雙向電泳的操作課件

雙向電泳的操作2007-7-4步驟樣品制備（Samplepreparation）固相pH梯度膠條的水化（IPGstriprehydration）第一向等電聚焦（IEF）第一向膠條的平衡（IPGstripequilibration）第二向SDS電泳（SDS）檢測染色（Detection/Staining）蛋白點的挖取，收集質(zhì)譜分析總的策略一般性原則

盡可能的提高樣品蛋白的溶解度，抽提最大量的總蛋白，減少蛋白質(zhì)的損失減少對蛋白質(zhì)的人為修飾破壞蛋白質(zhì)與其他生物大分子的相互作用，并使蛋白質(zhì)處于完全變性狀態(tài)樣品制備需要的試劑

離液劑(chaotropes):

尿素（Urea）和硫脲（thiourea）表面活性劑（sufactants）也稱去垢劑：

NP-40、TritonX-100等非離子去垢劑CHAPS與Zwittergent系列等雙性離子去垢劑還原劑（reducingagents）二硫蘇糖醇（DTT）二硫赤蘚糖醇（DTE）磷酸三丁酯（TBP）選擇性的加入

Tris-base蛋白酶抑制劑（如EDTA、Pefablocproteaseinhibitor、PMSForProteaseinhibitorcocktails）核酸酶常用裂解液UreaThioureaCHAPSDTTPharmalytepH3-10Tris-BasePefablocproteaseinhibitor1%SDS樣品制備程序

培養(yǎng)細胞（culturecell）樣品處理方法（1）培養(yǎng)細胞的收集；（2）用磷酸緩沖液（PBS）洗細胞3次（室溫，1000g，各2min）；（3）將細胞分裝到1.5mlEppendof管中，吸干殘留的PBS；（4）加入裂解緩沖液（1.5x106個細胞大約加入100μL裂解液），在室溫振蕩1h，使其充分溶解；（5）4℃，40,000g，離心1h；（6）吸取上清并用Brandford法定量蛋白，然后分裝至Eppendof管里保存在-78℃?zhèn)溆谩＝M織樣品處理方法

三氯醋酸－丙酮沉淀法（TCA/acetoneprecipitation）超速離心法BACK加樣品水化加樣品水化BACKIEF限流50uA200V1hr500V1hr1000V1hr8000V30mingradient8000V5hr(40000Vh)500V維持BACK第二向SDS電泳（SDS）BACK2-DE膠蛋白質(zhì)點的檢測

1）考馬斯亮蘭染色法；2)銀染法；3）負染法；4）熒光染色法；5）放射性同位素標(biāo)記法?？捡R斯亮蘭染色法經(jīng)典的考馬斯亮蘭染色（R-250）局限：靈敏度低（≈1μgprotein/spot）Neuhoff膠體考染法優(yōu)點：背景低，靈敏度高，可達到200ngprotein/spot熱考馬斯亮蘭染色及二次染色法.SYPRORuby