生物化學(xué)課件核酸中文

第三章

核酸的結(jié)構(gòu)和功能StructureandFunctionofNucleicAcid中國(guó)藥科大學(xué)生物制藥教研室馮磊核酸(nucleicacid)

是以核苷酸為基本組成單位的生物大分子，攜帶和傳遞遺傳信息。核酸是一類重要的生物大分子，擔(dān)負(fù)著生命信息的儲(chǔ)存與傳遞。核酸是現(xiàn)代生物化學(xué)、分子生物學(xué)的重要研究領(lǐng)域，是基因工程操作的核心分子。核酸概述核酸的分類及分布

大部分存在于細(xì)胞核和線粒體內(nèi)。存在于胞核、胞液和線粒體。(deoxyribonucleicacid,DNA)(ribonucleicacid,RNA)脫氧核糖核酸

核糖核酸攜帶遺傳信息，決定細(xì)胞和個(gè)體的遺傳型(genotype)。參與遺傳信息的復(fù)制與表達(dá)。某些病毒RNA也可作為遺傳信息的載體。98％核中（染色體中）真核線粒體（mDNA）核外葉綠體（ctDNA）DNA擬核原核核外：質(zhì)粒（plasmid）病毒：DNA病毒核酸的種類和分布

核酸的發(fā)現(xiàn)：

1868MEISCHER-從膿球發(fā)現(xiàn)“核素”

1944AVERYetal-肺炎球菌轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)1952HERSHEY,CHASE-噬菌體標(biāo)記實(shí)驗(yàn)

1950CHARGAFFetal-CHARGAFF法則1953WATSON，CRICK-DNA雙螺旋

1973BOYER，COHEN-DNACloning(克?。?976DNASequencing(序列分析）

1990HumanGenomeProject人類基因組計(jì)劃

人類基因組計(jì)劃（humangenomeproject，HGP）

在全世界已深為人知，這應(yīng)該是當(dāng)今生命科學(xué)中最重大而熱門的課題。人類基因組計(jì)劃的最主要的目的是解讀人類基因組的正常結(jié)構(gòu)，功能，及基因的異常與人類疾病。

并由此會(huì)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)效益。

這項(xiàng)計(jì)劃是從1987年主要在美國(guó)以全基因組DNA測(cè)序?yàn)槟繕?biāo)開始進(jìn)行的（1990年正式啟動(dòng)）。耗資300多億美元并已完成。

基因組大小2.91GbpA+G含量54%T+C含量38%重復(fù)序列（不含異染色質(zhì)）35%編碼序列數(shù)目26588功能未知基因比例42%外顯子最多的基因Titin（234）SNP數(shù)量300萬個(gè)SNP密度1/1250bp人類基因組概況最長(zhǎng)的染色體2（240Mbp）最短的染色體Y（19Mbp）基因最多的染色體1（2453）基因最少的染色體Y（104）基因密度最大的染色體19（23/Mb）基因密度最小的染色體13，Y（5/Mb）重復(fù)序列含量最高的染色體19（57%）重復(fù)序列含量最低的染色體2，8，10，13，18（36%）人類基因組概況其它基因組完成情況種群物種基因組大小

(百萬對(duì))基因數(shù)序列測(cè)定

完成時(shí)間原核生物

支原體Mycoplasma0.584701995大腸桿菌E.colik124.64,3001997綠膿桿菌Pseudomonasaeruginosa6.3

5,5002001真核生物

(單細(xì)胞)

釀酒酵母S.cerevisiae126,2001996裂變酵母S.pombi144,9002001幽門螺桿菌Helicobacterpylori1.71,5002001多細(xì)胞

線蟲C.elegans10018,4001998果蠅drosophila14013,6002000脊椎動(dòng)物

陣風(fēng)魚Fugurubripes40030,000??人類3,00040,000?2003小鼠3,30040,000?2007植物

擬南芥Arabidopsis12525,0002000水稻56038,0002005玉米5,00030,000??小麥17,00030,000??第一節(jié)核酸的化學(xué)組成及一級(jí)結(jié)構(gòu)TheChemicalComponentandPrimaryStructureofNucleicAcid核酸的基本組成單位是核苷酸

(nucleotide)。堿基戊糖磷酸核苷酸核苷核酸DNA的基本組成單位是脫氧核糖核苷酸。RNA的基本組成單位是核糖核苷酸。元素組成：CHONP（S）嘌呤

嘧啶

堿基腺嘌呤（A）鳥嘌呤（G）胞嘧啶（C）胸腺嘧啶（T）尿嘧啶（U）DNA、RNA均有DNA有RNA有一、核苷酸的結(jié)構(gòu)每種核酸都含有四種堿基。嘌呤(purine)腺嘌呤(adenine,A)鳥嘌呤(guanine,G)堿基嘧啶(pyrimidine)胞嘧啶(cytosine,C)尿嘧啶(uracil,U)胸腺嘧啶(thymine,T)

五種堿基都能形成酮式-烯醇式或氨基-亞氨基的互變異構(gòu)。這兩種異構(gòu)體的平衡關(guān)系受介質(zhì)酸堿環(huán)境的影響。

戊糖（構(gòu)成RNA）核糖(ribose)（構(gòu)成DNA）脫氧核糖(deoxyribose)堿基和核糖（或脫氧核糖）通過糖苷鍵連接形成核苷(nucleoside)

（或脫氧核苷）。核苷酸：AMP,GMP,UMP,CMP脫氧核苷酸：dAMP,dGMP,dTMP,dCMP

核苷（脫氧核苷）和磷酸以酯鍵連接形成核苷酸（脫氧核苷酸）。

多磷酸核苷酸：

NMP，NDP，NTP

環(huán)化核苷酸:cAMP，cGMP二、核酸的一級(jí)結(jié)構(gòu)定義核酸中核苷酸的排列順序。由于核苷酸間的差異主要是堿基不同，所以也稱為堿基序列。5′端3′端核苷酸之間以3,5-磷酸二酯鍵連接形成多核苷酸鏈，即核酸。CGA書寫方法

DNA與RNA的區(qū)別核酸堿基戊糖DNAA、G、C、T脫氧核糖RNAA、G、C、U核糖第二節(jié)DNA的空間結(jié)構(gòu)與功能DimensionalStructureandFunctionofDNA一、DNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)——雙螺旋結(jié)構(gòu)（一）DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的研究背景

堿基組成分析Chargaff規(guī)則：[A]=

[T][G]=

[C]

堿基的理化數(shù)據(jù)分析A-T、G-C以氫鍵配對(duì)較合理DNA纖維的X-線衍射圖譜分析1.同一生物的不同組織的DNA堿基組成相同；2.同一種生物DNA堿基組成不隨生物體的年齡、營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)或者環(huán)境變化而改變；3.幾乎所有的DNA，無論種屬來源如何，其腺嘌呤摩爾含量與胸腺嘧啶摩爾含量相同［A］=［T］，鳥嘌呤摩爾含量與胞嘧啶摩爾含量相同［G］=［C］，總的嘌呤摩爾含量與總的嘧啶摩爾含量相同［A］＋［G］=［C］＋［T］。4.不同生物來源的DNA堿基組成不同，表現(xiàn)在A＋T/G＋C比值的不同。這些結(jié)果后來為DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)模型提供了一個(gè)有力的佐證。DNA堿基組成規(guī)律：

不同生物來源的DNA四種堿基比例關(guān)系DNA來源腺嘌呤（A）胸腺嘧啶（T）鳥嘌呤（G）胞嘧啶（C）（A+T）/（G+C）大腸桿菌25.424.824.125.71.01小麥27.327.122.822.71.21鼠28.628.421.421.51.33豬：肝29.429.720.520.51.43胸腺30.028.920.420.7脾29.629.220.420.8酵母31.332.918.717.51.079已知的核酸化學(xué)數(shù)據(jù)（二）DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型要點(diǎn)1.兩條鏈反向平行，圍繞同一中心軸構(gòu)成右手雙螺旋(doublehelix)。螺旋直徑2nm，表面有大溝和小溝。2.磷酸-脫氧核糖骨架位于螺旋外側(cè)，堿基垂直于螺旋軸而伸入內(nèi)側(cè)。每圈螺旋含10個(gè)堿基對(duì)

(bp)，螺距為3.4nm。堿基平面與縱軸垂直，糖環(huán)平面與縱軸平行3.兩條鏈通過堿基間的氫鍵相連，A對(duì)T有兩個(gè)氫鍵，C對(duì)G有三個(gè)氫鍵，這種A-T、C-G配對(duì)的規(guī)律，稱為堿基互補(bǔ)規(guī)則。4.維持雙螺旋穩(wěn)定的因素：橫向?yàn)闅滏I，縱向?yàn)閴A基間的堆積力。堿基互補(bǔ)配對(duì)TAGC（三）DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的多樣性Z型DNAB型DNAA型DNA(1)B-DNA螺旋：DNA在92%相對(duì)濕度的鈉鹽中的構(gòu)型標(biāo)準(zhǔn)的

Watson,Crick雙螺旋，細(xì)胞正常狀態(tài)下DNA存在的構(gòu)型。(2)A-DNA螺旋：DNA在75%相對(duì)濕度的鈉鹽中的構(gòu)型。(3)C-DNA螺旋：DNA在66%相對(duì)濕度的鋰鹽中的構(gòu)型。(4)Z-DNA螺旋：左手的DNA螺旋，這種螺旋可能在基因表達(dá)或遺傳重組中起作用。（四）與DNA堿基順序相關(guān)的特殊二級(jí)結(jié)構(gòu):(1)回文序列所謂回文序列就是指DNA某一片段旋轉(zhuǎn)180。后,順序不變的序列，回文序列中的單鏈可形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)。雙鏈可形成十字架結(jié)構(gòu)。這種發(fā)夾結(jié)構(gòu)或十字架結(jié)構(gòu)在大腸桿菌細(xì)胞DNA中已有發(fā)現(xiàn).核酸分子中的回文序列

回文序列中的單鏈可形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)雙鏈回文序列可形成十字架結(jié)構(gòu)（2）鏡象結(jié)構(gòu)

所謂鏡象結(jié)構(gòu)就是指DNA某一片段在一條鏈上出現(xiàn)顛倒重復(fù)的序列。

多嘌呤-多嘧啶的鏡象序列可形成三螺旋結(jié)構(gòu)(H-螺旋或Hoogsteen螺旋):該螺旋常處在許多真核細(xì)胞基因的表達(dá)調(diào)節(jié)區(qū)?？赡芘c基因表達(dá)的調(diào)節(jié)有關(guān).四鏈DNA：可能存在于真核細(xì)胞染色體的端粒中。端粒(telomeres)是染色體末端的結(jié)構(gòu)，它是由許多富含鳥嘌呤核苷酸的特殊的重復(fù)順序DNA及相關(guān)蛋白質(zhì)組成的復(fù)合體。端粒酶（telomerase）是催化端粒合成的酶。端粒酶是由蛋白質(zhì)及RNA組成的，它具有逆轉(zhuǎn)錄酶的活性，能與自身攜帶的RNA為模板，逆轉(zhuǎn)錄合成端粒DNA

穩(wěn)定DNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的作用力：氫鍵（橫向作用力）堿基堆積力（縱向作用力）

離子鍵（減少雙鏈間的靜電斥力）。二、DNA的超螺旋結(jié)構(gòu)及其在染色質(zhì)中的組裝（三級(jí)結(jié)構(gòu)）（一）DNA的超螺旋結(jié)構(gòu)超螺旋結(jié)構(gòu)(superhelix或supercoil)DNA雙螺旋鏈再盤繞即形成超螺旋結(jié)構(gòu)。正超螺旋(positivesupercoil)盤繞方向與DNA雙螺旋方同相同負(fù)超螺旋(negativesupercoil)盤繞方向與DNA雙螺旋方向相反意義DNA超螺旋結(jié)構(gòu)整體或局部的拓?fù)鋵W(xué)變化及其調(diào)控對(duì)于DNA復(fù)制和RNA轉(zhuǎn)錄過程具有關(guān)鍵作用。

自從1965年Vinograd等人發(fā)現(xiàn)多瘤病毒的環(huán)形DNA的超螺旋以來，現(xiàn)已知道絕大多數(shù)原核生物都是共價(jià)封閉環(huán)(covalentlyclosedcircle,CCC)分子，這種雙螺旋環(huán)狀分子再度螺旋化成為超螺旋結(jié)構(gòu)(superhelix或supercoil)。（二）原核生物DNA的高級(jí)結(jié)構(gòu)（三）DNA在真核生物細(xì)胞核內(nèi)的組裝真核生物染色體由DNA和蛋白質(zhì)構(gòu)成，其基本單位是核小體(nucleosome)。核小體的組成DNA：約200bp組蛋白：H1H2A，H2BH3H4串珠狀核小體結(jié)構(gòu)核小體螺線管真核生物染色體DNA組裝串珠狀核小體DNA雙螺旋片段染色質(zhì)纖維伸展形染色質(zhì)片段密集形染色質(zhì)片段整個(gè)染色體三、DNA的功能DNA的基本功能是以基因的形式荷載遺傳信息，并作為基因復(fù)制和轉(zhuǎn)錄的模板。它是生命遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ)，也是個(gè)體生命活動(dòng)的信息基礎(chǔ)。基因從結(jié)構(gòu)上定義，是指DNA分子中的特定區(qū)段，其中的核苷酸排列順序決定了基因的功能。肺炎雙球菌的轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)OswaldAvery(1944)

噬菌體的標(biāo)記實(shí)驗(yàn)

真核生物與原核生物DNA結(jié)構(gòu)特點(diǎn)差異真核生物基因組結(jié)構(gòu)特點(diǎn)1.真核生物基因組DNA與蛋白質(zhì)結(jié)合形成染色體，儲(chǔ)存于細(xì)胞核內(nèi)，除配子細(xì)胞外，體細(xì)胞內(nèi)的基因組是雙份的(即雙倍體，diploid)，即有兩份同源的基因組。2.真核細(xì)胞基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為單順反子(monocistron)，即一個(gè)結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)錄、翻譯成一個(gè)mRNA分子，一條多肽鏈。3.存在大量重復(fù)序列，即在整個(gè)DNA中有許多重復(fù)出現(xiàn)的核苷酸順序，重復(fù)序列長(zhǎng)度可長(zhǎng)可短，短的僅含兩個(gè)核苷酸，長(zhǎng)的多達(dá)數(shù)百、乃至上千。重復(fù)頻率也不盡相同：（1） 高度重復(fù)序列：重復(fù)頻率可達(dá)106次，約5～100bp，這種序列G-C含量高于DNA的其它結(jié)構(gòu)，因此在氯化銫密度梯度離心時(shí)，常在DNA的主峰旁顯示一個(gè)小峰，此小峰稱為衛(wèi)星峰，故將這部分DNA稱為衛(wèi)星DNA。（2） 中度重復(fù)序列：重復(fù)頻率可達(dá)103～104次，長(zhǎng)度約100～300bp，rRNA基因、tRNA基因、組蛋白基因等，大多為中度重復(fù)序列。此外在這類重復(fù)序列中，還有一類可移動(dòng)的片段，稱為逆轉(zhuǎn)座子（retroposon），它們可能在進(jìn)化過程中發(fā)揮重要作用。（3） 單拷貝或低度重復(fù)序列：指在整個(gè)基因組中只出現(xiàn)一次或很少幾次的核苷酸序列。在真核細(xì)胞中，除組蛋白以外，其它所有蛋白質(zhì)都是由DNA中這種單拷貝序列決定的。這種序列大小不等，每一個(gè)順序決定一個(gè)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，稱之為結(jié)構(gòu)基因。在人基因組中占約60～65%，因此所含信息量最大。4.基因組中不編碼的區(qū)域多于編碼區(qū)域。5.基因是不連續(xù)的內(nèi)含子(intron)：一個(gè)基因中，含有不出現(xiàn)在成熟RNA中的DNA順序外顯子(exon)：一個(gè)基因中，含有出現(xiàn)在成熟RNA中的DNA順序斷裂基因：基因被內(nèi)含子分割成不連續(xù)的為成熟RNA編碼的順序6.基因組遠(yuǎn)大于原核生物的基因組。人類基因組的大小為3.2×109bp，真正用于編碼蛋白質(zhì)的序列僅占基因組的1.1%-1.4%，編碼蛋白質(zhì)的基因約為31000個(gè)。原核生物基因組結(jié)構(gòu)特點(diǎn)1.基因組較小，沒有核膜包裹，且形式多樣，如病毒基因組可能是DNA，也可能是RNA，可能是單鏈的，也可能是雙鏈的，可能是閉環(huán)分子，也可能是線性分子；細(xì)菌染色體基因組則常為環(huán)狀雙鏈DNA分子，并與其中央的RNA和支架蛋白構(gòu)成一致密的區(qū)域，稱為類核(nucleoid)。2.功能相關(guān)的結(jié)構(gòu)基因常常串連在一起，并轉(zhuǎn)錄在同一個(gè)mRNA分子中，稱為多順反子mRNA(polycistronicmRNA)，然后再加工成各種蛋白質(zhì)的模板mRNA。3.DNA分子絕大部分用于編碼蛋白質(zhì)，不編碼部分(又稱間隔區(qū))通常包含控制基因表達(dá)的順序。DNA序列的功能單位就是基因序列這句話不能算完全正確。因?yàn)榇嬖谥罅康姆腔蛐蛄校饕褪侵竷苫蛑g的間隔序列。目前對(duì)這些非基因序列的認(rèn)知非常有限，并不能完全知曉其功能，但可以肯定的是非基因序列必定對(duì)基因序列的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生影響。同時(shí)需要強(qiáng)調(diào)的是，基因序列當(dāng)中的插入序列即內(nèi)含子（非蛋白編碼序列）對(duì)外顯子（蛋白編碼序列）的功能也有一定的影響。為了研究這些目前不確定的DNA結(jié)構(gòu)及功能，基因組學(xué)（genomics）應(yīng)運(yùn)而生。可分為結(jié)構(gòu)基因組學(xué)和功能基因組學(xué)。需要使用的研究方法：基因芯片技術(shù)基因芯片技術(shù)的概念就是將大量探針分子固定于支持物上，根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原理，與標(biāo)記的樣品分子進(jìn)行雜交，通過檢測(cè)雜交信號(hào)的強(qiáng)度及分布進(jìn)而獲取樣品中靶分子的數(shù)量和序列信息?；蛐酒幕驹砘蛐酒墓ぷ髟砼c經(jīng)典的核酸分子雜交方法(southern、northern)一致，應(yīng)用已知核酸序列作為靶基因與互補(bǔ)的探針核苷酸序列雜交，通過隨后的信號(hào)檢測(cè)進(jìn)行定性與定量分析。具體講即是將許多特定的寡核苷酸片段或cDNA基因片段作為靶基因，有規(guī)律地排列固定于支持物上；樣品DNA/RNA通過PCR擴(kuò)增、體外轉(zhuǎn)錄等技術(shù)摻入熒光標(biāo)記分子或放射性同位素作為探針；然后按堿基配對(duì)原理將兩者進(jìn)行雜交；再通過熒光或同位素檢測(cè)系統(tǒng)對(duì)芯片進(jìn)行掃描，由計(jì)算機(jī)系統(tǒng)對(duì)每一探針上的信號(hào)作出比較和檢測(cè)，從而得出所需要的信息。

基因芯片發(fā)展歷史Southern&NorthernBlotDotBlotMacroarrayMicroarray第三節(jié)

RNA的結(jié)構(gòu)與功能StructureandFunctionofRNA動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)主要RNA的種類及功能一、信使RNA的結(jié)構(gòu)與功能hnRNA內(nèi)含子(intron)mRNA*mRNA成熟過程

外顯子(exon)*mRNA結(jié)構(gòu)特點(diǎn)1.大多數(shù)真核mRNA的5′末端均在轉(zhuǎn)錄后加上一個(gè)7-甲基鳥苷，同時(shí)第一個(gè)核苷酸的C′2也是甲基化，形成帽子結(jié)構(gòu)：m7GpppNm-。2.大多數(shù)真核mRNA的3′末端有一個(gè)多聚腺苷酸(polyA)結(jié)構(gòu)，稱為多聚A尾。帽子結(jié)構(gòu)mRNA核內(nèi)向胞質(zhì)的轉(zhuǎn)位mRNA的穩(wěn)定性維系翻譯起始的調(diào)控帽子結(jié)構(gòu)和多聚A尾的功能mRNA的功能：作為蛋白質(zhì)合成的模板。*

tRNA的一級(jí)結(jié)構(gòu)特點(diǎn)含稀有堿基較多

3′末端為—CCA-OH5′末端大多數(shù)為G

由70~90個(gè)核苷酸組成二、轉(zhuǎn)運(yùn)RNA的結(jié)構(gòu)與功能

稀有堿基*tRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)——三葉草形氨基酸臂額外環(huán)*tRNA的三級(jí)結(jié)構(gòu)——倒L形*tRNA的功能活化、搬運(yùn)氨基酸到核糖體，參與蛋白質(zhì)的翻譯。*rRNA的結(jié)構(gòu)三、核蛋白體RNA的結(jié)構(gòu)與功能*rRNA的功能參與組成核蛋白體，作為蛋白質(zhì)生物合成的場(chǎng)所。核糖體的組成原核生物真核生物小亞基30S40SrRNA16S18S蛋白質(zhì)21種33種大亞基50S60SrRNA23S5S28S5.8S5S蛋白質(zhì)33種49種核糖體70S80S四、其他小分子RNA及RNA組學(xué)除了上述三種RNA外，細(xì)胞的不同部位存在的許多其他種類的小分子RNA，統(tǒng)稱為非mRNA小RNA(smallnon-messengerRNAs，snmRNAs)。

snmRNAssnmRNAs的種類核內(nèi)小RNA(snRNA)核仁小RNA(snoRNA)胞質(zhì)小RNA(scRNA)催化性小RNA小片段干擾RNA(siRNA)snmRNAs的功能參與hnRNA和rRNA的轉(zhuǎn)錄后加工和轉(zhuǎn)運(yùn)以及基因表達(dá)過程的調(diào)控等。是研究細(xì)胞中snmRNAs的種類、結(jié)構(gòu)和功能的科學(xué)。同一生物體內(nèi)不同種類的細(xì)胞、同一細(xì)胞在不同時(shí)間、不同狀態(tài)下snmRNAs的表達(dá)具有時(shí)間和空間特異性。RNA組學(xué)(RNomics)什么是RNAi？RNAi（RNAinterference）是指在生物體細(xì)胞內(nèi)，dsRNA引起同源mRNA的特異性降解，因而抑制相應(yīng)基因表達(dá)的過程。一種轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默生物體內(nèi)普遍存在抵御外在感染的重要保護(hù)機(jī)制RNAi的發(fā)展歷程大事記1995，RNAi現(xiàn)象首次在線蟲中發(fā)現(xiàn)。Cell，1995，81：611-6201998，RNAi概念的首次提出。Nature,1998,391（6669）：8061999，RNAi作用機(jī)制模型的提出。Cell，2000，101（1）：25-33

在線蟲、果蠅、擬南芥及斑馬魚等多種生物內(nèi)發(fā)現(xiàn)

RNAi現(xiàn)象。2001，RNAi技術(shù)成功誘導(dǎo)培養(yǎng)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞基因沉默現(xiàn)象。Nature，2001，411（6836）：494－498

RNAi技術(shù)被《Science》評(píng)為2001年度的十大科技進(jìn)展之一。2002至今，有關(guān)RNAi的研究蓬勃開展，是分子生物學(xué)領(lǐng)域最為熱門的方向之一。預(yù)備知識(shí)dsRNA：雙鏈RNA，包含正義鏈和反義鏈Dicer：屬于RNaseⅢ

家族，是dsRNA的特異性核酸內(nèi)切酶siRNA：smallinterferingRNA，RNAi的關(guān)鍵效應(yīng)分子，21-23個(gè)nt大小的雙鏈RNARISC：RNA-inducingsilencingcomplex，具有核酸內(nèi)切、外切以及解旋酶活性RdRP：RNA-dependentRNApolymerases，是RNAi的調(diào)節(jié)因子，使RNAi可以在生物體內(nèi)傳遞RNAi引發(fā)的基因沉默機(jī)制GiselaStorz,Science,296(5571):1263-1265,2002.RNAi的分子生物學(xué)特性RNAi是siRNA介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默RNAi作用針對(duì)的是靶基因的外顯子序列高特異性，只針對(duì)同源靶向mRNA高效性，極低濃度的siRNA就能完全抑制基因表達(dá)RNAi作用具有可傳遞性RNAi的研究方法siRNA的設(shè)計(jì)根據(jù)靶向mRNA進(jìn)行設(shè)計(jì)目前已證實(shí)的siRNA序列

互聯(lián)網(wǎng)上的幫助

RNAi的研究方法siRNA的制備方法體外制備

---化學(xué)合成siRNA---體外轉(zhuǎn)錄合成siRNA---用RNaseⅢ

消化長(zhǎng)片段dsRNA得到siRNA體內(nèi)表達(dá)

---利用質(zhì)粒或病毒載體表達(dá)siRNA---PCR方法制備siRNA的表達(dá)框架siRNA制備方法比較合成方法特點(diǎn)適用不適用化學(xué)合成價(jià)格高已找到最有效siRNA，大量篩選體外轉(zhuǎn)錄毒性小，穩(wěn)定性好，效率高篩選大量需要，特定的，長(zhǎng)期用RNaseⅢ消化長(zhǎng)片段節(jié)省快速而經(jīng)濟(jì)的研究某基因缺失表型不宜長(zhǎng)期，特定的siRNA研究及基因治療siRNA表達(dá)載體價(jià)格較高，常用特定siRNA，穩(wěn)定篩選siRNA表達(dá)框架表達(dá)穩(wěn)定，測(cè)序困難篩選長(zhǎng)期研究RNAi的應(yīng)用基因功能研究基因治療

---基因缺陷

---病毒感染

---腫瘤疾病其它應(yīng)用

---植物代謝

---細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)通路

基因治療腫瘤細(xì)胞的MDR1基因編碼的p-gp糖蛋白過度表達(dá)，引起腫瘤的MDRHait等針對(duì)MDR乳腺癌細(xì)胞的MDR1基因，使用化學(xué)合成的siRNA進(jìn)行干擾結(jié)果表明：MDR1的mRNA和p-gp水平顯著下降，細(xì)胞內(nèi)紫杉醇和阿霉素積累增多，而且紫杉醇和阿霉素對(duì)乳腺癌細(xì)胞的細(xì)胞毒性大為增強(qiáng)。CancerRes，2003，63（7）：1515-1519基因治療植物代謝2003年，Ogita等首次報(bào)道RNAi技術(shù)在咖啡中的成功應(yīng)用。選取咖啡因生物合成途徑中的關(guān)鍵酶之一可可堿合酶，將siRNA轉(zhuǎn)入植株內(nèi)，從而抑制咖啡因的合成，轉(zhuǎn)基因咖啡植株的咖啡因產(chǎn)量比正常植株低70％，可以用于生產(chǎn)低咖啡因含量的咖啡豆。是RNAi技術(shù)在藥用植物代謝工程領(lǐng)域的經(jīng)典范例。Nature，2003，423（6942）：823藥用植物代謝2004年，RNAi在罌粟中成功應(yīng)用?？纱蛲c嗎啡具有共同的前體分子－(S)-網(wǎng)狀番茄枝堿。采用RNAi技術(shù)抑制可待因酮還原酶基因家族中所有基因的表達(dá)，使(S)-網(wǎng)狀番茄枝堿和甲基-(S)-網(wǎng)狀番茄枝堿積聚，從而提高罌粟中嗎啡的含量。為增加植物中高藥用價(jià)值的生物堿產(chǎn)量提供了成功的案例。NatBiotechnol，2004，22（12）：1559-1566核酸的理化性質(zhì)ThePhysicalandChemicalCharactersofNucleicAcid第四節(jié)一、核酸的一般理化性質(zhì)核酸為多元酸，具有較強(qiáng)的酸性；游離態(tài)的核酸等電點(diǎn)較低，一般與金屬離子結(jié)合存在，提高其溶解度；pH4~11之間，核酸較為穩(wěn)定；核酸（DNA和RNA）都是極性分子，都溶于水，而不溶于有機(jī)試劑；DNA是高分子物質(zhì)，粘度極大；在260nm波長(zhǎng)有最大吸收峰，是由堿基的共軛雙鍵決定的。這一特性常用作核酸的定性、定量分析。1.DNA或RNA的定量OD260=1.0相當(dāng)于50g/ml雙鏈DNA40g/ml單鏈DNA（或RNA）20g/ml寡核苷酸2.判斷核酸樣品的純度DNA純品:OD260/OD280=1.8RNA純品:OD260/OD280=2.0OD260的應(yīng)用二、DNA的變性(denaturation)定義：在某些理化因素作用下，DNA雙鏈解開成兩條單鏈的過程。變性因素：過量酸，堿，加熱等。例如：慢慢地升高DNA溶液的溫度，隨著溫度的升高，堿基對(duì)之間的氫鍵被破壞，越來越多的堿基對(duì)被拆開，當(dāng)DNA的溶液被加熱到一定溫度以上時(shí)，雙鏈DNA結(jié)構(gòu)被破壞，最后雙鏈完全分開，形成兩個(gè)單鏈。DNA變性的本質(zhì)是雙鏈間氫鍵的斷裂注意與DNA降解區(qū)分變性后理化性質(zhì)的主要改變：OD260增高 粘度下降核酸復(fù)性時(shí)，紫外吸收降低，由于核酸復(fù)性而引起紫外吸收降低的現(xiàn)象，稱為減色效應(yīng)。由于核酸變性而引起紫外吸收增加的現(xiàn)象，稱之增色效應(yīng)。DNA的紫外吸收光譜增色效應(yīng)：DNA變性時(shí)其溶液OD260增高的現(xiàn)象。解鏈曲線：在連續(xù)加熱DNA的過程中以溫度對(duì)A260值作圖，所得的曲線稱為解鏈曲線。由雙螺旋到變性狀態(tài)之間的陡變區(qū)反映了雙螺旋DNA中堆積的、形成氫鍵的堿基對(duì)的破壞程度。

Tm：紫外光吸收值達(dá)到最大值的50%時(shí)的溫度稱為DNA的解鏈溫度，又稱融解溫度(meltingtemperature,Tm)。其大小與G+C含量成正比。

有機(jī)溶劑，如乙醇可以降低DNA的Tm，因?yàn)橛袡C(jī)溶劑可以降低分子內(nèi)部的疏水相互作用強(qiáng)度。一些離液劑，如尿素、鹽酸胍和甲酰胺也可以降低雙螺旋DNA的穩(wěn)定性。測(cè)定可以根據(jù)下面公式計(jì)算出DNA的堿基組成。

G-C％＝（Tm－69.3）×2.44核酸中堿基組成對(duì)熔點(diǎn)溫度的影響各種細(xì)菌的DNA熔點(diǎn)溫度（Tm）與其G＋C堿基對(duì)的關(guān)系三、DNA的復(fù)性與分子雜交

DNA復(fù)性(renaturation)的定義在適當(dāng)條件下，變性DNA的兩條互補(bǔ)鏈可恢復(fù)天然的雙螺旋構(gòu)象，這一現(xiàn)象稱為復(fù)性。減色效應(yīng)DNA復(fù)性時(shí)，其溶液OD260降低。熱變性的DNA經(jīng)緩慢冷卻后即可復(fù)性，這一過程稱為退火(annealing)。

熱變性的DNA在復(fù)性過程中，具有堿基序列部分互補(bǔ)的不同的DNA之間或DNA與RNA之間形成雜化雙鏈的現(xiàn)象。核酸分子雜交(hybridization)：不同來源的核酸可以形成雜化體

將從人和小鼠細(xì)胞分離出的雙螺旋DNA分別通過加熱使它們完全變性，然后混合在一起，于65℃下保持?jǐn)?shù)小時(shí)，小鼠DNA鏈與對(duì)應(yīng)的互補(bǔ)的小鼠DNA鏈重新形成小鼠雙鏈DNA，同樣人DNA鏈也與互補(bǔ)的人DNA鏈退火，重新形成人的雙鏈DNA。

然而在退火時(shí)，一些小鼠DNA鏈卻與人DNA鏈結(jié)合在一起形成了雜化的雙螺旋DNA。這表明不同生物在進(jìn)化上有某些聯(lián)系。在多數(shù)情況下，這些能形成雜化體的DNA編碼的蛋白質(zhì)或RNA可能具有相似的序列（同源性）。生物之間的進(jìn)化關(guān)系越接近，它們的DNA之間的雜化就越廣泛。除了DNA之間可以形成雜化體之外，DNA與RNA之間只要是存在著互補(bǔ)堿基對(duì)也能形成雜化的雙螺旋DNA-RNA。完全變性的樣品1DNA完全變性的樣品2DNA樣品1雙螺旋樣品2雙螺旋雜化雙螺旋混合并冷卻變性復(fù)性復(fù)性核酸分子雜交的應(yīng)用研究DNA分子中某一種基因的位置定兩種核酸分子間的序列相似性檢測(cè)某些專一序列在待檢樣品中存在與否是基因芯片技術(shù)的基礎(chǔ)第五節(jié)

核酸酶

Nuclease核酸酶是指所有可以水解核酸的酶依據(jù)底物不同分類DNA酶(deoxyribonuclease,DNase)RNA酶(ribonuclease,RNase)依據(jù)切割部位不同分類核酸內(nèi)切酶：

限制性核酸內(nèi)切酶非特異性核酸內(nèi)切酶核酸外切酶：

5′→3′或3′→5′核酸外切酶。核酸酶催化核酸的磷酸二酯鍵水解

催化核酸中磷酸二酯鍵的水解的酶統(tǒng)稱為核酸酶。核糖核酸酶只作用于RNA，而脫氧核糖核酸酶只作用于DNA。但有些核酸酶既催化RNA水解，也催化DNA水解。象蛋白酶一樣，核酸酶可以根據(jù)酶作用的部位不同分為外切核酸酶和內(nèi)切核酸酶。外切核酸酶水解磷酸二酯鍵后從多核苷酸鏈的末端釋放核苷酸殘基；而內(nèi)切酶可以在多核苷酸鏈內(nèi)的不同位置水解磷酸二酯鍵。水解時(shí)，既可以在3ˊ,5ˊ-磷酸二酯鍵的3ˊ酯鍵處（A），也可以在5ˊ酯鍵處（B）切斷磷酸二酯鍵。一種類型的水解可以產(chǎn)生5ˊ-單磷酸和一個(gè)3ˊ羥基，而另一種水解方式可以產(chǎn)生3ˊ-單磷酸和5ˊ-羥基。核酸酶切位點(diǎn)限制性內(nèi)切酶在特殊部位催化雙螺旋DNA水解

限制性內(nèi)切酶是一類重要的作用于DNA的內(nèi)切酶。限制性內(nèi)切酶術(shù)語來自一種現(xiàn)象，即某些細(xì)菌可以通過特異地破壞侵入的病毒DNA來阻止嗜菌體的感染。這樣的細(xì)菌稱之限制性宿主，因?yàn)樗鼈兛梢韵拗仆庠碊NA的表達(dá)。限制性宿主可以合成核酸酶，該酶可在特殊的序列區(qū)降解外源DNA，但宿主細(xì)胞本身的DNA并不受該核酸酶的作用。這是因?yàn)樗拗鱀NA可被內(nèi)切酶識(shí)別的特殊部位的某些堿基已經(jīng)被甲基化了，內(nèi)切酶不能催化已修飾底物的水解。所以任何進(jìn)入宿主細(xì)胞的，在酶識(shí)別的特殊部位沒有甲基化的DNA都會(huì)受到限制性內(nèi)切酶的切割。限制性內(nèi)切酶識(shí)別特殊的DNA序列酶切位點(diǎn)酶切位點(diǎn)對(duì)稱軸平末端粘性末端參與DNA的合成與修復(fù)及RNA合成后的剪接等重要基因復(fù)制和基因表達(dá)過程負(fù)責(zé)清除多余的、結(jié)構(gòu)和功能異常的核酸，同時(shí)也可以清除侵入細(xì)胞的外源性核酸在消化液中降解食物中的核酸以利吸收體外重組DNA技術(shù)中的重要工具酶生物體內(nèi)的核酸酶負(fù)責(zé)催化細(xì)胞內(nèi)外核酸的降解

核酸酶的功能

核酶催化性DNA(DNAzyme)人工合成的寡聚脫氧核苷酸片段，也能序列特異性降解RNA。催化性RNA(ribozyme)

序列特異性的核酸內(nèi)切酶參與RNA轉(zhuǎn)錄后加工修飾作為針對(duì)病毒或腫瘤基因的藥物降解mRNA。第六節(jié)

核酸提取及鑒定脫氧核糖核酸（DNA）的提取

不同的組織來源，抽取DNA的方法有所不同。

植物組織：一般都采用了CTAB的方法。

CTAB（十六烷基三甲基溴化氨）溶解植物細(xì)胞膜，有利于核酸與蛋白質(zhì)解離，并與DNA形成CTAB-DNA復(fù)合物，防止DNA剪切（降解），同時(shí)減輕細(xì)胞壁多糖對(duì)DNA提取的影響。提取液中加入PVP和-巰基乙醇能防止酚類物質(zhì)的氧化。在低鹽條件下，CTAB-DNA復(fù)合物離心沉淀，與多糖類、色素、多酚物質(zhì)和蛋白質(zhì)分離。植物總DNA的微量提取0.1-0.2g葉于液氮中研磨成粉

加0.5ml65℃預(yù)熱的CTAB提取緩沖液65℃水浴中提取30min，間歇混勻加0.5ml氯仿-異戊醇（24:1）混勻抽提

12000rpm離心10min

上清液中加2/3體積預(yù)冷異丙醇-20℃30min4℃8000rpm離心5min76％乙醇漂洗20min溶于400lTE，加1lRNaseA,37℃30min等體積酚-氯仿抽提，離心同上上清液加等體積的氯仿-異戊醇，離心上清液加3MNaAc至0.3M，混勻加2倍體積無水乙醇，-20

℃下30min以上10000rpm離心10min，棄上清液80％乙醇洗沉淀2次，吹干，溶于適量TE，備用細(xì)菌質(zhì)粒DNA的提取：堿裂解法堿法提取主要是利用共價(jià)閉合環(huán)狀質(zhì)粒與線性染色質(zhì)在拓?fù)鋵W(xué)上的差異來分離它們，在堿性pH，DNA變性，恢復(fù)中性時(shí)，線性染色體DNA不能準(zhǔn)確復(fù)性，與其它大分子共沉淀，而質(zhì)粒DNA卻可以準(zhǔn)確復(fù)性，留在上清中。堿性下，變性蛋白是可溶的，酸性、中性下變性蛋白不溶而沉淀。幾乎所有純化質(zhì)粒的方法都用到質(zhì)粒DNA分子相對(duì)較小和共價(jià)閉合環(huán)狀這兩個(gè)特性。由于操作原因提取的質(zhì)粒可有三種結(jié)構(gòu)：超螺旋、開環(huán)和復(fù)制中間體（即沒有復(fù)制完全的兩個(gè)質(zhì)粒連在了一起）質(zhì)粒(Plasmid)是一種染色體外的穩(wěn)定遺傳因子,大小從1-200kb不等,為雙鏈、閉環(huán)的DNA分子,并以超螺旋狀態(tài)存在于宿主的細(xì)胞質(zhì)中。質(zhì)粒主要發(fā)現(xiàn)于細(xì)菌、放線菌和真菌細(xì)胞中，它具有自主復(fù)制和轉(zhuǎn)錄能力,能在子代細(xì)胞中保持恒定的拷貝數(shù),并表達(dá)所攜帶的遺傳信息。質(zhì)粒的存在使宿主具有一些額外的特性,如對(duì)抗生素的抗性等。常見的天然質(zhì)粒有F質(zhì)粒(又稱F因子或性質(zhì)粒)、R質(zhì)粒和Col質(zhì)粒。相關(guān)基本知識(shí)

質(zhì)粒在細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制一般有兩種類型:

嚴(yán)謹(jǐn)控制型(Stringentcontrol)

松馳控制型(Relaxedcontrol)

前者只在細(xì)胞周期的一定階段進(jìn)行復(fù)制,當(dāng)染色體不復(fù)制時(shí),它也不能復(fù)制,通常每個(gè)細(xì)胞內(nèi)只含有1個(gè)或幾個(gè)質(zhì)粒,如F因子。后者的質(zhì)粒在整個(gè)細(xì)胞周期中隨時(shí)可以復(fù)制,在每個(gè)細(xì)胞中有許多拷貝,一般在20個(gè)以上,如Col質(zhì)粒。一個(gè)理想的質(zhì)?？寺≥d體應(yīng)具有的特性:（1）分子量小；（2）多拷貝、松馳控制型；（3）具有多種常用的限制性內(nèi)切酶的單酶切位點(diǎn),即多克隆位點(diǎn)(MCS,multiplecloningsites)；（4）能插入較大的外源DNA片段；（5）具有容易操作的檢測(cè)表型。如抗生素抗性、a-互補(bǔ)顯色反應(yīng)（藍(lán)白斑篩選）常用的質(zhì)粒載體大小一般在1kb至10kb之間，克隆載體如:pGEM-T、pUC-mT和pBluescript（簡(jiǎn)稱pBS）等，表達(dá)載體如:p1300質(zhì)粒等質(zhì)粒載體是在天然質(zhì)粒的基礎(chǔ)上為適應(yīng)實(shí)驗(yàn)室操作而進(jìn)行人工構(gòu)建的。常用的質(zhì)粒載體可以分為克隆載體和表達(dá)載體pBI121質(zhì)粒的提取1.5ml過夜菌4000rpm離心5min，棄液加100l預(yù)冷溶液I，震蕩混合，加少量溶菌酶，冰浴5min加200l新鮮溶液II，顛倒混勻，冰浴5min4℃

，12000rpm5min，轉(zhuǎn)移上清液加入等量酚/氯仿，混勻，如上離心3min加2倍體積乙醇，-20℃中2-3hr4℃

，12000rpm10min，70%乙醇洗沉淀加150l預(yù)冷溶液III，震蕩10秒，冰浴10min空氣干燥，50lTE溶解，-20℃貯存注意事項(xiàng)——材料準(zhǔn)備使用處于對(duì)數(shù)期的新鮮菌體（老化菌體導(dǎo)致開環(huán)質(zhì)粒增加）培養(yǎng)時(shí)應(yīng)加入篩選壓力，否則菌體易污染，質(zhì)粒易丟失盡量選擇高拷貝的質(zhì)粒，如為低拷貝或大質(zhì)粒，則應(yīng)加大菌體用量菌株不要頻繁轉(zhuǎn)接（質(zhì)粒丟失）注意事項(xiàng)——細(xì)胞裂解菌體量適當(dāng)。培養(yǎng)基去除干凈，同時(shí)保證菌體在懸浮液中充分懸浮。變性的時(shí)間不要過長(zhǎng)（5分鐘），否則質(zhì)粒易被打斷。復(fù)性時(shí)間也不宜過長(zhǎng)，否則會(huì)有基因組DNA的污染。G＋菌、酵母質(zhì)粒的提取，應(yīng)先用酶法或機(jī)械法處理，以破壁。注意事項(xiàng)——核酸分離、純化采用吸附材料吸附的方式分離DNA時(shí)，應(yīng)提供相應(yīng)的緩沖體系采用有機(jī)（酚/氯仿）抽提時(shí)應(yīng)充分混勻，但動(dòng)作要輕柔離心分離兩相時(shí)，應(yīng)保證一定的轉(zhuǎn)速和時(shí)間針對(duì)不同材料的特點(diǎn)，在提取過程中輔以相應(yīng)的去雜質(zhì)的方法注意事項(xiàng)——核酸沉淀、溶解當(dāng)沉淀時(shí)間有限時(shí)，用預(yù)冷的乙醇或異丙醇沉淀，沉淀會(huì)更充分沉淀時(shí)加入1/10體積的NaAc（pH5.2，3M），有利于充分沉淀沉淀后應(yīng)用70％的乙醇洗滌，以除去鹽離子等晾干DNA，讓乙醇充分揮發(fā)（不要過分干燥）若長(zhǎng)期儲(chǔ)存建議使用TE緩沖液溶解TE中的EDTA能螯和Mg2+或Mn2+離子，抑制DNasepH值為8.0，可防止DNA發(fā)生酸解菌體老化堿裂解不充分菌體中無質(zhì)粒溶液使用不當(dāng)請(qǐng)涂布平板培養(yǎng)后，重新挑選新菌落進(jìn)行液體培養(yǎng)可減少菌體用量或增加溶液的用量不要頻繁轉(zhuǎn)接，每次接種時(shí)應(yīng)接種單菌落。檢查抗生素使用濃度是否正確。溶液Ⅱ在溫度較低時(shí)可能出現(xiàn)渾濁，置于37℃保溫片刻直至溶解為清亮的溶液。質(zhì)粒DNA提取常見問題問題一：未提出質(zhì)粒或質(zhì)粒得率較低，如何解決？

原因?qū)Σ呋煊械鞍谆煊蠷NA混有基因組DNA不要使用過多菌體。重新純化DNA，去除蛋白、多糖、多酚等雜質(zhì)加入RNaseA室溫放置一段時(shí)間加入溶液II和III后防止劇烈振蕩，可能把基因組DNA剪切成碎片從而混雜在質(zhì)粒中。細(xì)菌培養(yǎng)時(shí)間過長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞和DNA的降解，培養(yǎng)時(shí)間不要超過16小時(shí)。質(zhì)粒DNA提取常見問題問題二：質(zhì)粒純度不高，如何解決？

原因?qū)Σ?/p>

動(dòng)物組織細(xì)胞中的核糖核酸(RNA)與脫氧核糖核酸(DNA)大部分與蛋白質(zhì)結(jié)合形成核蛋白?？捎萌却姿岢恋沓龊说鞍?，并用95%乙醇加熱除去附著在沉淀上的脂類雜質(zhì)。然后用10%氯化鈉從核蛋白中分離出核酸(鈉鹽形式)，此核酸鈉鹽，加入乙醇可以被沉淀析出。動(dòng)物組織中抽提DNA勻漿制備

稱取新鮮豬肝(或大白鼠肝臟)5克，加入等量冰冷的0.9%NaCl溶液（可先放少量，待研磨成勻漿后加入剩余部分），及時(shí)剪碎。放人研缽中加入少量石英砂，研磨成勻漿。研磨過程中，要隨時(shí)將研缽置于冰中冷卻。（勻漿制備一定要在低溫條件下制作，操作要迅速，以避免核酸分解。）分離提取

1．將勻漿5m1置于離心管內(nèi)，立即加入20%三氯醋酸5ml，用玻棒攪勻，靜3min后，以3000r/min離心l0min。

2．傾去上清液，沉淀中加入95%乙醇5m1，用玻棒攪勻。用一個(gè)裝有長(zhǎng)玻璃管的木塞塞緊離心管口，在沸水浴中加熱至沸，回餾2min。注意乙醇沸騰后將火關(guān)小，以免乙醇蒸氣燃燒。冷卻后2500r/min離心l0min。（脫脂）

3．傾去上層乙醇。將離心管倒置于濾紙上，使乙醇倒干。沉淀中加入10%氯化鈉溶液4ml，置沸水浴中加熱8min，并用玻棒攪拌。取出待冷卻以2500r/min離心l0min。4．將上層清液量取體積后傾人一小燒杯內(nèi)。若不清亮可重復(fù)離心一次。5．取等量在冰浴中冷卻的95%乙醇（在冰箱中），逐滴加入小燒杯內(nèi)。即可看見白色沉淀析出。靜置l0min后，轉(zhuǎn)人離心管3000/min，離心10min，即可得核酸的白色鈉鹽沉淀。RNA的提取方法由于RNA的種類來源很多，因而提取制備方法各異，一般有苯酚法，去污劑法和鹽酸胍法，其中苯酚法實(shí)驗(yàn)室最常用。組織勻漿后用苯酚處理離心，RNA即溶于上層被酚飽和的水相中，向水相加冷乙醇后，RNA即以白色絮狀沉淀析出。此法較好除去DNA和蛋白質(zhì)，且獲得生物活性的RNA。RNA提?。簞驖{：稱取3克牛肝剪碎，加20ml0.14mol/L氯化鈉溶液10000rn/min左右勻漿1分鐘左右;離心：勻漿后溶液離心8000rpm離心7分鐘，量取上清液毫升數(shù)，沉淀物留做提取DNA用;除雜質(zhì)：加等體積80％酚溶液于上清液中，攪拌充分混合10－20分鐘，置冰箱冷卻靜止30-40分鐘，離心取上層水相含有RNA，棄下層酚相含蛋白質(zhì)和DNA等雜質(zhì);沉淀RNA:取上層水相含RNA溶液，加入2倍體積95％冷乙醇，攪拌，充分混合，置冰箱中冷卻，至出現(xiàn)白色絮狀物－RNA，離心8000rpm離心7分鐘，取沉淀物;溶解：用少量去離子水（約4毫升）溶解沉淀物，用以測(cè)定其含量.

工業(yè)上常用稀堿和濃鹽酸法提RNA，用這兩種方法提取的核酸均為變性RNA。主要用于制備核苷酸的原料。

濃鹽法是用10％氯化鈉的溶液，在90攝氏度提取3—4小時(shí)，冷卻，離心，上清液乙醇沉淀RNA。

稀堿法用0.2％氫氧化鈉是酵母裂解，然后酸中和，除蛋白和菌體，上清液乙醇沉淀的RNA,或調(diào)核酸等電點(diǎn)PI2.5沉淀。目前實(shí)驗(yàn)室中比較流行的抽提總RNA的方法——Trizol法細(xì)胞內(nèi)大部份RNA均與蛋白質(zhì)結(jié)合在一起，并且多以核蛋白的形式存在。因此，分離制備RNA時(shí)，首先遇到的是必須使RNA與蛋白解離，并除去蛋白質(zhì)。Trizol可以促使核蛋白復(fù)合體解離,使RNA與蛋白質(zhì)分離,并將RNA釋放到溶液中。

分離的總RNA可利用mRNA3'末端含有多聚(A)+的特點(diǎn),當(dāng)RNA流經(jīng)oligo(dT)纖維素柱時(shí),在高鹽緩沖液作用下,mRNA被特異的吸附在oligo(dT)纖維素上,然后逐漸降低鹽濃度洗脫,在低鹽溶液或蒸餾水中,mRNA被洗下。經(jīng)過兩次oligo(dT)纖維素柱,可得到較純的mRNA。核酸的含量測(cè)定

定磷法

RNA和DNA中都含有磷酸，根據(jù)元素分析獲知RNA的平均含磷量為9.4%，DNA的平均含磷量為9.9%。因此，可從樣品中測(cè)得的含磷量來計(jì)算RNA或DNA的含量。用強(qiáng)酸(如10mol/L硫酸)將核酸樣品消化，使核酸分子中的有機(jī)磷轉(zhuǎn)變?yōu)闊o機(jī)磷，無機(jī)磷與鉬酸反應(yīng)生成磷鉬酸，磷鉬酸在還原劑(如抗壞血酸、α-1，2，4-氫基萘酚磺酸、氯化亞錫等)作用下還原成鉬藍(lán)?？捎帽壬y(cè)定RNA樣品中的含磷量。定糖法

RNA含有核糖，DNA含有脫氧核糖，根據(jù)這兩種糖的顏色反應(yīng)可對(duì)RNA和DNA進(jìn)行定量測(cè)定。

1.核糖的測(cè)定RNA分子中的核糖和濃鹽酸或濃硫酸作用脫水生成糠醛?？啡┡c某些酚類化合物縮合而生成有色化合物。如糠醛與地衣酚(3，5-二羥甲苯)反應(yīng)產(chǎn)生深綠色化合物，當(dāng)有高鐵離子存在時(shí)，則反應(yīng)更靈敏。反應(yīng)產(chǎn)物在660nm有最大吸收。并且與RNA的濃度成正比。

2.脫氧核糖的測(cè)定DNA分子中的脫氧核糖和濃硫酸作用，脫水生成ω-羥基-γ-酮基戊醛，與二苯胺反應(yīng)生成藍(lán)色化合物。反應(yīng)產(chǎn)物在595nm處有最大吸收，并且與DNA濃度成正比。

紫外吸收法利用核酸組分嘌呤環(huán)、嘧啶環(huán)具有紫外吸收的特性。用這種方法測(cè)定核酸含量時(shí)，通常規(guī)定在260nm，測(cè)得樣品DNA或RNA溶液的A260值，即可計(jì)算出樣品中核酸的含量。DNA測(cè)序技術(shù)DNA堿基序列測(cè)定Sanger法測(cè)序原理

在模板指導(dǎo)下，聚合酶不斷將dNTP加到引物的3’-OH末端，使引物延長(zhǎng)，合成出新的互補(bǔ)的DNA鏈，如果加入雙脫氧三磷酸核苷(ddNTP）,由于雙脫氧核糖的3’位置上缺少一個(gè)羥基，故不能同后續(xù)的dNTP形成磷酸二酯鍵，即形成一種全部具有相同5’-引物端和以ddNMP殘基為3’端結(jié)尾的一系列長(zhǎng)短不一片段的混合物。采用聚丙烯酰胺凝膠電泳區(qū)分長(zhǎng)度差一個(gè)核苷酸的單鏈DNA，從而讀取DNA的核苷酸序列。雙脫氧終止法測(cè)序反應(yīng)體系包括：DNA聚合酶單鏈DNA模板帶有3-OH末端的單鏈寡核苷酸引物Mg2+4種dNTP(aATP,dGTP,dCTP和dTTP)4種ddNTP(ddATP,ddGTP,ddCTP和ddTTP)Sanger法DNA測(cè)序的試劑①引物：通常由20-23個(gè)堿基構(gòu)成，G+C=12，A+T=8到11，Tm=60-68℃，避免形成引物二聚體或形成發(fā)卡樣結(jié)構(gòu)②模板③DNA聚合酶④2′，3′-雙脫氧核苷三磷酸（2′,3′-dideoxynucleosidetriphosphate,ddNTP

）⑤dNTP測(cè)序反應(yīng)的種類①引物標(biāo)記法(Dyeprimerreactions)②終止物標(biāo)記法(Dyeterminatorreactions)四色熒光染料(BigDye)標(biāo)記終止物將熒光素連在4種ddNTPddATP●ddTTP▲

ddCTP◆ddGTP★DNA測(cè)序基本步驟測(cè)序模板的純化與定量測(cè)序反應(yīng)--PCR儀測(cè)序反應(yīng)產(chǎn)物純化與變性上樣電泳--測(cè)序儀分析結(jié)果DNA測(cè)序模板純化DNA測(cè)序模板用量測(cè)序反應(yīng)測(cè)序產(chǎn)物純化電泳檢測(cè)--377電泳檢測(cè)--310電泳檢測(cè)--3100步驟１：毛細(xì)管灌膠步驟２：樣品盤移動(dòng)步驟３：電進(jìn)樣及電泳步驟４：熒光激發(fā)及檢測(cè)測(cè)序結(jié)果Maxam-Gilbert化學(xué)修飾法

一個(gè)末端標(biāo)記的DNA片段在4組互相獨(dú)立的化學(xué)反應(yīng)中分別得到部分降解，其中每一組反應(yīng)特異的針對(duì)某一種或某一類堿基。因此生成4種放射性標(biāo)記的分子，從共同起點(diǎn)（放射性標(biāo)記末端）延續(xù)到發(fā)生化學(xué)降解的位點(diǎn)。每組混合物中均含有長(zhǎng)短不一的DNA分子，其長(zhǎng)度取決于該組反應(yīng)所針對(duì)的堿基在原DNA全片段上位置。此后，各組均通過聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行分離，再通過放射自顯影來檢測(cè)末端標(biāo)記的分子。基本步驟

第一步，對(duì)特定堿基（或特定類型的堿基）進(jìn)行化學(xué)修飾；第二步，修飾堿基從糖環(huán)上脫落，修飾堿基5和3的磷酸二酯鍵斷裂；第三步，比較G、A+G、C+T、C和A>C各個(gè)泳道，可從測(cè)序凝膠的放射自顯影片上讀取DNA序列。DNA化學(xué)裂解反應(yīng)體系反應(yīng)體系修飾試劑修飾反應(yīng)鏈斷裂試劑斷裂點(diǎn)G硫酸二甲酯（DMS）G甲基