酶的分子修飾2012課件

Chapter5ModificationofEnzymeMolecule第五章酶的分子修飾Contentsofchapter5酶分子修飾種類為什么要進(jìn)行酶分子修飾酶分子修飾部位及專一性分類酶修飾后的性質(zhì)變化GoGoGoGo酶的定向進(jìn)化Go什么是酶分子修飾？通過(guò)各種方法使酶分子的結(jié)構(gòu)發(fā)生某些改變，從而改變酶的某些特性和功能的技術(shù)過(guò)程稱為酶分子修飾。即：在體外將酶分子通過(guò)人工的方法與一些化學(xué)基團(tuán)（物質(zhì)），特別是具有生物相容性的物質(zhì)，進(jìn)行共價(jià)連接，從而改變酶的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)。酶化學(xué)修飾的意義(1).研究酶的結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系。（50年代末）(2).人為改變天然酶的某些性質(zhì)，擴(kuò)大酶的應(yīng)用范圍。（70年代末之后）1）提高酶的生物活性（酶活力）。2）增強(qiáng)酶的穩(wěn)定性（熱穩(wěn)定性、體內(nèi)半衰期）。3）消除抗原性（針對(duì)特異性反應(yīng)降低生物識(shí)別能力）。4）產(chǎn)生新的催化能力。1）提高酶的生物活性（酶活力）

蛋白一級(jí)結(jié)構(gòu)通過(guò)內(nèi)部氨基酸側(cè)鏈基團(tuán)的相互作用,按熱力學(xué)最穩(wěn)定方式形成了特有的高級(jí)結(jié)構(gòu).(即一級(jí)結(jié)構(gòu)的氨基酸順序決定了高級(jí)結(jié)構(gòu)),而高級(jí)結(jié)構(gòu)決定了功能.一級(jí)結(jié)構(gòu)修飾后發(fā)生改變很多情況下會(huì)引起高級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變,從而改變蛋白功能(包括酶活力)熱穩(wěn)定性修飾劑分子存在多個(gè)反應(yīng)基團(tuán)，可與酶內(nèi)部基團(tuán)形成多點(diǎn)交聯(lián)。使酶的天然構(gòu)象產(chǎn)生“剛性”結(jié)構(gòu)。對(duì)抑制劑穩(wěn)定性大分子修飾劑與酶結(jié)合后，產(chǎn)生的空間障礙或靜電斥力阻擋抑制劑，“遮蓋”了酶的活性部位。對(duì)水解酶的穩(wěn)定性A大分子修飾劑產(chǎn)生空間障礙阻擋蛋白水解酶接近酶分子?！罢谏w”酶分子上敏感鍵免遭破壞。B酶分子上許多敏感基團(tuán)交聯(lián)上修飾劑后，減少了受蛋白水解酶破壞的可能性。2）增強(qiáng)酶的穩(wěn)定性

4)其它大分子修飾劑本身是多聚電荷體，能在酶分子表面形成“緩沖外殼”，抵御外界環(huán)境的極性變化，維持酶活性部位微環(huán)境相對(duì)穩(wěn)定酶蛋白化學(xué)修飾的局限性1.某種修飾劑對(duì)某一氨基酸側(cè)鏈的化學(xué)修飾專一性是相對(duì)的，很少有對(duì)某一氨基酸側(cè)鏈絕對(duì)專一的化學(xué)修飾劑。2.酶的化學(xué)修飾只能在具有極性的氨基酸殘基側(cè)鏈上進(jìn)行，目前還不能用化學(xué)修飾的方法研究非極性氨基酸殘基在酶結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系中的作用。3.酶化學(xué)修飾的結(jié)果對(duì)于研究酶結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系能提供一些信息，如某一氨基酸殘基被修飾后，酶活力完全喪失，說(shuō)明該殘基是酶活性所“必需”的，為什么是必需的，還得用X射線和其他方法來(lái)確定。因此化學(xué)修飾法研究酶結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系尚缺乏準(zhǔn)確性和系統(tǒng)性。第二節(jié)酶分子修飾部位及專一性分類酶蛋白結(jié)構(gòu)部位分類修飾專一性分類活性中心的共性(1)活性部位只占酶分子很小的一部分（1-2%）。(2)活性部位是一個(gè)三維實(shí)體。(3)活性中心位于酶分子表面的疏水性裂縫中。(4)活性中心構(gòu)象不是固定不變的（誘導(dǎo)契合）。(5)酶與底物通過(guò)鹽鍵、氫鍵、范德華力和疏水作用等次級(jí)鍵結(jié)合?；钚灾行牡闹匾瘜W(xué)基團(tuán)7種氨基酸出現(xiàn)的頻率最高

LysAspGluCysHisTyrSer（蘭天果拌豬肉絲）某些功能基團(tuán),如（氨基、羧基、巰基、羥基和咪唑基）是酶的必需基團(tuán)。賴氨酸的氨基天冬氨酸和谷氨酸的羧基半胱氨酸的巰基組氨酸的咪唑基酪氨酸和絲氨酸的羥基2)專一性化學(xué)修飾（基團(tuán)專一性修飾）用專一性化學(xué)修飾劑修飾酶活性中心的某一氨基酸殘基的側(cè)鏈基團(tuán)。3)親和標(biāo)記（位點(diǎn)專一性修飾）采用的修飾試劑是根據(jù)底物的化學(xué)結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)合成的含有活潑反應(yīng)基團(tuán)的底物類似物。利用酶對(duì)底物的特殊親和力將酶加以修飾標(biāo)記。化學(xué)修飾的專一性第三節(jié)酶分子的修飾方法金屬離子置換修飾大分子結(jié)合修飾(共價(jià)/非共價(jià);多結(jié)合水不溶分子)側(cè)鏈基團(tuán)修飾(多結(jié)合水溶解性小分子)肽鏈有限水解修飾氨基酸置換修飾酶分子的物理修飾

金屬離子置換修飾的過(guò)程

a.酶的分離純化：首先將欲進(jìn)行修飾的酶經(jīng)過(guò)分離純化，除去雜質(zhì)，獲得具有一定純度的酶液。

b.除去原有的金屬離子：在經(jīng)過(guò)純化的酶液中加入一定量的金屬螯合劑，如乙二胺四乙酸（EDTA）等，使酶分子中的金屬離子與EDTA等形成螯合物。通過(guò)透析、超濾、分子篩層析等方法，將EDTA-金屬螯合物從酶液中除去。此時(shí)，酶往往成為無(wú)活性狀態(tài)。

c.加入置換離子：于去離子的酶液中加入一定量的另一種金屬離子，酶蛋白與新加入的金屬離子結(jié)合，除去多余的置換離子，就可以得到經(jīng)過(guò)金屬離子置換后的酶。金屬離子置換修飾只適用于那些在分子結(jié)構(gòu)中本來(lái)含有金屬離子的酶。用于金屬離子置換修飾的金屬離子，一般都是二價(jià)金屬離子。

(2)酶的大分子修飾使用一些能與酶非共價(jià)地相互作用而又能有效地保護(hù)酶的一些添加物，如聚乙二醇、右旋糖苷等，它們既能通過(guò)氫鍵固定在酶分子表面，也能通過(guò)氫鍵有效地與外部水相連，從而保護(hù)酶的活力。一些添加物，如多元醇、多糖、多聚氨基酸、多胺等能通過(guò)調(diào)節(jié)酶的微環(huán)境來(lái)保護(hù)酶的活力。另一類添加物就是蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)分子之間相互作用時(shí)，其表面區(qū)域內(nèi)排除了水分子，因而增加了相互作用力，其穩(wěn)定性也就增加了。非共價(jià)修飾用可溶性大分子，如聚乙二醇、右旋糖苷、肝素等，通過(guò)共價(jià)鍵連接于酶分子的表面，形成一層覆蓋層。例如：用聚乙二醇修飾超氧物歧化酶，不僅可以降低或消除酶的抗原性，而且提高了抗蛋白酶的能力，延長(zhǎng)了酶在體內(nèi)的半衰期從而提高了酶藥效。每分子核糖核酸酶與6.5分子的右旋糖酐結(jié)合，可以使酶活力提高到原有酶活力的2.25倍；每分子胰凝乳蛋白酶與11分子右旋糖酐結(jié)合，酶活力達(dá)到原有酶活力的5.1倍共價(jià)修飾聚乙二醇是線性分子具有良好的生物相容性和水溶性，在體內(nèi)無(wú)毒性、無(wú)殘留、無(wú)免疫原性，并可消除酶的抗原性，使其末端活化后可以與酶產(chǎn)生交聯(lián)，因而，它被廣泛用于酶的修飾。酶半衰期相對(duì)穩(wěn)定性天然SOD6min1右旋糖酐-SOD7h70Ficoll(低分子量)–SOD14h140Ficoll(高分子量)–SOD24h240

聚乙二醇-SOD

35h

350(3)酶分子的側(cè)鏈基團(tuán)修飾采用一定的方法（一般為化學(xué)法）使酶蛋白的側(cè)鏈基團(tuán)發(fā)生改變，從而改變酶分子的特性和功能的修飾方法?？梢杂糜谘芯扛鞣N基團(tuán)在酶分子中的作用及其對(duì)酶的結(jié)構(gòu)、特性和功能的影響。在研究酶的活性中心中的必需基團(tuán)時(shí)經(jīng)常采用。酶蛋白的側(cè)鏈基團(tuán)是指組成蛋白質(zhì)的氨基酸殘基上的功能團(tuán)。主要包括氨基、羧基、巰基、胍基、酚基等。這些基團(tuán)可以形成各種副鍵，對(duì)酶蛋白空間結(jié)構(gòu)的形成和穩(wěn)定有重要作用。側(cè)鏈基團(tuán)一旦改變將引起酶蛋白空間構(gòu)象的改變，從而改變酶的特性和功能。(一級(jí)結(jié)構(gòu)是基礎(chǔ))常見基團(tuán)的化學(xué)修飾反應(yīng)：羧基常見基團(tuán)的化學(xué)修飾反應(yīng)：氨基常見基團(tuán)的化學(xué)修飾反應(yīng)：巰基常見基團(tuán)的化學(xué)修飾反應(yīng)：咪唑基常見基團(tuán)的化學(xué)修飾反應(yīng)：酚羥基常見基團(tuán)的化學(xué)修飾反應(yīng)：胍基常見基團(tuán)的化學(xué)修飾反應(yīng)：色氨酸吲哚基(4)酶蛋白主鏈修飾(肽鏈有限水解修飾)利用酶分子主鏈的切斷和連接，使酶分子的化學(xué)結(jié)構(gòu)及其空間結(jié)構(gòu)發(fā)生某些改變，從而改變酶的特性和功能的方法。酶蛋白主鏈修飾主要是靠酶切/酶原激活法。a、胃蛋白酶原的激活b、胰蛋白酶原（trypsinogen）的激活

c、胰凝乳蛋白酶原（chymotrypsinogen）的激活

有限水解意味著水解酶量和時(shí)間相對(duì)少同時(shí)由于水解部位氨基酸”埋”在蛋白位置差異,氨基酸周圍肽段引起的氨基酸pK值和電性變化,使同樣氨基酸部位水解程度也可能不同酶蛋白的肽鏈被水解后，可能出現(xiàn)以下三種情況中的一種：1引起酶活性中心的破壞，酶失去催化功能。2仍維持活性中心的完整構(gòu)象，保持酶活力。3有利于活性中心與底物結(jié)合并形成準(zhǔn)確的催化部位，酶活力提高。

氨基酸或核苷酸的置換修飾可以采用化學(xué)修飾方法，例如，Bender等成功地利用化學(xué)修飾法將枯草桿菌蛋白酶活性中心的絲氨酸轉(zhuǎn)換為半胱氨酸，修飾后，該酶失去對(duì)蛋白質(zhì)和多肽的水解能力，卻出現(xiàn)了催化硝基苯酯等底物水解的活性。但是化學(xué)修飾法難度大，成本高，專一性差，而且要對(duì)酶分子逐個(gè)進(jìn)行修飾，操作復(fù)雜，難以工業(yè)化生產(chǎn)。(保護(hù)位點(diǎn)多,可修飾位點(diǎn)多;蛋白容易失去活力)

現(xiàn)在常用的氨基酸置換修飾的方法是定點(diǎn)突變技術(shù)。定點(diǎn)突變（sitedirectedmutagenesis）是20世紀(jì)80年代發(fā)展起來(lái)的一種基因操作技術(shù)。是指在DNA序列中的某一特定位點(diǎn)上進(jìn)行堿基的改變從而獲得突變基因的操作技術(shù)。是蛋白質(zhì)工程（ProteinEngineering）和酶分子組成單位置換修飾中常用的技術(shù)。定點(diǎn)突變技術(shù)，為氨基酸或核苷酸的置換修飾提供了先進(jìn)、可靠、行之有效的手段。(5)氨基酸置換修飾酶分子的定點(diǎn)突變1、基因序列分析2、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析3、酶活性中心分析4、引物設(shè)計(jì)進(jìn)行基因定點(diǎn)突變5、酶基因克隆表達(dá)6、變異特性分析(6)酶分子的物理修飾通過(guò)物理修飾，可以了解不同物理?xiàng)l件下，特別是在極端條件下（高溫、高壓、高鹽、極端pH值等）由于酶分子空間構(gòu)象的改變而引起酶的特性和功能的變化情況。特點(diǎn)在于不改變酶的組成單位及其基團(tuán)，(與前五種方法區(qū)別)酶分子中的共價(jià)鍵不發(fā)生改變，只是在物理因素的作用下，副鍵發(fā)生某些變化和重排。第四節(jié)酶修飾后的性質(zhì)變化熱穩(wěn)定性：一般來(lái)說(shuō)，熱穩(wěn)定性有較大的提高。半衰期：一般在體內(nèi)的半衰期得到有效延長(zhǎng)。由于酶分子經(jīng)修飾后，增強(qiáng)對(duì)熱、蛋白酶、抑制劑等的穩(wěn)定性，從而延長(zhǎng)了在體內(nèi)的半衰期?？乖裕罕容^公認(rèn)的是PEG和人血清白蛋白在消除酶的抗原性上效果比較明顯。各類失活因子的抵抗力：修飾酶對(duì)蛋白酶、抑制劑均有一定的抵抗能力，從而提高其穩(wěn)定性。最適pH：大部分酶經(jīng)化學(xué)修飾后，酶的最適pH發(fā)生了變化，這種變化在應(yīng)用研究上有時(shí)具有重要意義。修飾酶最適pH更接近于生理環(huán)境，在臨床應(yīng)用上有較大意義。Km的變化：大多數(shù)酶經(jīng)修飾后，Vm沒(méi)有明顯變化，但有些酶經(jīng)修飾后，Km值變大。第五節(jié)酶的定向進(jìn)化酶分子的合理設(shè)計(jì)(rationaldesign)定點(diǎn)突變技術(shù)屬于合理設(shè)計(jì),這個(gè)技術(shù)需要對(duì)酶蛋白結(jié)構(gòu)和功能間對(duì)應(yīng)關(guān)系要有了解.通過(guò)設(shè)計(jì)酶結(jié)構(gòu)而得到一些功能.酶分子的定向進(jìn)化(directedevolution)包括易錯(cuò)PCR技術(shù),無(wú)須對(duì)蛋白結(jié)構(gòu)和功能間對(duì)應(yīng)關(guān)系有了解,先突變大量酶,再根據(jù)具體功能需要選擇合適的酶,再了解酶結(jié)構(gòu).兩種方法在酶結(jié)構(gòu)和關(guān)系間建立聯(lián)系,不段推動(dòng)對(duì)酶蛋白結(jié)構(gòu)和功能了解.兩者聯(lián)合設(shè)計(jì)新酶可取得不錯(cuò)效果酶的合理設(shè)計(jì)定向進(jìn)化的原理定向進(jìn)化的基本規(guī)則是“獲取你所篩選的突變體”。定向進(jìn)化=隨機(jī)突變+選擇。前者是人為引發(fā)的，后者雖相當(dāng)于環(huán)境，但只作用于突變后的分子群，起著選擇某一方向的進(jìn)化而排除其他方向突變的作用，整個(gè)進(jìn)化過(guò)程完全是在人為控制下進(jìn)行的定向進(jìn)化產(chǎn)生突變庫(kù)手段-易錯(cuò)PCR在待進(jìn)化酶基因的PCR擴(kuò)增反應(yīng)中，利用TaqDNA聚合酶不具有3’->5’校對(duì)功能的性質(zhì)，(或則不含鎂離子含錳離子的聚合酶)配合適當(dāng)條件，向目的基因中隨機(jī)引入突變，構(gòu)建突變庫(kù)，憑借定向的選擇方法，選出所需性質(zhì)的優(yōu)化酶(或蛋白質(zhì))，從而排除其他突變體。相對(duì)于自然條件下聚合酶十萬(wàn)分之一到百萬(wàn)分之一的復(fù)制出錯(cuò)幾率,可以大量產(chǎn)生突變體。DNA改組（DNAshuffling）又稱有性PCR(sexualPCR)，原理。該策略的目的是創(chuàng)造將親本基因群中的突變盡可能組合的機(jī)會(huì)，導(dǎo)致更大的變異，最終獲取最佳突變組合的酶。通過(guò)DNA改組,不僅可加速積累有益突變，而且可使酶的2個(gè)或更多的已優(yōu)化性質(zhì)合為一體。外顯子改組（exonshuffling）類似于DNA改組，兩者都是在各自含突變的片段間進(jìn)行交換，前者尤其適用于真核生物。在自然界中，不同分子的內(nèi)含子間發(fā)生同源重組，導(dǎo)致不同外顯子的結(jié)合，是產(chǎn)生新蛋白質(zhì)的有效途徑之一。與DNA改組不同，外顯子改組是靠同一種分子間內(nèi)含子的同源性帶動(dòng)，而DNA改組不受任何限制，發(fā)生在整個(gè)基因片段上。定向進(jìn)化產(chǎn)生突變庫(kù)手段-DNA改組和外顯子改組DNA改組原理定向進(jìn)化的選擇策略1)、定向進(jìn)化中，突變具有隨機(jī)性，但通過(guò)選擇特定方向的突變限定了進(jìn)化趨勢(shì)，加之控制實(shí)驗(yàn)條件，限定突變種類，降低突變率，縮小突變庫(kù)的容量，這不僅減少了工作量，更重要的是加快了酶在某一方向的進(jìn)化速度。2)、通常,篩選方法必須靈敏,至少與目的性質(zhì)相關(guān)。另有一些其他的篩選方法，如加入能產(chǎn)生可見光信號(hào)的底物或利用綠色