微生物的培養(yǎng)技術(shù)及應(yīng)用第4課時(shí)課件 【知識(shí)精講精研+能力拓展提升】 高二下學(xué)期生物人教版選擇性必修3

第1章

發(fā)酵工程第2節(jié)

微生物的培養(yǎng)技術(shù)及應(yīng)用第4課時(shí)

微生物的數(shù)量測(cè)定（1）原理：當(dāng)樣品的稀釋度足夠高時(shí)，培養(yǎng)基表面生長(zhǎng)的一個(gè)菌落，來(lái)源于樣品稀釋液中的一個(gè)活菌。通過計(jì)數(shù)平板上的菌落數(shù)，就能推測(cè)出樣品中大約含有多少活菌。1、間接計(jì)數(shù)法——稀釋涂布平板法選擇30-300個(gè)菌落的平板進(jìn)行計(jì)數(shù)；每個(gè)稀釋度至少取3個(gè)平板取其平均值；統(tǒng)計(jì)的菌落往往比活菌的實(shí)際數(shù)目低；統(tǒng)計(jì)的結(jié)果一般用菌落數(shù)而不是活菌數(shù)來(lái)表示；恰當(dāng)?shù)南♂尪取⑼坎际欠窬鶆蚴浅晒y(tǒng)計(jì)菌落數(shù)目的關(guān)鍵。（2）計(jì)數(shù)原則：

當(dāng)兩個(gè)或多個(gè)細(xì)胞連在一起時(shí)，平板上觀察到的只是一個(gè)菌落。一、微生物數(shù)量測(cè)定的基本方法（3）計(jì)算公式:每g樣品中的菌落數(shù)＝（C÷V）×MM代表稀釋倍數(shù)C代表某一稀釋度下平板上生長(zhǎng)的平均菌落數(shù)V代表涂布平板時(shí)所用的稀釋液的體積(mL)例1：某同學(xué)在稀釋倍數(shù)為106

的培養(yǎng)基中測(cè)得平板上菌落數(shù)的平均數(shù)為234，那么每g樣品中的菌落數(shù)是（涂布平板時(shí)所用稀釋液的體積為0.1mL)()A.2.34×108B.2.34×109C.234D.23.4（234÷0.1）×106=2.34×109答B(yǎng)一、微生物數(shù)量測(cè)定的基本方法（3）計(jì)算公式:每g樣品中的菌落數(shù)＝（C÷V）×MM代表稀釋倍數(shù)C代表某一稀釋度下平板上生長(zhǎng)的平均菌落數(shù)V代表涂布平板時(shí)所用的稀釋液的體積(mL)例2：甲同學(xué)做此實(shí)驗(yàn)在稀釋倍數(shù)105獲得3個(gè)平板，菌落數(shù)分別是80、90、100，涂布平板時(shí)均使用0.1ml菌液，試計(jì)算每克土壤中可以分離尿素的細(xì)菌數(shù)目？（80+90+100）/30.1×105=9×107個(gè)一、微生物數(shù)量測(cè)定的基本方法實(shí)例分析：

某兩位同學(xué)用稀釋涂布平板法測(cè)定同一土壤樣品中的細(xì)菌數(shù)。從對(duì)應(yīng)稀釋倍數(shù)為106的培養(yǎng)基中，得到以下兩種統(tǒng)計(jì)結(jié)果：甲同學(xué)在該濃度下涂布了一個(gè)平板，統(tǒng)計(jì)的菌落數(shù)為230；乙同學(xué)在該濃度下涂布了A、B、C三個(gè)平板，統(tǒng)計(jì)的菌落數(shù)分別為21、212、256，該同學(xué)以這三個(gè)平板上菌落數(shù)的平均值163作為統(tǒng)計(jì)結(jié)果。請(qǐng)?jiān)u價(jià)這兩位同學(xué)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果的有效性：1.甲同學(xué)____________________________________；原因是____________________________________。2.乙同學(xué)____________________________________；原因是____________________________________。實(shí)驗(yàn)操作不合理未設(shè)置重復(fù)實(shí)驗(yàn)組結(jié)果計(jì)算不合理21與另外兩組數(shù)值相差太大，應(yīng)舍去一、微生物數(shù)量測(cè)定的基本方法2、直接計(jì)數(shù)——計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)法（1）原理：利用細(xì)菌計(jì)數(shù)板或血細(xì)胞計(jì)數(shù)板，在顯微鏡下計(jì)算一定容積里樣品中微生物的數(shù)量。一、微生物數(shù)量測(cè)定的基本方法每毫升原液所含細(xì)菌數(shù)＝每小格平均細(xì)菌數(shù)×400×10000×稀釋倍數(shù)（2）缺點(diǎn)：①不能區(qū)分死菌與活菌；②個(gè)體小的細(xì)菌在顯微鏡下難以觀察；③不適于對(duì)運(yùn)動(dòng)細(xì)菌的計(jì)數(shù)。微生物的計(jì)數(shù)方法比較內(nèi)容直接計(jì)數(shù)法間接計(jì)數(shù)法主要用具顯微鏡、細(xì)菌計(jì)數(shù)板或血細(xì)胞計(jì)數(shù)板涂布器計(jì)數(shù)依據(jù)細(xì)菌個(gè)數(shù)培養(yǎng)基上菌落數(shù)優(yōu)點(diǎn)計(jì)數(shù)方便、操作簡(jiǎn)單計(jì)數(shù)的是活菌計(jì)算公式每毫升原液含菌株數(shù)＝每小格平均菌株數(shù)×400×10000×稀釋倍數(shù)每克樣品中的菌株數(shù):(C÷V)×MC：某稀釋度下平板上生長(zhǎng)的平均菌落數(shù)；V：涂布平板時(shí)所用的稀釋液的體積(mL)；M：稀釋倍數(shù)缺點(diǎn)不能區(qū)分死菌與活菌當(dāng)兩個(gè)或多個(gè)菌體連在一起時(shí),平板上觀察到的只是一個(gè)菌落結(jié)果比實(shí)際值偏大比實(shí)際值偏小一、微生物數(shù)量測(cè)定的基本方法1、實(shí)驗(yàn)?zāi)康模海?）從土壤中分離出能夠分解尿素的細(xì)菌（2）統(tǒng)計(jì)每克土壤樣品中究竟含有多少這樣的細(xì)菌2、實(shí)驗(yàn)原理：絕大多數(shù)微生物都能利用葡萄糖，但是只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素。利用以尿素作唯一氮源的選擇培養(yǎng)基，可以從土壤中分離出分解尿素的細(xì)菌。3、操作步驟：制備培養(yǎng)基土壤取樣樣品稀釋與取樣涂布微生物的培養(yǎng)與觀察二、土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離與計(jì)數(shù)葡萄糖10.0g尿素1.0gKH2PO41.4gNa2HPO42.1gMgSO4·7H2O0.2g瓊脂15.0g蒸餾水1000ml制備選擇培養(yǎng)基（尿素為唯一氮源）制備牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基對(duì)照作用思考：為什么還要制備牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基？①提供無(wú)機(jī)鹽；②調(diào)節(jié)pH。（1）制備培養(yǎng)基二、土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離與計(jì)數(shù)細(xì)菌宜在酸堿度接近中性的潮濕土壤中生長(zhǎng)，絕大部分分布在距地表3~8cm的土壤層。鏟去表層土3cm左右，取樣，將樣品裝入事先準(zhǔn)備好的信封中。（2）土壤取樣取土樣時(shí)用的鐵鏟和取樣袋在使用前都需要滅菌。操作完成后，一定要洗手。注意二、土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離與計(jì)數(shù)（3）樣品的稀釋

將10g土樣加入盛有90mL無(wú)菌水的錐形瓶中，充分搖勻。取1mL上清液加入盛有9mL無(wú)菌水的試管中，依次等比稀釋。1×101mL1mL1mL1mL1mL1mL1×1021×1031×1041×1051×1061×1079mL無(wú)菌水90mL無(wú)菌水10g在火焰旁將10g土樣加入盛有90mL無(wú)菌水的錐形瓶中，充分搖勻，制成菌液。二、土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離與計(jì)數(shù)測(cè)定土壤中的細(xì)菌數(shù)量時(shí)，一般選用1×104、1×105、1×106、倍稀釋的稀釋液進(jìn)行平板培養(yǎng)。微量移液器取0.1mL菌液，滴加到培養(yǎng)基表面。將涂布器浸在盛有酒精的燒杯中。將涂布器放在火焰上灼燒，待酒精燃盡、涂布器冷卻8~10s后，再進(jìn)行涂布。用涂布器將菌液均勻地涂布在培養(yǎng)基表面。涂布時(shí)可轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)皿，使涂布均勻。待涂布的菌液被培養(yǎng)基吸收后，將平板倒置，放入恒溫箱培養(yǎng)。3、涂布平板①滴加菌液②涂布器消毒③涂布器滅菌④涂布平板各梯度分別涂布3個(gè)平板，1個(gè)不涂布作空白對(duì)照①不同種類的微生物，往往需要不同的培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)時(shí)間。細(xì)菌一般在30-37℃的溫度下培養(yǎng)1-2d。②每隔24h統(tǒng)計(jì)一次菌落數(shù)目，選取菌落數(shù)目穩(wěn)定時(shí)的記錄作為結(jié)果，防止因培養(yǎng)時(shí)間不足而導(dǎo)致遺漏菌落的數(shù)目。③一般來(lái)說，在相同的培養(yǎng)條件下，同種微生物表現(xiàn)出穩(wěn)定的菌落特征。（4）微生物的培養(yǎng)與觀察得到的菌落一定是分解尿素的細(xì)菌嗎？不一定，還需要進(jìn)一步的鑒定因?yàn)橛行┪⑸锟梢岳闷渌⑸锏拇x產(chǎn)物進(jìn)行生長(zhǎng)繁殖。二、土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離與計(jì)數(shù)（5）結(jié)果評(píng)價(jià)①培養(yǎng)基的制作是否合格未接種培養(yǎng)基在恒溫箱中保溫1～2d后無(wú)菌落生長(zhǎng)，說明培養(yǎng)基制備合格，否則需要重新制備。②接種操作是否符合無(wú)菌操作如果培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌落顏色、形狀、大小基本一致，符合菌落特點(diǎn)，說明操作是符合無(wú)菌操作；如果出現(xiàn)其他菌落，說明未達(dá)要求。二、土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離與計(jì)數(shù)在以尿素為唯一氮源的培養(yǎng)基中加入酚紅指示劑。培養(yǎng)某種細(xì)菌后，如果PH升高，指示劑將變紅，說明該細(xì)菌能夠分解尿素。CO（NH2）2+H2O CO2+2NH3

脲酶原理：脲酶催化尿素分解成氨→培養(yǎng)基堿性增強(qiáng)→酚紅變紅→脲酶陽(yáng)性①液體培養(yǎng)基可以直接看液體的變色情況；②固體培養(yǎng)基上可以觀察菌落周圍是否出現(xiàn)紅色環(huán)帶，紅色環(huán)帶直徑與菌落直徑比值越大，說明分解能力越強(qiáng)。（6）微生物的鑒定土壤中分解尿素的細(xì)菌的鑒定二、土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離與計(jì)數(shù)①10g土樣加入盛有90mL無(wú)菌水中后，已稀釋10倍，再計(jì)算時(shí)，不要忽略；②由于使用的是選擇培養(yǎng)基，所以一般情況下，獲得的單菌落即目的菌，但因?yàn)橛行┪⑸锟梢岳媚康木拇x產(chǎn)物來(lái)生長(zhǎng)繁殖，所以還需要進(jìn)一步驗(yàn)證；③過程中所有操作都應(yīng)在酒精燈火焰旁進(jìn)行；④將涂布器從酒精中取出時(shí)，要讓多余的酒精在燒杯中滴盡，然后再放在火焰上灼燒；不要將過熱的涂布器放在盛有酒精的燒杯中，以免引燃酒精。（7）注意事項(xiàng)二、土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離與計(jì)數(shù)微生物的選擇培養(yǎng)和計(jì)數(shù)科學(xué)實(shí)例篩選原則選擇培養(yǎng)基的概念及舉例選擇培養(yǎng)基的作用微生物選擇培養(yǎng)獲取純培養(yǎng)物的方法-稀釋涂布平板法稀釋涂布平板法的操作過程間接計(jì)數(shù)法—稀釋涂布平板法直接計(jì)數(shù)—計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)法微生物的數(shù)量測(cè)定選擇培養(yǎng)基微生物的選擇培養(yǎng)土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離與計(jì)數(shù)培養(yǎng)基的制備（1）土壤取樣（2）樣品的稀釋（3）稀釋涂布平板法接種（4）微生物的培養(yǎng)與觀察實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)課堂小結(jié)1、關(guān)于土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離與計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn)的敘述，正確的是()A.培養(yǎng)基應(yīng)以尿素為唯一氮源，該細(xì)菌與硝化細(xì)菌所利用的碳源是相同的B.對(duì)微生物進(jìn)行分離、純化用平板劃線法，而稀釋涂布平板法只能用于計(jì)數(shù)C.對(duì)10mL土樣稀釋106倍后，取0.1mL該溶液進(jìn)行重復(fù)的涂布實(shí)驗(yàn)，測(cè)得的菌落數(shù)分別為18、234、276，則該10mL土樣中分解尿素的細(xì)菌數(shù)為2.55×108個(gè)D.應(yīng)該設(shè)置對(duì)照以排除非測(cè)試因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的干擾，提高可信度D[解析]從土壤中分離分解尿素的細(xì)菌時(shí),培養(yǎng)基應(yīng)以尿素為唯一氮源,尿素分解菌為異養(yǎng)型生物,利用的是有機(jī)碳源,硝化細(xì)菌是自養(yǎng)型生物,以二氧化碳為碳源,二氧化碳為無(wú)機(jī)物,A錯(cuò)誤;平板劃線法只能用來(lái)分離、純化微生物,不能用于計(jì)數(shù),稀釋涂布平板法既能計(jì)數(shù)活菌數(shù)目,又能用于分離純化,B錯(cuò)誤;[(234+276)÷2]÷0.1×106×10=2.55×1010(個(gè)),C錯(cuò)誤;課堂練習(xí)2、某興趣小組在校園土壤中取樣，進(jìn)行“土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離和計(jì)數(shù)”實(shí)驗(yàn)。小明從稀釋倍數(shù)為106的培養(yǎng)基中篩選出約120個(gè)菌落，而其他同學(xué)只篩選出約40個(gè)菌落。下列有關(guān)敘述錯(cuò)誤的是()A.小明出現(xiàn)這種結(jié)果的可能原因是和其他同學(xué)取樣的土壤不同

B.要證明培養(yǎng)基是否受到污染，可將小明配制的培養(yǎng)基不加土樣進(jìn)行培養(yǎng)C.當(dāng)稀釋倍數(shù)太小時(shí)，可能由于菌落重疊而導(dǎo)致計(jì)數(shù)結(jié)果偏小D.在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中加入酚紅指示劑可初步鑒定尿素分解菌D[解析]在以尿素為唯一氮源的培養(yǎng)基中加入酚紅指示劑,可初步鑒定尿素分解菌,D錯(cuò)誤。課堂練習(xí)3、下圖是研究人員從紅棕壤中篩選能高效分解尿素細(xì)菌過程示意圖，有關(guān)敘述錯(cuò)誤的是()C課堂練習(xí)A．在配制步驟②③的培養(yǎng)基時(shí)，應(yīng)先調(diào)pH值后進(jìn)行高壓蒸汽滅菌B．步驟③純化能分解尿素的細(xì)菌的原理是將聚集的細(xì)菌分散，可以獲得單細(xì)胞菌落C．步驟③采用涂布平板法接種，并需向牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中加入尿素D．步驟④挑?、壑胁煌N的菌落分別接種，比較細(xì)菌分解尿素的能力1、通過實(shí)驗(yàn)測(cè)定土壤中的細(xì)菌數(shù)量，下列與此操作有關(guān)的敘述中，不正確的是()A．用蒸餾水配制牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，經(jīng)高溫、高壓滅菌后倒平板B．取1×104、1×105倍的土壤稀釋液0.1mL，分別涂布于各組平板上C．選擇菌落數(shù)在300個(gè)以上的培養(yǎng)皿進(jìn)行計(jì)數(shù)D．將培養(yǎng)皿倒置，37℃恒溫培養(yǎng)24～48小時(shí)2、下列有關(guān)土壤中能分解尿素的細(xì)菌的分離和計(jì)數(shù)的實(shí)驗(yàn)操作，錯(cuò)誤的是()A．取土壤用的小鐵鏟和盛土樣的信封在使用前都需要滅菌B．測(cè)定土壤中細(xì)菌的數(shù)量一般選用1×102、1×103、1×104倍的稀釋液進(jìn)行平板培養(yǎng)C．鑒定能分解尿素的細(xì)菌，利用了尿素分解成氨，從而使pH升高的原理D．用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基作對(duì)照，來(lái)驗(yàn)證選擇培養(yǎng)基是否有選擇性BC作業(yè)3、用稀釋涂布平板法來(lái)統(tǒng)計(jì)樣品中的活