方法使胡蘿卜懸浮細胞較好地同步化。梅興國等（2001）采用6℃低溫處理紅豆杉細胞也獲得較明顯同步化效果?？赡艿脑虿煌臏囟葘毎挠薪z分裂有極明顯的影響，在一定范圍內(nèi)，溫度下降使細胞分裂速度減慢，細胞周期延長，從而相應(yīng)地延長了分裂期的時間，使分裂指數(shù)提高，細胞同步化率升高。固定化培養(yǎng)法（cellimmobilizationculture)將細胞限制或定位于特定空間位置的培養(yǎng)技術(shù)稱為細胞固定化培養(yǎng)。固定化培養(yǎng)方法:吸附\交聯(lián)\共價結(jié)合\包埋①吸附固定化②離子/共價交聯(lián)法③共價結(jié)合法④包埋法微囊化、凝膠包埋與懸浮培養(yǎng)相比，固定化培養(yǎng)的優(yōu)點：①提高了藥物的合成、積累；②能長時間保持細胞活力；③可以反復(fù)使用；④抗剪切能力強；⑤耐受有毒前體物質(zhì)的濃度高；⑥遺傳性狀較穩(wěn)定；⑦后處理難