酶的生產(chǎn)與分離純化瑤瑤課件

酶的生產(chǎn)與分離純化

1酶的生產(chǎn)組織提取發(fā)酵生產(chǎn)化學(xué)及生物合成2集中壟斷，市場(chǎng)全球化：丹麥諾和諾得公司（諾維信novozymes）美國(guó)杰能科（Genencor）、芬蘭科特和丹麥丹尼斯克國(guó)際趨勢(shì)3酶的發(fā)酵生產(chǎn)：經(jīng)過(guò)預(yù)先設(shè)計(jì)，通過(guò)人工操作控制，利用細(xì)胞的生命活動(dòng)，產(chǎn)生人們所需要酶的過(guò)程5能用于酶發(fā)酵生產(chǎn)的細(xì)胞需具備如下幾個(gè)條件：（1）產(chǎn)酶量高（2）容易培養(yǎng)和管理（3）產(chǎn)酶穩(wěn)定性好（4）利于酶的分離純化（5）安全可靠6酶的發(fā)酵技術(shù)為什么利用微生物產(chǎn)酶？(1)種類多、酶種豐富，且菌株易誘變，菌種多樣。(2)生長(zhǎng)繁殖快，易提取酶.(3)培養(yǎng)基來(lái)源廣泛、價(jià)格便宜。(4)微電腦，連續(xù)化、自動(dòng)化，經(jīng)濟(jì)效益高。(5)利用以基因工程為主的現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)，7（1）枯草芽孢桿菌細(xì)菌屬菌落粗糙，不透明生產(chǎn)α-淀粉酶、蛋白酶、β-葡聚糖酶，堿性磷酸酶等。9（2）大腸桿菌陰性，無(wú)芽孢菌落光滑用于谷氨酸脫羧酶，天門冬氨酸酶等胞內(nèi)酶10（3）黑曲霉屬于真菌屬糖化酶、淀粉酶、酸性蛋白酶、果膠酶等。11（5）根霉主要用于糖化酶、淀粉酶、轉(zhuǎn)化酶等生產(chǎn)13（6）毛霉蛋白酶、糖化酶、淀粉酶、脂肪酶等。14（7）鏈霉菌葡萄糖異構(gòu)酶、青霉素酰化酶、纖維素酶、幾丁質(zhì)酶等15產(chǎn)酶菌株的選育主要依據(jù)酶催化的反應(yīng)性質(zhì)、作用底物的特異性、底物和產(chǎn)物的特性以及酶在細(xì)胞中所處的位置。胞外酶：菌落周圍的透明圈、顏色變化來(lái)篩選。胞內(nèi)酶：若酶作用底物分子量小可透過(guò)細(xì)胞膜，將酶反應(yīng)的產(chǎn)物作為底物，加在培養(yǎng)基中，根據(jù)菌落顏色變化。而多數(shù)胞內(nèi)酶產(chǎn)生菌的篩選：細(xì)胞破碎物做酶源，經(jīng)酶反應(yīng)后，根據(jù)酶反應(yīng)產(chǎn)物的特點(diǎn)來(lái)篩選（輔酶NAD）。17選擇性能優(yōu)良的產(chǎn)酶微生物培養(yǎng)基設(shè)計(jì)選擇合適的發(fā)酵方式發(fā)酵過(guò)程的各種參數(shù)控制酶的發(fā)酵技術(shù)重要18保藏細(xì)胞細(xì)胞活化細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)原生質(zhì)體固定化細(xì)胞固定化原生質(zhì)體預(yù)培養(yǎng)發(fā)酵發(fā)酵分離純化酶重要19（1）碳源當(dāng)前酶制劑生產(chǎn)上使用的菌種大都是只能利用有機(jī)碳的異養(yǎng)型微生物。重要吃點(diǎn)啥？21重要有機(jī)碳的主要來(lái)源有：一是農(nóng)副產(chǎn)品中二是野生的原料以石油產(chǎn)品中12～16碳的成分22考慮營(yíng)養(yǎng)要求、誘導(dǎo)作用、分解代謝物阻遏作用。α－淀粉酶生產(chǎn)用淀粉不用果糖重要23只用銨鹽或硝酸鹽為氮源時(shí)，酶產(chǎn)量?jī)H為有胨時(shí)的30%只用有機(jī)氮源而不用無(wú)機(jī)氮源時(shí)產(chǎn)量也低使用高濃度有機(jī)氮源外尚需添加1%~3%的無(wú)機(jī)氮源。重要黑曲霉酸性蛋白酶的生產(chǎn)25（3）碳氮比一般蛋白酶(包括酸性、中性和堿性蛋白酶)低;淀粉酶(包括α－淀粉酶、糖化酶、β－淀粉酶等)高,在糖化酶生產(chǎn)培養(yǎng)基的碳氮比是最高的。26（5）生長(zhǎng)因子

微量的物質(zhì)，或生長(zhǎng)素。某些氨基酸、維生素、嘌呤或嘧啶。重要有你才健康！29（6）產(chǎn)酶促進(jìn)劑產(chǎn)酶促進(jìn)劑一是誘導(dǎo)物，二是表面活性劑。表面活性劑能增加細(xì)胞的通透性，改善氧的傳遞速度，保護(hù)酶的活性。重要30發(fā)酵方式的選擇固態(tài)發(fā)酵法液體深層發(fā)酵法31(1)pH對(duì)產(chǎn)酶的影響一般來(lái)說(shuō)，培養(yǎng)基成分中碳/氮(C/N)比高，發(fā)酵液，pH低；C/N低，pH高。添加緩沖液；調(diào)節(jié)通風(fēng)量.調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的初始pH；pH過(guò)高糖或淀粉來(lái)調(diào)節(jié)，pH過(guò)低氮調(diào)節(jié)。

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一般細(xì)菌為37℃，霉菌和放線菌為28～30℃，而生產(chǎn)糖化酶的最適溫度為37～40℃。(2)溫度對(duì)產(chǎn)酶的影響

微生物代謝反應(yīng)、發(fā)酵中通風(fēng)、攪拌速度發(fā)酵初期菌體繁殖旺盛時(shí)33(3)耗氧量和通風(fēng)量對(duì)產(chǎn)酶的影響溶解氧而定。目前用于酶制劑生產(chǎn)的微生物都為好氣性微生物，采用自動(dòng)測(cè)定和記錄溶解氧的儀表。34(4)攪拌的影響有利于熱交換、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)與菌體均勻接觸，提高新陳代謝。打破空氣氣泡，使發(fā)酵液形成湍流，提高溶氧量，增加空氣利用。35(5)泡沫的影響泡沫阻礙了CO2的排除，影響溶氧量機(jī)械消泡，消泡劑36食品用酶發(fā)酵生產(chǎn)實(shí)例1、α-淀粉酶的生產(chǎn)生產(chǎn)菌種：細(xì)菌和曲霉，如枯草芽孢桿菌、黑曲霉等。發(fā)酵方法：霉菌，固體曲法；細(xì)菌，液體深層發(fā)酵。回收方法：鹽析、有機(jī)溶劑沉淀和淀粉吸附等。372、果膠酶的生產(chǎn)生產(chǎn)菌種：真菌如曲霉菌、青霉菌，細(xì)菌如枯草芽孢桿菌、歐氏桿菌。發(fā)酵：固體曲法和液體深層發(fā)酵回收：水提后加入乙醇沉淀。38酶的分離純化39酶的純化特定的一種酶在細(xì)胞中的含量很少酶可以通過(guò)測(cè)定活力加以跟蹤40酶分離純化的一般原則1、可靠和快速的測(cè)活方法；2、酶原料的選擇；3、酶的提取；4、酶的提純；5、酶的純度檢驗(yàn)。41酶提取分離純化技術(shù)路線發(fā)酵培養(yǎng)動(dòng)物器官植物組織微生物提取胞內(nèi)酶胞外酶細(xì)胞破碎研磨酶分離純化離心分離，過(guò)濾分離，沉淀分離，層析分離，電泳分離，萃取分離，結(jié)晶分離等。酶濃縮酶貯存42機(jī)械破碎搗碎法研磨法勻漿法

物理破碎溫度差破碎法壓力差破碎法超聲波破碎法

化學(xué)破碎有機(jī)溶劑：甲苯、丙酮丁醇、氯仿表面活性劑：Triton、Tween酶促破碎自溶法外加酶制劑法通過(guò)機(jī)械運(yùn)動(dòng)產(chǎn)生的剪切力，使組織、細(xì)胞破碎。使組織、細(xì)胞的外層結(jié)構(gòu)破壞對(duì)細(xì)胞膜的作用通過(guò)細(xì)胞本身的酶系或外加酶制劑的催化作用，使細(xì)胞外層結(jié)構(gòu)受到破壞，細(xì)胞破碎方法及其原理43

(1)機(jī)械(勻漿)法(2)超聲波法

處理的主要問(wèn)題是超聲空穴局部過(guò)熱引起酶活性喪失，時(shí)間應(yīng)盡可能短，容器周圍以冰浴冷卻處理。生物組織的破碎44(3)凍融法

生物組織冰凍后，胞液結(jié)成冰晶，使細(xì)胞壁脹破。加入蛋白酶抑制劑，如PMSF(苯甲基磺酰氟)絡(luò)合劑EDTA、還原劑DTT(二硫蘇糖醇)。(4)滲透壓法(5)酶消化法45(6)化學(xué)破碎法

①有機(jī)溶劑處理②表面活性劑處理與細(xì)胞膜中的磷脂及脂蛋白相互作用使細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)破壞，增加膜的透過(guò)性。46酶的提取鹽溶液提取酸溶液提取堿溶液提取有機(jī)溶劑提取47溫度：一般在00C~100C。pH：在酶的穩(wěn)定范圍內(nèi)，遠(yuǎn)離等電點(diǎn)pH。緩沖液：0.15mol/L氯化鈉、0.02~0.05mol/L磷酸提取液體積：一般為原料體積的1-5倍。保護(hù)劑：底物、輔酶、某些抗氧化劑、表面活性劑等。48酶的主要提取方法提取方法使用的溶劑或溶液提取對(duì)象鹽溶液提取0.02～0.5mol/L的鹽溶液在低濃度鹽溶液中溶解度較大的酶酸溶液提取PH2～6的水溶液在稀酸溶液中溶解度大，且穩(wěn)定性較好的酶堿溶液提取PH8～12的水溶液稀堿溶液中溶解度大且穩(wěn)定性較好的酶有機(jī)溶劑提取可與水混溶的有機(jī)溶劑與脂質(zhì)結(jié)合牢固或含有較多非極性基團(tuán)的酶49酶的分離方法1、沉淀分離2、離心分離3、萃取分離4、層析分離GoGoGoGo5、電泳分離Go6、過(guò)濾與膜分離Go501、沉淀分離溶解度降低從溶液中沉淀析出沉淀分離方法分離原理

鹽析沉淀法蛋白質(zhì)在不同的鹽濃度條件下溶解度不同，在酶液中添加一定濃度的中性鹽等電點(diǎn)沉淀法等電點(diǎn)時(shí)溶解度最低，不同的兩性電解質(zhì)有不同的等電點(diǎn)

有機(jī)溶劑沉淀法有機(jī)溶劑中的溶解度不同復(fù)合沉淀法在酶液中加入某些物質(zhì)，使它與酶形成復(fù)合物而沉淀下來(lái)，選擇性變性沉淀法選擇一定的條件使酶液中存在的某些雜質(zhì)變性沉淀，而不影響所需的酶51介電常數(shù)降低、使酶蛋白脫水

有機(jī)溶劑法52影響有機(jī)溶劑沉

淀法分離的因素

溫度pH離子強(qiáng)度蛋白質(zhì)濃度常用于酶的沉淀分離的有機(jī)溶劑有乙醇、丙酮、異丙醇、甲醇等

。選擇有機(jī)溶劑的標(biāo)準(zhǔn)必須與水完全混溶;不與蛋白質(zhì)發(fā)生反應(yīng)；要有較好的沉淀效應(yīng)；溶劑蒸汽要無(wú)毒，且不易燃。53陰極陽(yáng)極pH=pIpH<pIpH>pI帶正電荷帶負(fù)電荷凈電荷為零導(dǎo)電率溶解度滲透壓粘度達(dá)到最低等電點(diǎn)沉淀法原因:在等電點(diǎn)時(shí)，蛋白質(zhì)分子以雙極離子存在，總凈電荷為零,顆粒無(wú)電荷間的排斥作用,易凝集成大顆粒，因而最不穩(wěn)定，溶解度最小，易沉淀析出。

電泳分離沉淀分離……54pH=pI溶解度最小等電點(diǎn)沉淀與分離大部或全部沉淀下來(lái)pH<pI或pH>pI蛋白質(zhì)的分離沉淀出來(lái)的蛋白質(zhì)可保持天然構(gòu)象，能再溶解于水并具有生物活性。55離心分離離心力使不同大小、不同密度的物質(zhì)分離。顆粒大小、密度和特性的不同離心的形式：離心沉降離心過(guò)濾離心分離和超離心56超速離心機(jī)高速離心機(jī)沉降離心機(jī)57萃取分離利用物質(zhì)在兩相中的溶解度不同。兩相一般互不相溶有機(jī)溶劑萃取

雙水相萃取 超臨界萃取 反膠束萃取

58有機(jī)溶劑萃取

常用的溶劑：醇、酮、丁醇、苯酚等。萃取條件：00C~100C。接觸時(shí)間盡可能短。59雙水相萃取

（two-aqueousphasesystemextraction）利用生物物質(zhì)在雙水相體系中的選擇性分配。

影響分配的因素：

雙水相的性質(zhì)、分離物質(zhì)的性質(zhì)、離子性質(zhì)、環(huán)境因素

60層析分離利用混合物中各組分的物理化學(xué)性質(zhì)的差別，使各組分以不同程度分布在兩個(gè)相中，并以不同速度移動(dòng)。61欲分離的混合溶液自柱頂加入洗脫劑。解吸、吸附、再解吸、再吸附

吸附層析62吸附劑與洗脫劑的選擇洗脫劑的選擇極性種類有：醇、酮、酚等。洗脫劑的選擇要注意下列各點(diǎn)：洗脫劑不會(huì)與吸附劑起化學(xué)反應(yīng)，不會(huì)使吸附劑溶解；洗脫劑對(duì)混合液中的各組分的溶解度大，粘度小，流動(dòng)性好純度63離子交換劑上的可解離基團(tuán)（活性基團(tuán)）對(duì)各種離子的親和力不同陽(yáng)離子交換劑陰離子交換劑

離子交換層析64凝膠過(guò)濾分子篩層析以各種多孔凝膠為固定相，利用流動(dòng)相中所含各種組分的相對(duì)分子質(zhì)量不同

凝膠層析65凝膠過(guò)濾(gelfiltrationchromatography)溶質(zhì)分子的大小操作方便，不會(huì)使物質(zhì)變性，反復(fù)使用凝膠層析劑的容量比較低66原理67

葡聚糖凝膠瓊脂糖凝膠聚丙烯酰胺凝膠

68生物分子與配基之間所具有的專一而又可逆的親和力酶與底物酶與競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑抗原與抗體酶RNA與互補(bǔ)的RNA分子或片段RNA與互補(bǔ)的DNA分子或片段

親和層析69根據(jù)欲分離組分與配基的結(jié)合特性,親和層析可以分為：共價(jià)親和層析 疏水層析金屬離子親和層析 免疫親和層析染料親和層析 凝集素親和層析

70分配層析利用各組分在兩相中的分配系數(shù)不同固定相、流動(dòng)相

在流動(dòng)相的帶動(dòng)流經(jīng)固定相動(dòng)態(tài)分配。

紙上層析分配薄層層析分配氣相層析71電泳分離使用的支持體的不同：薄層電泳紙層析薄膜電泳凝膠電泳自由電泳等電聚焦電泳

本身所帶的凈電荷量、顆粒形狀顆粒大小、電場(chǎng)強(qiáng)度、溶液pH值、離子強(qiáng)度、支持體的特性72過(guò)濾與膜分離借助于過(guò)濾介質(zhì)，濾紙、濾布、纖維過(guò)濾非膜過(guò)濾：采用高分子膜以外的物質(zhì)作為過(guò)濾介質(zhì)

膜過(guò)濾：采用各種高分子膜為過(guò)濾介質(zhì)

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膜分離過(guò)程中，薄膜的作用是選擇性地讓小于其孔徑的物質(zhì)顆?；蚍肿油ㄟ^(guò)，而把大于其孔徑的顆粒截留。膜分離加壓膜分離微濾超濾反滲透電場(chǎng)膜分離電滲析離子交換膜電滲析擴(kuò)散膜分離透析74酶分離、純化的評(píng)價(jià)酶的產(chǎn)量是以活力單位表示，比活力、總活力75酶活力的測(cè)定酶活力(Enzymeactivity)：酶催化反應(yīng)的能力，酶的含量。1min催化1μmol底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物的酶量為該酶的一個(gè)活力單位(國(guó)際單位)，溫度為25℃，其它條件(pH、離子強(qiáng)度)采用最適條件。重要76酶的總活力為樣品的全部酶活力?？偦盍?酶活力×總體積(mL)或=酶活力×總質(zhì)量(g)77比活力(Specificactivity)：?jiǎn)挝坏鞍踪|(zhì)所含有的酶活力。酶純度重要78回收率(Yieldpercent)：提純前與提純后酶的總活力之比。酶的