藥物分析課件第9章-維生素類藥物分析

基本要求一、掌握維生素類藥物的結(jié)構(gòu)特點與分析方法之間的關(guān)系。二、掌握維生素類藥物的鑒別原理與方法。三、掌握三點校正法測定維生素A的原理、測定方法與計算方法。四、掌握維生素D的HPLC含量測定法和維生素E的GC含量測定法。五、掌握維生素B1非水溶液滴定法與維生素C碘量法的測定原理、方法與注意事項。六、熟悉本類藥物其他的含量測定方法。七、熟悉本類藥物雜質(zhì)檢查方法。八、了解維生素A三點校正法的推導(dǎo)過程。返回第一頁，共127頁。概述維生素：是維持人體正常代謝機(jī)能所必需的微量營養(yǎng)物資。人體不能合成維生素。第二頁，共127頁。

VitA、D2、D3、E、K1

等脂溶性水溶性

VitB族(B1、B2、B6、B12)VitC、葉酸、煙酸、泛酸等。分類按溶解度分返回第三頁，共127頁。-H維生素A醇-COCH3維生素A醋酸酯-COC15H31維生素A棕櫚酸酯R:第一節(jié)維生素A第四頁，共127頁。為一個具有共軛多烯側(cè)鏈的環(huán)己烯（一）結(jié)構(gòu)與性質(zhì)一、具有UV吸收存在多種立體異構(gòu)化合物第五頁，共127頁。VitA2VitA3易發(fā)生脫氫、脫水、聚合反應(yīng)第六頁，共127頁。鯨醇第七頁，共127頁?！骰蛴薪饘匐x子存在時氧化↑共軛多烯側(cè)鏈易被氧化（二）第八頁，共127頁。環(huán)氧化物VitA醛VitA酸第九頁，共127頁。三氯化銻反應(yīng)（一）條件無水無醇CHCl3鑒別試驗二、第十頁，共127頁。藍(lán)色紫紅第十一頁，共127頁。（BP（2000））λmax為326nm一個吸收峰UV法（二）λmax為350～390nm三個吸收峰第十二頁，共127頁。去水VitA（VitA3）↓VitA第十三頁，共127頁。第十四頁，共127頁。USP顯色劑磷鉬酸規(guī)定斑點顏色和Rf值BP

雜質(zhì)對照品法顯色劑三氯化銻TLC法（三）第十五頁，共127頁。立體異構(gòu)體氧化降解產(chǎn)物合成中間體UV法（一）含量測定三、維生素A2維生素A3環(huán)氧化物維生素A醛維生素A酸第十六頁，共127頁。三點校正法（法定方法）1.原理：（1）雜質(zhì)的吸收在310~340nm波長范圍內(nèi)呈一條直線，且隨波長的增大吸收度減??；（2）物質(zhì)對光的吸收具有加和性。第十七頁，共127頁。2.波長的選擇：（1）1

VitA的max（328nm）（2）23

分別在1的兩側(cè)各選一點第十八頁，共127頁。測定對象VitA醋酸酯第一法等波長差法=12nm第十九頁，共127頁。第二法等吸收比法測定對象VitA醇1=325nm,2=310nm,3=334nm第二十頁，共127頁。測定法（1）基本步驟:第一步A的選擇選擇依據(jù)：所選A值中雜質(zhì)的干擾已基本消除第二十一頁，共127頁。注意：

C為混合樣品的濃度第二步求第二十二頁，共127頁。第三步求效價換算因數(shù)由純品計算而得：第二十三頁，共127頁。第二十四頁，共127頁。第二十五頁，共127頁。第四步：求標(biāo)示量％第二十六頁，共127頁。方法：（2）

第一法維生素A醋酸酯第二十七頁，共127頁。判斷是否在326～329nm之間在326～329nm之間改用第二法是否求算并與規(guī)定值比較第二十八頁，共127頁。

規(guī)定值差值第二十九頁，共127頁。

判斷差值是否超過規(guī)定值的有一個以上超過無超過

計算A328（校正）

用A328計算第三十頁，共127頁。第三十一頁，共127頁。03%－15%－3%第二法第二法第三十二頁，共127頁。討論VA醋酸酯的吸收度校正公式是用直線方程式法（即代數(shù)法）推導(dǎo)而來；VA醇的吸收度校正公式是用相似三角形法（幾何法或稱6/7定位法）推導(dǎo)而來。在應(yīng)用三點校正法時，除其中一點在最大吸收波長處測定外，其余兩點均在最大吸收峰的兩側(cè)進(jìn)行測定。在測定前務(wù)必要校正波長。測定的樣品應(yīng)不得少于兩份。第三十三頁，共127頁。

VitAD膠丸中VitA的含量測定

精密稱取本品(規(guī)格10000VitAIU/丸)裝量差異項下（平均裝量0.07985g/丸）的內(nèi)容物0.1287g至10ml燒杯中，加環(huán)己烷溶解并定量轉(zhuǎn)移至50ml量瓶中，用環(huán)己烷稀釋至刻度，搖勻；精密量取2.0ml，置另一50ml量瓶中，用環(huán)己烷稀釋至刻度，搖勻。以環(huán)己烷為空白，測定最大吸收波長為328nm，并在下列波長處測得吸收度為第三十四頁，共127頁。A300：0.374A316

：0.592A328：0.663A340：0.553A360：0.228A300/A328：0.564A316/A328：0.893A328/A328：1.000A340/A328：0.834A360/A328：0.344求本品中維生素A占標(biāo)示量的百分含量？第三十五頁，共127頁。A300/A328：0.564A316/A328：0.893A328/A328：1.000A340/A328：0.834A360/A328：0.3440.5550.9071.0000.8110.299

+0.01－0.010+0.02+0.04－－－－－=====A328(校正)=3.52(2A328-A316-A340)=3.52(2×0.663–0.592–0.553)=0.637第三十六頁，共127頁。A328(校正)–A328(實測)A328(實測)×100=0.637–0.6630.663×100=-3.92E1%1cm(328nm)=A328(校正)100ms/D=0.637100×0.1287/1250=61.87第三十七頁，共127頁。供試品中維生素A效價=E1%1cm(328nm)×1900=61.87×1900=117553（IU/g）標(biāo)示量%=VA效價(IU/g)×每丸內(nèi)容物平均裝量(g/丸)標(biāo)示量(IU/丸)×100%=117553×0.0798510000×100%=93.9%第三十八頁，共127頁。適用于維生素A醇（等吸收比法）第一法無法消除雜質(zhì)干擾時用此法[皂化法、6/7A法]（3）第二法第三十九頁，共127頁。水溶性脂溶性第四十頁，共127頁。判斷max是否在323～327nm之間取未皂化樣品采用色譜法純化后再測定計算是否第四十一頁，共127頁。判斷A300/A325是否大于0.73是否取未皂化樣品采用色譜法純化后再測定計算A325(校正)第四十二頁，共127頁。第四十三頁，共127頁。03%－3%第四十四頁，共127頁。三氯化銻比色法（二）優(yōu)點簡便快速λmax618nm～620nm標(biāo)準(zhǔn)曲線法缺點呈色不穩(wěn)定（5~10s內(nèi)）水分干擾與標(biāo)準(zhǔn)曲線溫差≤1℃專屬性差三氯化銻有腐蝕性（二）藍(lán)色+3SbClVitA返回第四十五頁，共127頁。第二節(jié)維生素D維生素D2一、結(jié)構(gòu)與性質(zhì)第四十六頁，共127頁。維生素D3第四十七頁，共127頁。開環(huán)的甾體：具有甾類化合物的顯色反應(yīng)，可用于鑒別。手性碳原子：具有旋光性，可用于鑒別。

多烯：可進(jìn)行紫外檢測。

第四十八頁，共127頁。二、鑒別試驗1.顯色反應(yīng)醋酐--硫酸反應(yīng)D2

黃紅紫綠

D3

黃紅紫、藍(lán)綠綠三氯化銻反應(yīng)橙紅色漸變粉紅三氯化鐵反應(yīng)橙黃色二氯丙醇和乙酰氯反應(yīng)綠色第四十九頁，共127頁。2.比旋度鑒別維生素D2維生素D3溶劑

濃度比旋度值無水乙醇無水乙醇40mg/ml5mg/ml+102.5°～+107.5°+105°～+112°注意事項：應(yīng)于容器開啟30分鐘內(nèi)取樣，在溶液配制后30分鐘內(nèi)測定。第五十頁，共127頁。

3.區(qū)別反應(yīng)：以96%乙醇為溶劑，加乙醇和85%硫酸，D2顯紅色，在570nm處有最大吸收，D3顯黃色，在495nm處有最大吸收。

4.其他方法：

TLC、HPLC、制備衍生物測熔點

第五十一頁，共127頁。三、雜質(zhì)檢查維生素D2中麥角甾醇的檢查：加洋地黃皂苷溶液，混合，放置18h不得發(fā)生渾濁或沉淀。前維生素D的光照產(chǎn)物第五十二頁，共127頁。四、含量測定方法中國藥典（2000年版）采用正相高效液相色譜法測定維生素D的含量，定量方法為內(nèi)標(biāo)法，內(nèi)標(biāo)物為鄰苯二甲酸二甲酯，該法分為三個方法。

固定相：硅膠

流動相：正己烷-正戊醇（997：3）第五十三頁，共127頁。第一法：用于無維生素A醇及其它雜質(zhì)的干擾的情況，步驟如下：

1．系統(tǒng)適用性試驗：測定重復(fù)性和分離度。

第五十四頁，共127頁。

2．測定校正因子：

AS/mS

f1=--------

Ar/mr

f2=（ASmr-f1mSAr1）/（Ar1mS）

3．含量測定：

mi=（f1Ai1+f2Ai2）mS/AS第五十五頁，共127頁。第二法：用于有雜質(zhì)的干擾的情況，步驟如下：

1．皂化處理：皂化、乙醚提取、洗滌提取液、蒸除乙醚、制備供試液A。

2．凈化：供試液A經(jīng)液相色譜分離，準(zhǔn)確收集含有維生素D及前維生素D混合物的全部流出液，制備成供試液B。

固定相：ODS

流動相：甲醇-乙腈-水（50：50：2）

3．含量測定：取供試液B按第一法測定。

第五十六頁，共127頁。第三法：用于經(jīng)第二法處理后仍有雜質(zhì)的干擾的情況。步驟如下：1．制備供試液：取供試液A，凈化，水浴加熱，得供試液C。

制備對照液：對照品儲備液：稀釋、加熱。

2．含量測定：在第一法的色譜條件下，交替精密進(jìn)樣對照液和供試液，按外標(biāo)法定量。返回第五十七頁，共127頁。苯并－二氫吡喃醇第三節(jié)維生素E

第五十八頁，共127頁。名稱R1R2相對活性α-生育酚β-生育酚γ-生育酚δ-生育酚CH3CH3HHCH3HCH3H1.00.50.20.1***第五十九頁，共127頁。dl－α－生育酚醋酸酯第六十頁，共127頁。結(jié)構(gòu)與性質(zhì)一、苯環(huán)+二氫吡喃環(huán)+飽和烴鏈1、UV2、乙?；姆恿u基易水解]O[醌型化合物△生育酚-+orOHHVitE雜質(zhì)，需檢查第六十一頁，共127頁。]O[生育紅（一）硝酸反應(yīng)橙紅色鑒別二、75℃15′HNO3VitE生育酚第六十二頁，共127頁。（橙紅色）生育紅生育酚HNO3強(qiáng)氧化劑第六十三頁，共127頁。三氯化鐵－聯(lián)吡啶反應(yīng)（二）第六十四頁，共127頁。生育酚對-生育醌[O]弱氧化劑第六十五頁，共127頁。血紅色第六十六頁，共127頁。

=41.0～45.5λmax=284nmλmin=254nm0.01%無水乙醇中UV法（三）第六十七頁，共127頁。薄層板硅膠G展開劑環(huán)己烷-乙醚（4：1）顯色劑硫酸（105℃5′）VitERf

=0.7-生育酚Rf

=0.5-生育醌Rf

=0.9TLC法（四）第六十八頁，共127頁。2.游離生育酚

雜質(zhì)檢查

三、原理酸度

以NaOH滴定液（0.1mol/L）體積控制。第六十九頁，共127頁。（M生育酚=430.8）例

取本品0.10g，加無水乙醇5ml溶解后，加二苯胺試液1滴，用硫酸鈰液（0.01mol/L）滴定，消耗硫酸鈰液（0.01mol/L）不得過1.0ml。第七十頁，共127頁?！?.15％限量第七十一頁，共127頁。四、含量測定GC法（法定方法）（一）GC特點1、選擇性好靈敏度高速度快分離效能好揮發(fā)性低、不穩(wěn)定、極性強(qiáng)→衍生化易受樣品蒸氣壓限制第七十二頁，共127頁。載氣→N2固定液→硅酮（OV-17）擔(dān)體→硅藻土或高分子多孔小球柱溫→265℃檢測器→氫火焰離子化檢測器(FID)內(nèi)標(biāo)→正三十二烷

n≥500R≥2VitE測定的色譜條件2、內(nèi)標(biāo)法加校正因子第七十三頁，共127頁。內(nèi)標(biāo)法供試液（樣品+內(nèi)標(biāo)）內(nèi)標(biāo)物對照液（對照+內(nèi)標(biāo)）是樣品中不存在的物質(zhì)與被測組分峰靠近能與各組分完全分離與被測組分的量接近第七十四頁，共127頁。校正因子：第七十五頁，共127頁。WWKK%VitE%10012=稀釋倍數(shù)稀釋倍數(shù)樣對實際工作中的計算方法××××第七十六頁，共127頁。（二）HPLC法外標(biāo)法此外，還有鈰量法、比色法和熒光法返回第七十七頁，共127頁。氨基嘧啶環(huán)－CH2－噻唑環(huán)(季銨堿)第四節(jié)維生素B1HClCl-第七十八頁，共127頁。（一）溶解性1、易溶于水2、水溶液呈酸性（二）UV共軛雙鍵λmax=246nm結(jié)構(gòu)與性質(zhì)一、第七十九頁，共127頁。與生物堿↓→↓（三）硫色素反應(yīng)（四）嘧啶環(huán)——噻唑環(huán)——（五）鹽酸根呈氯化物的反應(yīng)，用于鑒別。第八十頁，共127頁。ChP鑒別試驗二、（一）硫色素反應(yīng)第八十一頁，共127頁。第八十二頁，共127頁。硫色素＋2H第八十三頁，共127頁。VitB1H+H+H+H+（二）沉淀反應(yīng)第八十四頁，共127頁。S元素反應(yīng)Cl-反應(yīng)（三）其他反應(yīng)()21PbSNaSVitBNO3PbNaOH第八十五頁，共127頁。三、含量測定喹那啶紅－亞甲藍(lán)（紫紅→天藍(lán)）（一）非水溶液滴定法第八十六頁，共127頁。反應(yīng)摩爾比為1：2第八十七頁，共127頁。UV法（二）第八十八頁，共127頁。片劑、注射劑=421（每片）相當(dāng)于標(biāo)示量的%=A=ECL規(guī)格g/片g/100mlgChPWEA%cmD10011××%100標(biāo)示量平均片重××第八十九頁，共127頁。（每ml）相當(dāng)于標(biāo)示量的%=規(guī)格g/mlml%VEA%cm100110011×標(biāo)示量稀釋倍數(shù)××第九十頁，共127頁。（三）硫色素?zé)晒夥ㄔ?、熒光硫色素異丁醇鐵氰化鉀1VitBNaOH第九十一頁，共127頁。特點2、（1）靈敏度高，線性范圍寬（2）代謝產(chǎn)物不干擾，適用于體液分析第九十二頁，共127頁。第五節(jié)維生素CL－抗壞血酸第九十三頁，共127頁。1、易溶于水2、水溶液呈酸性結(jié)構(gòu)與性質(zhì)一、（一）溶解性第九十四頁，共127頁。二烯醇結(jié)構(gòu)二酮基結(jié)構(gòu)二烯醇結(jié)構(gòu)（二）還原性第九十五頁，共127頁。有活性有活性無活性第九十六頁，共127頁。△糖類的顯色反應(yīng)50℃結(jié)構(gòu)與糖類相似（三）具糖的性質(zhì)第九十七頁，共127頁。C3－OH的pKa=4.17C2－OH的pKa=11.57酸性（四）一元酸第九十八頁，共127頁。L(+)－抗壞血酸活性最強(qiáng)手性C（C4、C5）（五）光學(xué)活性**第九十九頁，共127頁。與堿反應(yīng)（六）水解性第一百頁，共127頁。第一百零一頁，共127頁。與氧化劑的反應(yīng)（一）鑒別試驗二、去氫抗壞血酸]O[VitC第一百零二頁，共127頁。1、與AgNO3反應(yīng)2、與2，6-二氯靛酚反應(yīng)(ChP2000)氧化型玫瑰紅色還原型藍(lán)色(ChP2000)第一百零三頁，共127頁。（玫瑰色）（無色）第一百零四頁，共127頁。3.其他氧化劑的反應(yīng)：亞甲藍(lán)或高錳酸鉀試劑褪色

堿性酒石酸銅磚紅色沉淀

磷鉬酸鉬藍(lán)

第一百零五頁，共127頁。糖類的反應(yīng)（二）或鹽酸50℃吡咯USP第一百零六頁，共127頁。第一百零七頁，共127頁。（藍(lán)色）(糠醛)（戊糖）50℃(吡咯)第一百零八頁，共127頁。UV（三）BP0.01mol/LHCl第一百零九頁，共127頁。三、雜質(zhì)檢查

1.溶液的澄清度與顏色：有色雜質(zhì)分光光度法

2.鐵、銅離子：原子吸收分光光度法第一百一十頁，共127頁。指示劑淀粉指示液原理1、碘量法（一）含量測定四、第一百一十一頁，共127頁。H+第一百一十二頁，共127頁。取本品約0.2g，精密稱定，加新沸過的冷水100ml與稀醋酸10ml使溶解，加淀粉指示液1ml，立即用碘滴定液（0.1mol/L）滴定，至溶液顯藍(lán)色，在30秒內(nèi)不褪。每1ml碘滴定液(0.1mol/L)相當(dāng)于8.806mg的C6H8O6。方法2、第一百一十三頁，共127頁。（1）酸性環(huán)境d.HCl（2）新沸冷H2O減慢VitC被O2氧化速度討論3、（3）立即滴定趕走水中O2減少O2的干擾第一百一十四頁，共127頁。（4）附加劑干擾的排除片劑——滑石粉——過濾注射劑——抗氧劑——丙酮甲醛Na2SO3NaHSO3

Na2S2O3Na2S2O5第一百一十五頁，共127頁。CHHOOaS3aSO+H2NHON2252HONHCOS3a第一百一十六頁，共127頁。2，6-二氯靛酚鈉滴定法法（二）USPJP原理1、酚亞胺二氯靛酚，-62VitC第一百一十七頁，共127頁。自身指示終點法方法2、第一百一十八頁，共127頁。（2）快速滴定2min內(nèi)（1）酸性環(huán)境HPO3-HAc穩(wěn)定VitC防止其他還原性物質(zhì)干擾（3）剩余比色測定（定量過量）（測剩余染料）討論3、第一百一十九頁，共127頁。（4）缺點

需經(jīng)常標(biāo)定貯存≤一周不穩(wěn)定干擾多氧化力較強(qiáng)第一百二十頁，共127頁。

公元前3500年-古埃及人發(fā)現(xiàn)能防治夜盲癥的物質(zhì)，也就是后來的維A。

1600年-醫(yī)生鼓勵以多吃動物肝臟來治夜盲癥。

1747年-蘇格蘭醫(yī)生林德發(fā)現(xiàn)檸檬能治壞血病，也就是后來的維C。

1831年-胡蘿卜素被發(fā)現(xiàn)。

1905年-甲狀腺腫大被碘治愈。

1911年-波蘭化學(xué)家豐克為維生素命名。

1915年-科學(xué)家認(rèn)為糙皮病是由于缺乏某種維生素而造成的