畢赤酵母表達系統(tǒng)簡介

本文格式為Word版，下載可任意編輯——畢赤酵母表達系統(tǒng)簡介巴斯德畢赤酵母及啟動子

1.1畢赤酵母表達系統(tǒng)簡介

隨著蛋白異源表達的飛速發(fā)展，越來越多的表達系統(tǒng)被建立并得到應(yīng)用。酵母作為單細胞真核生物，因具有比較完備的基因表達調(diào)控機制和對表達產(chǎn)物的加工修飾能力，仍表現(xiàn)出不可比較的優(yōu)勢。以甲醇營養(yǎng)型酵母（Methylotrophicyeast）-畢赤酵母為代表的其次代酵母表達系統(tǒng)，是近年來被公認的最有效的外源蛋白表達系統(tǒng)之一，已有多種外源蛋白在該宿主系統(tǒng)中獲得了成功表達[1]。作為生產(chǎn)外源蛋白的重要宿主菌，依靠其各種不同功能的表達載體，已經(jīng)得到廣泛的應(yīng)用。表達的蛋白質(zhì)包括酶、膜蛋白、抗原、抗體和調(diào)理蛋白等[2,3]。

畢赤酵母（Pichiapastoris）表達系統(tǒng)是近年來發(fā)展迅速、應(yīng)用廣泛的一種真表達系統(tǒng)。它是甲醇營養(yǎng)型酵母菌，有兩個乙醇氧化酶（alcoholoxidase，Aox）碼基因AOX1和AOX2，兩者序列相像，AOX1基因嚴格受甲醇誘導和調(diào)控。當甲醇為唯一碳源時，AOX1啟動子可被甲醇誘導，啟動乙醇氧化酶的表達，從而用甲醇進行代謝[4]。含AOX1啟動子的質(zhì)?？捎脕泶龠M編碼外源蛋白的目的因的表達。

隨著Invitrogen公司開發(fā)的一系列畢赤酵母表達試劑盒的應(yīng)用，目前用該統(tǒng)已成功表達出了數(shù)以千計的來自細菌、真菌、原生動物、植物、無脊椎動物、包括人在內(nèi)的脊椎動物以及病毒等的具有生物學功能的外源蛋白或蛋白結(jié)構(gòu)[5,6]。1.1.1P.Pastoris表達載體及其元件

由于畢赤酵母沒有穩(wěn)定的附加質(zhì)粒，表達載體需與宿主染色體發(fā)生同源重組，外源基因表達框架整合于染色體中以實現(xiàn)外源基因的表達整合表達的優(yōu)點在于保持外源基因穩(wěn)定性并可產(chǎn)生多拷貝基因。典型的畢赤氏酵母表達載體含有醇氧化酶基因的調(diào)控序列，主要的結(jié)構(gòu)包括：5′AOX1啟動子片段、多克隆位點(MCS)、轉(zhuǎn)錄終止和polyA形成基因序列(TT)、篩選標記(His4或Zeocin)、3′AOX1基因片段，作為一個能在大腸桿菌中繁殖擴增的穿梭質(zhì)粒，它還有部分pBR322質(zhì)粒或COLE1序列。假使是分泌型表達載體，在多克隆位點的前面，外源基因的5′端和啟動子的3′端之間插人了分泌作用的信號肽序列。在這個分泌信號的引導下，外源蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體中經(jīng)修飾和加工后能夠由胞內(nèi)轉(zhuǎn)移至胞外，將成熟的蛋白質(zhì)分泌到細胞外。目前所采用的表達體均為穿梭質(zhì)粒，先在大腸桿菌保存、復制、擴增，然后線性化后被導入宿主母細胞。

常用的表達載體包括胞內(nèi)表達載體及分泌表達載體如下表：

表1常用表達載體及其選擇標記

表達方式

載體名稱pPICZA,B,C

胞內(nèi)表達

pPIC6A,B,CPGAPZA,B,C

啟動子AOX1AOX1GAP

選擇標記ZeocinblasticidinZeocin

pPIC3.5KPAO815PFLDpPICZαA,B,CpPIC6αA,B,C

分泌表達

PGAPZαA,B,CpPIC9kpFLDα

AOX1AOX1FLDAOX1AOX1GAPAOX1FLD

His4kanmycinampicillinHis4ampicillinZeocinampicillinZeocinblasticidinZeocin

His4kanmycinampicillinZeocinampicillin

1.1.2畢赤酵母表達系統(tǒng)的優(yōu)勢

自從1987年Cregg等首次用巴斯德畢赤酵母（Pichiapastoris）作為宿主表達外源蛋白以來,作為一種新的高效的表達系統(tǒng)，畢赤酵母越來越引起人們的重視，到1995年，已有四十多種外源蛋白在該宿主菌中獲得表達。而最近幾年每年報道的在畢赤酵母中表達的外源基因就有幾十種，且一年比一年多，它除了具有原核生物易于培養(yǎng)、繁殖快、便于基因工程操作和高密度發(fā)酵等特性之外，同釀酒酵母等傳統(tǒng)真核表達系統(tǒng)相比，它還具有以下的優(yōu)勢:

（1）含有特有的強有力的AOX（醇氧化酶基因）啟動子，用甲醇可嚴格地調(diào)控外源基因的表達；

（2）培養(yǎng)成本低，產(chǎn)物易分開。畢赤酵母所用發(fā)酵培養(yǎng)基十分廉價，一般碳源為甘油或葡萄糖及甲醇，其余為無機鹽，培養(yǎng)基中不含蛋白，有利于下游產(chǎn)品分開純化；而釀酒酵母所用誘導物一般為價格較高的半乳糖；

（3）外源蛋白基因遺傳穩(wěn)定。外源基因能以高拷貝數(shù)整合到畢赤酵母基因組中，不易丟失并能夠到高表達菌株；

（4）作為真核表達系統(tǒng)，畢赤酵母具有真核生物的亞細胞結(jié)構(gòu)，具有糖基化、脂肪?；⒌鞍琢姿峄确g后修飾加工功能。

1.2AOX啟動子序列分析現(xiàn)狀

啟動子是基因表達調(diào)控的順式元件，也是基因工程表達載體的一個重要元件。啟動子在轉(zhuǎn)錄水平上的重要作用，不僅決定了基因的表達水平，也決定了基因表達的時空順序[7,8]，可以說啟動子活性的高低在很大程度上影響著基因表達最終產(chǎn)物的表達水平。所以找到一個轉(zhuǎn)錄啟動功能較好的啟動子，對于外源蛋白高效表達的研究具有重要的意義。目前，已有不少的啟動子被克隆和功能鑒定[9]。

新型疫苗主要包括亞單位疫苗、基因缺失疫苗、核算疫苗、重組活載體疫苗等，盡管大多數(shù)被認為較為安全，但往往都需要免疫刺激性強的佐劑來提高免疫效果。菌蛻疫苗可通過發(fā)酵大量生產(chǎn)且無需參與佐劑即可獲得頑強的免疫效果。

目前，畢赤酵母表達系統(tǒng)中較常用的表達載體有兩類[10]：種是分泌型表達載體(如pPIC9K)，另一種是組成型表達載體(如pGAPZB)。前者(以pPIC9K為例)含有的醇氧化酶啟動子pAOX1，可以在甲醇的誘導下高效表達。該載體自身攜帶有α分泌信號肽，可以將外源蛋白直接分泌到胞外。后者(以pGAPZB為

例)含有三磷酸甘油醛脫氫酶基因啟動子pGAP，可以在多種碳源如葡萄糖、甘油、甲醇或油酸條件下表達外源蛋白，且不需添加誘導物[11]。

在啟動子功能的研究中，多數(shù)是利用報告基因的表達量來達到功能研究的目的，常用的報告基因有綠色熒光蛋白GFP(greenfluorescentprotein)、紅色熒光蛋白RFP(redfluorescentprotein)β-葡糖醛酸糖苷酶GUS(β-glucuronidase)和氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶CAT(chloramphenicolacetyltransferase)等[12,13]。在前期的工作中，克隆了啟動子pScgpd，并在巴斯德畢赤酵母中研究了AOX1啟動子的功能[14]。試驗以人血清白蛋白(HSA）作為報告基因，在PichiapastorisGS115中表達。

到目前為止，利用