細(xì)胞生物學(xué)常用技術(shù)

細(xì)胞生物學(xué)常用實(shí)驗(yàn)技術(shù)

現(xiàn)在是1頁(yè)\一共有99頁(yè)\編輯于星期三

cellularlevelSubcellularlevel

Molecularlevel現(xiàn)在是2頁(yè)\一共有99頁(yè)\編輯于星期三現(xiàn)在是3頁(yè)\一共有99頁(yè)\編輯于星期三

顯微技術(shù)細(xì)胞分離技術(shù)細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)細(xì)胞組分的分級(jí)分離細(xì)胞示蹤技術(shù)細(xì)胞分子生物學(xué)技術(shù)現(xiàn)在是4頁(yè)\一共有99頁(yè)\編輯于星期三一、顯微鏡技術(shù)microscopy

μm

微米

=10-6m

nm

納米

=10-9m

?

埃

=10-10m

(一)光學(xué)顯微鏡技術(shù)

利用光線照明,將微小物體形成放大影像的儀器

現(xiàn)在是5頁(yè)\一共有99頁(yè)\編輯于星期三1.顯微鏡的分辨率顯微鏡或人眼在25cm的明視距離處,能分辨被檢物體微細(xì)結(jié)構(gòu)最小間隔的能力。

d=

光學(xué)顯微鏡的分辨極限0.2μm0.61λ

nsinθ

現(xiàn)在是6頁(yè)\一共有99頁(yè)\編輯于星期三100μm0.2μm現(xiàn)在是7頁(yè)\一共有99頁(yè)\編輯于星期三2.光鏡標(biāo)本切片的制備

(1)

固定

定義：將組織浸入化學(xué)試劑中，通過(guò)在細(xì)胞中大分子間形成交聯(lián)，保持細(xì)胞中原有結(jié)構(gòu)的形態(tài)和位置的過(guò)程。

固定的目的：

A防止組織自溶或腐敗

B保持細(xì)胞原有的形態(tài)

C保持細(xì)胞各種成分的原有位置

常用固定劑：乙醇、甲醛、戊二醛

現(xiàn)在是8頁(yè)\一共有99頁(yè)\編輯于星期三(2)脫水

定義：借助某些化學(xué)溶劑置換組織內(nèi)水分的過(guò)程。

常用的脫水劑：酒精

(3)包埋

定義：將組織塊包入包埋劑使組織硬化的過(guò)程。

常用的包埋劑：液體石蠟、樹(shù)脂

(4)切片

1-10μm

現(xiàn)在是9頁(yè)\一共有99頁(yè)\編輯于星期三（5）染色采用某些化學(xué)物質(zhì)特異性或選擇性地與細(xì)胞內(nèi)的某些成分相互作用，從而原位顯示細(xì)胞某種成分或結(jié)構(gòu)的方法

A選擇性染色

考馬斯亮藍(lán)–

蛋白質(zhì)Brachet反應(yīng)

現(xiàn)在是10頁(yè)\一共有99頁(yè)\編輯于星期三hematoxylin-eosin現(xiàn)在是11頁(yè)\一共有99頁(yè)\編輯于星期三B特異性染色

酶+底物

抗原+抗體+substrateantigenantibody************酶標(biāo)記：免疫組織化學(xué)技術(shù)熒光標(biāo)記：免疫熒光技術(shù)現(xiàn)在是12頁(yè)\一共有99頁(yè)\編輯于星期三3.熒光顯微鏡技術(shù)

(1)原理熒光分子在受到光照射后，可吸收特定波長(zhǎng)的短波光線，并發(fā)射出比原來(lái)吸收波長(zhǎng)更長(zhǎng)的光

可見(jiàn)光紫外光紅外光shortlongλ

現(xiàn)在是13頁(yè)\一共有99頁(yè)\編輯于星期三（2）熒光顯微鏡的基本構(gòu)造

A紫外光光源

B二向色鏡：反射短波光線，透過(guò)長(zhǎng)波光線

C濾光片

現(xiàn)在是14頁(yè)\一共有99頁(yè)\編輯于星期三（3）常用的熒光染料

A有機(jī)染料熒光素羅丹明

FITC現(xiàn)在是15頁(yè)\一共有99頁(yè)\編輯于星期三B量子點(diǎn)quantumdotⅡ-Ⅵ族、Ⅲ-Ⅴ族元素構(gòu)成的半導(dǎo)體納米結(jié)晶良好的光學(xué)穩(wěn)定性抗光漂白性現(xiàn)在是16頁(yè)\一共有99頁(yè)\編輯于星期三現(xiàn)在是17頁(yè)\一共有99頁(yè)\編輯于星期三現(xiàn)在是18頁(yè)\一共有99頁(yè)\編輯于星期三（4）應(yīng)用

A免疫熒光顯微技術(shù)（Immunofluorescencemicroscopy）抗體+熒光染料

現(xiàn)在是19頁(yè)\一共有99頁(yè)\編輯于星期三現(xiàn)在是20頁(yè)\一共有99頁(yè)\編輯于星期三現(xiàn)在是21頁(yè)\一共有99頁(yè)\編輯于星期三B綠色熒光蛋白GFP

現(xiàn)在是22頁(yè)\一共有99頁(yè)\編輯于星期三現(xiàn)在是23頁(yè)\一共有99頁(yè)\編輯于星期三4.相差顯微鏡（phasecontrastmicroscope）

(1)原理

波長(zhǎng)顏色振幅

亮度速度

相位

現(xiàn)在是24頁(yè)\一共有99頁(yè)\編輯于星期三(2)應(yīng)用

活體細(xì)胞觀察現(xiàn)在是25頁(yè)\一共有99頁(yè)\編輯于星期三5.激光掃描共焦顯微鏡（Laser

Scanning

ConfocalMicroscope）

(1)原理

在顯微鏡基礎(chǔ)上配置激光光源，掃描裝置，共軛聚焦裝置和檢測(cè)系統(tǒng)而形成的顯微鏡。單色激光光源光源后－照明針孔－點(diǎn)光源檢測(cè)器前－探測(cè)針孔分層掃描三維重建共扼現(xiàn)在是26頁(yè)\一共有99頁(yè)\編輯于星期三現(xiàn)在是27頁(yè)\一共有99頁(yè)\編輯于星期三

（2）應(yīng)用

A細(xì)胞的三維重建

B細(xì)胞定量熒光檢測(cè)

DNARNA蛋白質(zhì)含量

C細(xì)胞內(nèi)Ca2+pH動(dòng)態(tài)檢測(cè)

D細(xì)胞間通訊現(xiàn)在是28頁(yè)\一共有99頁(yè)\編輯于星期三果蠅胚胎原腸胚現(xiàn)在是29頁(yè)\一共有99頁(yè)\編輯于星期三現(xiàn)在是30頁(yè)\一共有99頁(yè)\編輯于星期三現(xiàn)在是31頁(yè)\一共有99頁(yè)\編輯于星期三現(xiàn)在是32頁(yè)\一共有99頁(yè)\編輯于星期三（二）電子顯微鏡技術(shù)

利用電子與固體樣品作用時(shí)所發(fā)出的信息,

對(duì)樣品進(jìn)行微區(qū)觀察和分析的技術(shù)亞顯微結(jié)構(gòu)超微結(jié)構(gòu)

1.電子顯微鏡的特點(diǎn)

高分辨率

理論上

d=0.002nm

實(shí)際上

d=0.1nm

生物標(biāo)本

d=2nm

高放大倍率

1,000,000

現(xiàn)在是33頁(yè)\一共有99頁(yè)\編輯于星期三陰極陽(yáng)極聚光鏡（電磁透鏡）物鏡中間鏡投影鏡電鏡照片照相底片真空、上下顛倒

2.透射電子顯微鏡（Transmissionelectronmicroscope,TEM）

(1)基本構(gòu)造

現(xiàn)在是34頁(yè)\一共有99頁(yè)\編輯于星期三(2)超薄切片的制備

A固定戊二醛:蛋白質(zhì)鋨酸:C=C(膜結(jié)構(gòu))

現(xiàn)在是35頁(yè)\一共有99頁(yè)\編輯于星期三B脫水上升梯度

乙醇：30%50%70%80%90%95%100%C包埋

單體樹(shù)脂加溫聚合

D切片

500–700?

E

重金屬染色

U(醋酸雙氧鈾)Pb(檸檬酸鉛)

現(xiàn)在是36頁(yè)\一共有99頁(yè)\編輯于星期三現(xiàn)在是37頁(yè)\一共有99頁(yè)\編輯于星期三NADP酶反應(yīng)嗜鋨反應(yīng)TPP酶反應(yīng)現(xiàn)在是38頁(yè)\一共有99頁(yè)\編輯于星期三2.掃描電子顯微鏡

（Scanningelectronmicroscopy,SEM）現(xiàn)在是39頁(yè)\一共有99頁(yè)\編輯于星期三(1)原理

二次電子(2)分辨率

3-10nm(3)樣品的制備

A固定

B脫水

C干燥臨界點(diǎn)干燥

D染色AuPt現(xiàn)在是40頁(yè)\一共有99頁(yè)\編輯于星期三現(xiàn)在是41頁(yè)\一共有99頁(yè)\編輯于星期三現(xiàn)在是42頁(yè)\一共有99頁(yè)\編輯于星期三透射電鏡利用穿透標(biāo)本的電子進(jìn)行成像(散射)觀察組織的二維切片掃描電鏡利用標(biāo)本表面發(fā)射的二次電子成像觀察組織的表面三維結(jié)構(gòu)現(xiàn)在是43頁(yè)\一共有99頁(yè)\編輯于星期三（三）掃描探針顯微鏡

（Scanningprobemicroscope,SPM）1.掃描隧道顯微鏡

使用原子尺度的探針在標(biāo)本表面掃描，在探針針尖和樣品之間施加一定電壓，產(chǎn)生隨標(biāo)本表面形貌變化的隧道電流。

分辨率高

可在非真空狀態(tài)下工作

直接觀察大分子的三維結(jié)構(gòu)現(xiàn)在是44頁(yè)\一共有99頁(yè)\編輯于星期三2.原子力顯微鏡

通過(guò)分析探針針尖與樣品之間的原子間作用力來(lái)獲取所觀察表面的微觀信息。

樣品無(wú)需具有導(dǎo)電性

可在三態(tài)下工作

活細(xì)胞表面及生物大分子空間伸展及其結(jié)晶體表面觀測(cè)現(xiàn)在是45頁(yè)\一共有99頁(yè)\編輯于星期三二、細(xì)胞分離技術(shù)（cellseparation）從活體組織獲得相對(duì)單一類型的細(xì)胞群的方法

1.制備單一細(xì)胞懸液

組織

單一細(xì)胞消化EDTA

細(xì)胞間連接胰酶

細(xì)胞外基質(zhì)現(xiàn)在是46頁(yè)\一共有99頁(yè)\編輯于星期三二、細(xì)胞分離技術(shù)（cellseparation）從活體組織獲得相對(duì)單一類型的細(xì)胞群的方法

1.制備單一細(xì)胞懸液

組織

單一細(xì)胞消化EDTA

細(xì)胞間連接胰酶

細(xì)胞外基質(zhì)現(xiàn)在是47頁(yè)\一共有99頁(yè)\編輯于星期三2.分離不同類型細(xì)胞

(1)

離心（centrifugation）

大小密度形狀

小輕不規(guī)則

大重圓形現(xiàn)在是48頁(yè)\一共有99頁(yè)\編輯于星期三(2)免疫磁珠法

利用帶有特定單抗的免疫磁珠與靶細(xì)胞的特異結(jié)合，快速地從多細(xì)胞懸液中將目的細(xì)胞分離出來(lái)。

Fe2O3或Fe3O4顆粒

+

單克隆抗體免疫磁珠現(xiàn)在是49頁(yè)\一共有99頁(yè)\編輯于星期三現(xiàn)在是50頁(yè)\一共有99頁(yè)\編輯于星期三(3)

流式細(xì)胞儀(flowcytometry)

能夠快速分選或檢測(cè)細(xì)胞及其組分的物理或化學(xué)特性的技術(shù)

A原理:

抗原+抗體*熒光標(biāo)記

B樣品制備

細(xì)胞懸液制備細(xì)胞固定細(xì)胞染色現(xiàn)在是51頁(yè)\一共有99頁(yè)\編輯于星期三現(xiàn)在是52頁(yè)\一共有99頁(yè)\編輯于星期三現(xiàn)在是53頁(yè)\一共有99頁(yè)\編輯于星期三

B應(yīng)用*細(xì)胞分選

cellin10005000cells/sec*細(xì)胞大小測(cè)量*DNA含量測(cè)定*免疫表型分析*細(xì)胞功能分析*細(xì)胞凋亡研究現(xiàn)在是54頁(yè)\一共有99頁(yè)\編輯于星期三細(xì)胞周期分析現(xiàn)在是55頁(yè)\一共有99頁(yè)\編輯于星期三

藥物處理前后HT29細(xì)胞的流式細(xì)胞分析結(jié)果

G0/G160.86%S29.14%G210.00%G0/G137.68%S37.56%G224.76%AB現(xiàn)在是56頁(yè)\一共有99頁(yè)\編輯于星期三現(xiàn)在是57頁(yè)\一共有99頁(yè)\編輯于星期三

ND-1-QD605標(biāo)記不同大腸癌細(xì)胞的流式細(xì)胞定量分析現(xiàn)在是58頁(yè)\一共有99頁(yè)\編輯于星期三(4)激光捕獲顯微切割技術(shù)（Lasercapturemicrodissection，LCM）從組織切片中精確分離獲取單一細(xì)胞的方法

現(xiàn)在是59頁(yè)\一共有99頁(yè)\編輯于星期三工作原理及過(guò)程:A制備組織切片B鏡下將組織切片覆以薄膜C激光束切割特定細(xì)胞或區(qū)域D收集管收集

現(xiàn)在是60頁(yè)\一共有99頁(yè)\編輯于星期三現(xiàn)在是61頁(yè)\一共有99頁(yè)\編輯于星期三現(xiàn)在是62頁(yè)\一共有99頁(yè)\編輯于星期三三、細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)（Cellculture）

從活體組織中分離出特定的細(xì)胞，在一定的條件下進(jìn)行培養(yǎng)，使之能夠繼續(xù)生存、生長(zhǎng)以至增殖的方法

invitro用培養(yǎng)細(xì)胞做實(shí)驗(yàn)

invivo用動(dòng)物做實(shí)驗(yàn)現(xiàn)在是63頁(yè)\一共有99頁(yè)\編輯于星期三1.細(xì)胞培養(yǎng)的條件

(1)

固體表面：培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿

(2)培養(yǎng)基常見(jiàn)培養(yǎng)基：1640DMEM

現(xiàn)在是64頁(yè)\一共有99頁(yè)\編輯于星期三

(3)無(wú)菌無(wú)菌操作：超凈工作臺(tái)、火焰消毒等培養(yǎng)液中加入抗菌素器械、溶液消毒（烤箱、高壓滅菌、過(guò)濾）

(4)其他溫度37℃

濕度100%CO2濃度5%現(xiàn)在是65頁(yè)\一共有99頁(yè)\編輯于星期三2.細(xì)胞培養(yǎng)的傳代

原代培養(yǎng):直接取材于有機(jī)體的細(xì)胞培養(yǎng)取材切割消化培養(yǎng)

傳代培養(yǎng):將原代培養(yǎng)存活的細(xì)胞從培養(yǎng)瓶中取出，以1:2以上的比例擴(kuò)大培養(yǎng)

原代培養(yǎng)

傳代培養(yǎng)(保持分化特性)

傳代現(xiàn)在是66頁(yè)\一共有99頁(yè)\編輯于星期三現(xiàn)在是67頁(yè)\一共有99頁(yè)\編輯于星期三3.細(xì)胞系（Cellline）

在細(xì)胞培養(yǎng)中，偶然情況下產(chǎn)生的具有無(wú)限繁殖能力，能夠無(wú)限傳代的細(xì)胞群。

變異細(xì)胞

細(xì)胞系

HeLa人宮頸癌上皮細(xì)胞

3T3小鼠成纖維細(xì)胞無(wú)限繁殖現(xiàn)在是68頁(yè)\一共有99頁(yè)\編輯于星期三相差顯微鏡觀察培養(yǎng)中的HeLa細(xì)胞現(xiàn)在是69頁(yè)\一共有99頁(yè)\編輯于星期三4.細(xì)胞融合（Cellfusion）

（1）定義在自然或人工條件下，使二個(gè)或二個(gè)以上細(xì)胞合并形成一個(gè)細(xì)胞的過(guò)程。異核體雜交細(xì)胞分裂現(xiàn)在是70頁(yè)\一共有99頁(yè)\編輯于星期三（2）促融方法生物學(xué)方法：仙臺(tái)病毒化學(xué)方法：PEG

物理方法：電脈沖打孔儀（3）應(yīng)用

A細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)間的相互作用

B膜蛋白的流動(dòng)性現(xiàn)在是71頁(yè)\一共有99頁(yè)\編輯于星期三C

基因定位D

單克隆抗體制備

B淋巴細(xì)胞腫瘤細(xì)胞MousecellHumancelldivision現(xiàn)在是72頁(yè)\一共有99頁(yè)\編輯于星期三現(xiàn)在是73頁(yè)\一共有99頁(yè)\編輯于星期三現(xiàn)在是74頁(yè)\一共有99頁(yè)\編輯于星期三E細(xì)胞周期相關(guān)因子的發(fā)現(xiàn)現(xiàn)在是75頁(yè)\一共有99頁(yè)\編輯于星期三四、細(xì)胞組分的分級(jí)分離通過(guò)逐級(jí)分離對(duì)細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器和各種成分的化學(xué)性質(zhì)和功能進(jìn)行研究的方法。勻漿分級(jí)分離分析

現(xiàn)在是76頁(yè)\一共有99頁(yè)\編輯于星期三勻漿液膜細(xì)胞器大分子

低滲超聲去污劑強(qiáng)制過(guò)濾研磨

細(xì)胞破壞現(xiàn)在是77頁(yè)\一共有99頁(yè)\編輯于星期三（一）離心法用于分離細(xì)胞器和大分子

配平低溫現(xiàn)在是78頁(yè)\一共有99頁(yè)\編輯于星期三

1.差速離心法

分離對(duì)象:不同大小和形狀的組分

（細(xì)胞核、細(xì)胞器）

具體方法:由低速到高速逐級(jí)沉降(repeat)現(xiàn)在是79頁(yè)\一共有99頁(yè)\編輯于星期三現(xiàn)在是80頁(yè)\一共有99頁(yè)\編輯于星期三2.速度沉降法

分離對(duì)象:不同大小、形狀的組分(沉降系數(shù)S)

比差速離心方法更精細(xì)

具體方法:

在離心管中予裝5%-20%蔗糖梯度的離心介質(zhì)

現(xiàn)在是81頁(yè)\一共有99頁(yè)\編輯于星期三3.平衡沉降法

分離對(duì)象:密度不同的組分（與大小、形狀無(wú)關(guān)）

具體方法：在離心管中予裝一定密度梯度的離心介質(zhì)（20%-70%蔗糖、CsCl）通常采用超速離心

現(xiàn)在是82頁(yè)\一共有99頁(yè)\編輯于星期三

（二）層析法（柱層析）主要用于分離、純化蛋白質(zhì)

填充柱填料（固定相）流動(dòng)相現(xiàn)在是83頁(yè)\一共有99頁(yè)\編輯于星期三

1.離子交換層析

層析介質(zhì):陰離子或陽(yáng)離子樹(shù)脂

分離原理:電荷

現(xiàn)在是84頁(yè)\一共有99頁(yè)\編輯于星期三

2.凝膠過(guò)濾層析層析介質(zhì):凝膠分離原理:分子大小

現(xiàn)在是85頁(yè)\一共有99頁(yè)\編輯于星期三3.親和層析

層析介質(zhì):

基質(zhì)+抗體底物

分離原理:

親和性現(xiàn)在是86頁(yè)\一共有99頁(yè)\編輯于星期三現(xiàn)在是87頁(yè)\一共有99頁(yè)\編輯于星期三4.高壓液相層析HPLC

基質(zhì)粒度?。?-10μm）、分辨率高、分離速度快

現(xiàn)在是88頁(yè)\一共有99頁(yè)\編輯于星期三(三)電泳法

主要用于分離蛋白質(zhì)、核酸

1.瓊脂糖凝膠電泳

分離對(duì)象:核酸

支持介質(zhì):瓊脂糖

凝固點(diǎn)40-45℃

不同濃度凝膠具有不同孔徑

電泳緩沖液:TAE\TBE

染料:溴化乙錠EB現(xiàn)在是89頁(yè)\一共有99頁(yè)\編輯于星期三(三)電泳法

主要用于分離蛋白質(zhì)、核酸

1.瓊脂糖凝膠電泳

分離對(duì)象:核酸

支持介質(zhì):瓊脂糖

凝固點(diǎn)40-45