色層分析法1優(yōu)秀課件

第三章色層分析法4/7/20231色層分析法提綱吸附層析分配層析親和層析凝膠層析實驗技術4/7/20232●概述色層分析法最早始于1900年。1931年,R.Kuhn等人分離復雜的有機混合物1941年,分配層析概念以及液-液分配層析的塔板理論。1944年,紙層析。50年代開始,出現(xiàn)了氣相層析、液相層析、高效液相層析、薄層層析、離子交換層析、凝膠層析、親和層析等,層析法和其它技術的聯(lián)用。4/7/20233色層分析法是由流動相，帶著被分離的物質流經固定相，在移動過程中，各種溶質受到固定相不同程度的作用，從而使試樣中的各種組分分離。4/7/20235柱層析：固定相裝填在管中成柱形，在柱中進行的層析分離；紙層析：利用濾紙作為固定相的層析分離；薄層層析：固定相在玻璃板、鋁膜等支持物上鋪成薄層的層析分離。按固定相的裝填方式分類4/7/20236根據(jù)分離的原理分類類型原理固定相常用操作方式吸附層析吸附力，疏水力和靜電力硅膠Al2O3、活性炭、羥基磷灰石

柱層析、薄層層析分配層析分配系數(shù)、溶解度硅膠、纖維素、濾紙、硅藻土紙層析、柱層析、薄層層析親和層析生物分子親和力帶配基的瓊脂糖、葡萄糖以及硅膠等薄層層析、柱層析凝膠層析排阻效應交聯(lián)葡聚糖、瓊脂糖柱層析離子交換層析離子間作用力樹脂、離子型纖維素、葡聚糖等離子交換劑柱層析、薄層層析4/7/20237

吸附指在固體或液體內部或表面的選擇性傳遞。被吸附的物質稱為溶質，固體材料稱為吸附劑。圖15.14/7/20239

吸附層析混合物隨流動相通過由吸附劑組成的固定相時在固定相和流動相作用下發(fā)生吸附、脫附、再吸附、再脫附的反復過程。4/7/2023101．原理吸附層析是通過樣品在固定相和流動相之間的吸附、脫附作用而實現(xiàn)分離的，這種吸附作用是一種物理吸附，通常是單分子層或雙分子層或多分子層。包括幾種作用力，被分離樣品與吸附劑之間相反電荷基團與基團之間的靜電引力，氫鍵、偶極分子之間定向力及范德華力等。4/7/202311線形的吸附等溫線非線形的吸附等溫線4/7/2023132．吸附劑的選擇高選擇性以實現(xiàn)很好分離；高容量以減少吸附劑的使用量；對于快速吸劑具有很好的動力學和傳遞特性；具有化學和熱穩(wěn)定性，在流動相中不溶解以保持吸附劑特性；具有一定的機械強度和惰性，防止破碎和腐蝕；易于充填或鋪層；不會與欲分離試樣和流動劑發(fā)生化學反應；抗污染性強；價格便宜。4/7/202314

吸附劑的多孔結構，粒度和粒子形狀是影響色層系統(tǒng)特性的基本因素。4/7/202315活化吸附劑一般可分為極性和非極性兩類。極性吸附劑包括氧化物、氫氧化物和鹽，在吸附過程中，離子與偶極、偶極與偶極的相互作用起主導作用。非極性吸附劑如活性碳，硅膠等，吸附作用主要是色散力作用的結果。影響吸附劑性質因素：化學結構、吸附劑的溶劑化作用以及吸附劑的預處理、吸附劑的物理狀態(tài)4/7/202317在選擇吸附劑時，一般是根據(jù)吸附劑和被吸附物質理化性質進行的。極性強的吸附劑易吸附極性強的物質、非極性的吸附劑易吸附非極性的物質。但是為了便于解吸附，分離弱極性的組分選用極性強的吸附劑，分離極性較強的組分應選用極性小的吸附劑。常用的吸附劑有Al2O3，硅膠，羥基磷灰石，聚酰胺等。4/7/202318（1）硅膠

硅膠是由聚硅酸脫水制得的顆粒狀吸附劑4/7/202319（2）氧化鋁

Al2O3是由Al(OH)３脫水制得，Al2O3表面存在鋁羥基Al－ＯＨ，由于羥基的Ｈ鍵作用而能吸附其它物質。

Ａl2O3可分為中性、酸性、堿性三種。中性氧化鋁適用于醛、酮、酯、內酯化合物及某些苷的分離；

酸性氧化鋁適用于酸性化合物，如酸性色素、某些氨基酸，以及對酸穩(wěn)定的中性物質的分離；堿性Ａl2O3適用于分離堿性化合物如生物堿、醇以及其它中性和堿性物質。一般講，能用酸性或堿性氧化鋁分離的物質也可用中性的氧化鋁分離。一般Ａl2O3用量為樣品量的5～２０倍。

4/7/202321

活度級別含水量（%）Al2O3硅膠Ⅰ００Ⅱ３５Ⅲ６１５Ⅳ１０２５Ⅴ１５３８4/7/202322（3）羥基磷灰石

化學式[Ca5(PO4)3OH]2，簡稱HA。國外的Bio－Rad公司生產的HA有三種規(guī)格，分別適用于不同條件。由于HA的吸附容量高，穩(wěn)定性好（在T<85℃，PH5.5~10.0均可使用）。HA的Ca2＋基團和生物表面的負電荷基團的相互反應，在用HA分離生物分子過程中起著重要的作用。HA的PO43-基團與生物分子表面的陽電荷基團的相互反應，起著次要的作用。4/7/202323iii)忌用檸檬酸緩沖液和PH<5.5的緩沖液。當用過的HA層析柱再生時，要先挖去頂部的一層HA，然后用一倍床體積1mol/LNaCl溶液洗滌，接著用4倍床體積的平衡液洗滌平衡，如此處理后即可使用。iv)就操作容量來說，一般細顆粒HA比粗的大；從分辨率比較，粗顆粒HA也沒有細的好。但是用細的顆粒層析時，柱子直徑大些才能達到滿意的流速。參考書：《生物化學技術原理及其應用》

P45～P464/7/202325（4）聚酰胺

由己內酰胺聚合而成，層析用聚酰胺是白色多孔性的非晶形粉末，對堿比較穩(wěn)定，對酸的穩(wěn)定性較差。聚酰胺分子內存在著很多的酰胺鍵，可與酚類、酸類、醌類、硝基化合物等形成氫鍵，因而對這些物質有吸附作用。各種化合物因其與聚酰胺形成氫鍵能力的不同，吸附能力也就不同，因此可以得到分離。4/7/202326單體交聯(lián)劑極性孔徑比表面m2/gAmberliteXAD-1苯乙烯二乙烯苯非極性200100XAD-2苯乙烯二乙烯苯非極性90330XAD-4苯乙烯二乙烯苯非極性50750Xad-7α-甲基丙烯酸甲酯雙（α-甲基丙烯酸）乙二醇酯中極性80450XAD-9亞砜極性80250XAD-10丙烯酰胺極性35269XAD-12氧化氮類強極性130025Diaion系列HP-10苯乙烯二乙烯苯非極性400HP-20苯乙烯二乙烯苯非極性600HP-30苯乙烯二乙烯苯非極性500-6004/7/20232942非極性苯乙烯LewapolG-7318128極性苯酚甲醛縮合物DuoliteS-3090強極性二乙烯苯帶強極性基團GDX-60180極性二乙烯苯含氮極性化合物GDX-501370強極性二乙烯苯乙烯、吡啶GDX-401590非極性二乙烯苯苯乙烯GDX-104400-500非極性二乙烯苯苯乙烯HP-50600-700非極性二乙烯苯苯乙烯HP-40比表面m2/g孔徑極性交聯(lián)劑單體4/7/202330吸附樹脂在中藥提取分離中的發(fā)展和應用

中藥提取液－通過吸附樹脂－吸附上有效成分的樹脂－洗脫－洗脫液－回收溶液－藥液－干燥－半成品

由于吸附和篩選原理，有機化合物根據(jù)吸附力的不同及分子量的大小，在吸附樹脂上經一定的溶劑洗脫而分開4/7/202331吸附樹脂吸附作用的影響因素樹脂本身化學結構溶劑被吸附的化合物的結構洗脫液4/7/202332樹脂的前處理市售的樹脂常含有未聚合的單體、致孔劑、分散劑等，使用前需除去其中可能有毒性的有機殘留物。前處理工藝合格的指標：醇洗脫液加水不顯渾濁；洗脫液蒸干后無殘留物。建議標準：不揮發(fā)性有機殘留物的檢查可參照美聯(lián)邦條例第170-199部分3卷21條（1998年修訂）；參照《日本藥典》對塑料容器質量控制的有關指標（電導率、易氧化物、酸洗脫液、熒光及紫外吸收）。4/7/202333吸附樹脂的安全性化學穩(wěn)定性交聯(lián)三維網狀結構＝〉機械穩(wěn)定性生物穩(wěn)定性有機殘留物總量小于５ppm4/7/202334用于中藥成份的提取精制公開發(fā)表的用樹脂純化的成分近４０種；對生物堿、黃酮、皂苷及其它具有一定極性的成分吸附性較好，對糖類的吸附能力較差。復方的純化中可能要考慮不同吸附性能樹脂的組合來分別吸附純化不同的有效成分。在中藥質量控制與分析中應用。4/7/2023354/7/2023364/7/202337新型吸附樹脂的開發(fā)

氫鍵型吸附樹脂依靠與被吸附物質之間形成氫鍵而實現(xiàn)選擇性分離ADS-17，它能與黃酮類、多元酚類形成氫鍵。ADS-21樹脂氫鍵型極性吸附樹脂，酰胺基聚苯乙烯結構可與酚、多元酚、取代酚類和黃酮類化合物的羥基形成氫鍵。對含有酸性酚羥基的化合物在酸性和弱堿性條件下均能保持良好的吸附性能。ADS-F8樹脂凝膠氫鍵型極性吸附樹脂，對黃酮類、多元酚類有較高的吸附選擇性。

4/7/2023384/7/202339不同吸附樹脂對GBE的分離效果產品使用樹脂黃酮甙(%)萜內酯(%)1ADS-17256.52受體型3073氫鍵樹脂40104DAD-1256.55ADS-F860<0.56混合型氫鍵樹脂<0.1304/7/202340藥材沙棘苦蕎大豆吸附樹脂ADS-22ADS-17ADS-7提取物中黃酮類成分的含量(%)20-5036-7050以上用吸附樹脂制備的黃酮類提取物4/7/202341離子-偶極型吸附樹脂

具有疏水性和離子偶極作用的雙功能吸附樹脂。ADS-7，它為聚苯乙烯結構、強極性吸附樹脂，用于吸附皂甙或其它甙類。特點是兼具吸附和脫色兩種功能。吸附樹脂洗脫液色素吸光度（420nm)甜菊甙純度(%)AB-8>1.080ADS-7<0.1904/7/202342不同樹脂對穿心蓮內酯的提取效果吸附樹脂ADS-7ADS-16ADS-8穿心蓮總內酯含量(％)25.6-3820.820.64/7/202343用于色層分離的選擇性吸附樹脂基于“強吸附－弱吸附”的差別，以適當?shù)牧鲃酉嗍够旌衔镏胁煌某煞窒群罅鞒鰳渲?，得到純的單一物質。4/7/202344用于非水體系的吸附樹脂用于水難溶或不溶的中藥成份的吸附分離。ADS-13從氯仿溶液中吸附分離長春堿，作用原理是形成氫鍵的作用。ADS-7從有機溶劑中吸附脂溶性的黃酮和多元酚類物質，作用原理是離子－偶極作用。ADS-M從有機溶劑中吸附生物堿類，作用原理是絡合作用。4/7/202345分子篩吸附樹脂除去分子量較小的雜質，提高分子量較大的有效成分的含量。除去中藥提取物中的農藥殘留。4/7/202346展望

樹脂吸附技術優(yōu)點

縮小劑量，提高中藥內在質量和制劑水平減小產品的吸潮性樹脂吸附技術能縮短生產周期,所需設備簡單明確純化的目的，采用樹脂純化的必要性和方法的合理性，尤其是復方混合提取的上柱純化。解決實際應用問題。建立樹脂的藥用標準。4/7/2023473．流動相及其選擇

流動相一般指洗脫吸附柱的溶液,它需要滿足以下要求:穩(wěn)定性好,粘度?。?.4~0.5）×10-3Pa·s,易于分離,易于洗脫所分離組分。4/7/202348

流動相的洗脫作用實質上是流動相分子與被分離的溶質分子競爭占據(jù)吸附劑表面活性中心的過程。強極性的組分容易被吸附劑所吸附，應選用極性較強的流動相才能把它從吸附劑上洗脫下來，使之沿著層析柱前進；

弱極性的組分則應選用弱極性的流動相洗脫之。

4/7/202349

以聚酰胺為吸附劑時,一般用水作流動相。

以吸附樹脂為吸附劑時，由于分子間吸附力較弱，可用低級醇、酮或其水溶液洗脫。

原則：弱酸性物質在酸性下吸附，堿性下洗脫；弱堿性物質在堿性下吸附，酸性下洗脫。在高濃度鹽溶液中進行吸附常用水解吸。常用的流動相按其極性增強順序排列為:石油醚<環(huán)己烷<二硫化碳<四氯化碳<苯<甲苯<氯仿<乙醚<乙酸乙脂<丙酮<正丙醇<乙醇<甲醇<吡啶<酸。在實踐中一般從極性小到極性大溶劑，通過實驗來選擇。

4/7/202350表1各種溶劑的介電常數(shù)（*20℃，其他25℃）溶劑介電常數(shù)溶劑介電常數(shù)n-己烷1．89*氯仿4．81石油醚2．0乙酸丁酯5．01*環(huán)己烷2．02乙酸已酯6．02四氯化碳2．23吡啶12．3苯2．27丙酮20．7甲苯2．38乙醇24．3甲醇32．6水78．54/7/202351

在選擇洗脫劑時,還可以由各種溶劑按不同配比配成混合溶劑作為流動相；因此流動相的種類很多，流動相的選擇也就比固定相的選擇更為復雜。為了獲得物質的最佳分離，尤其是極性相差大的物質，應采用洗脫能力遞增的流動相。在實踐中一般從極性小到極性大溶劑，通過實驗來選擇。4/7/202352二．分配層析

1.原理2.固定相及其選擇3.流動相及其選擇4/7/202353

在一個有兩相存在的系統(tǒng)中，利用不同物質的分配系數(shù)不同而使其分離的方法。

在層析分離過程中，這兩種互不混溶的溶劑之一為流動相；

另一種是吸收在載體中的溶劑，這種溶劑是鍵合在載體中，在層析過程不流動為固定相。

例如：以硅膠為支持物，硅膠上鍵合水為固定相，氯仿為流動相分離氨基酸就是一個典型的分配層析實驗。4/7/2023541．原理分配層析是根據(jù)欲分離組分在兩種互不混溶（或部分混溶）溶劑間溶解度的差異來實現(xiàn)的，當流動相帶著試樣中的各種組分沿著層析方向流動時，試樣中的各種組分就在流動相和固定相兩種溶劑間進行分配，不同的組分分配系數(shù)有差異時，它們前進的速度就不相同，于是得以分離。

4/7/202355分配層析中的分配系數(shù)以Kd表示之。Vs、Vm分別為固定相和流動相的體積，Cs、Cm為溶質在兩相中的濃度。于是：4/7/2023562．固定相及其選擇分配層析固定相是通過吸附或鍵合作用于載體上。常用的載體應符合以下要求：具有多孔結構，能保留較多的固定相，并且吸附或鍵合固定相能力較強，以防在洗脫過程中被流動相帶走。載體有良好的化學惰性。良好的物理化學惰性。價格低廉，使用方便。

4/7/202357分配層析中常用的載體有如下幾種：硅膠：在分配層析中用作載體的硅膠一般在80℃左右活化，使其表面殘留一定量的水分作固定相。纖維素：

層析用纖維素可分為兩種，即天然纖維素和微晶纖維素。前者是由質量較好的紙漿，經干燥、粉碎后制得，纖維長約2-20um，平均聚合程度為400-500；微晶纖維素是由棉花等較純的纖維素，加強酸一起加熱，部分水解后形成的微小晶體纖維素，平均聚合程度為40~200。纖維素上有許多羥基，易與水形成氫鍵而將水吸附，這種吸附著的水分形成分配柱層析中的固定相。4/7/2023583．流動相及其選擇

分配柱層析中的流動相一般是與水不相混溶的有機溶劑如正丁醇、正戊醇等。為了防止層析過程中流動相把吸附于擔體上的少量水分帶走，流動相應預先以水飽和;為了防止某些被分離組分的離解，流動相應加入醋酸、氨水等弱酸、弱堿。4/7/202359選擇各組分溶解度相差大的溶劑正相層析（固定相極性大于流動相極性）水溶性樣品，極性固定相，非極性展開劑反相層析（固定相極性小于流動相極性）親脂性樣品，非極性固定相，極性展開劑

分配層析展開劑選擇4/7/202360化合物固定相流動相水溶性生物堿水或緩沖液丁醇、乙酸乙酯甙類水氯仿或乙酸乙酯酚類水環(huán)己烷有機酸稀硫酸環(huán)己烷與氯仿甾體化合物甲醇環(huán)己烷乙二醇甲苯甲酰胺異丙醚氨基酸的衍生物不同pH緩沖液乙醚、氯仿、正丁醇4/7/202361三．親和層析

1.原理2.親和吸附劑的選擇3.流動相及其選擇4.親和吸附劑中“手臂”5.親合層析實驗技術4/7/202362

親和層析又稱為功能層析。這種層析是利用底物，抗體和抗原等之間的特異性親和力來選擇分離的。

生物大分子具有與其相應的專一分子可逆結合的特性，即在一定條件下某些物質只能與某一種生物大分子物質結合而不與其他生物大分子結合，當條件改變時如溶液pH或離子強度改變他們又解離。酶與底物、酶與抑制劑、酶與變構效應劑、酶與輔酶、激素與細胞受體、維生素與結合蛋白、基因與核酸、抗體和抗原、外源凝聚素與紅學球表面上的抗原等等，都具有這種特異親合的關系。4/7/2023634/7/202364[E0]表示初始濃度。[L0]表示固定化配體的初始濃度[E]表示游離的生物大分子的濃度。

KL表示生物大分子和配體親和力的大小，[L0]的數(shù)值越大，形成的EL就越多。KL的值大，生物大分子對其配體的親和力小，反之，則生物大分子對其配體的親和力就大。E表示待分離的生物大分子，L表示配體，EL代表配體復合物EL的解離常數(shù)KL為：4/7/202365在親和層析中，一般都盡可能地提高固定化配體的濃度，對于親和力較低的體系更加如此。但是在下列兩種情況下，高的固定化配體是不適宜的：

體系的親和力特別高，以至于不用強烈的洗脫條件便不能將吸附的大分子洗脫下來。如果配體本身帶有電荷，則不能用高濃度固定化配體的載體進行親和層析。因為，固定化配體濃度高，載體單位面積上固定化配體的密度就大，和其它雜蛋白之間同時形成的離子鍵的數(shù)目也就多，這種離子交換作用造成的非專一性吸附也就強烈。4/7/2023662．親和吸附劑的選擇（1）配體的選擇（2）基質的選擇4/7/202367作為親和層析的配體須具備3個條件：

在一定的條件下，與純化的物質進行專一性結合而且具有較強的親和力。配體和生物大分子結合后,在一定的條件下又能解離,而且無損于生物大分子活性。配體具有與基質連接的化學基團。1）配體的選擇4/7/202368不溶于水又具有高度的親水性；化學惰性,極低的非特異性吸附,如物理吸附,離子交換等；有較好的物理和化學的穩(wěn)定性；具有足夠數(shù)量的化學基團,經化學方法活化后,易和配體結合；具有稀松的多孔網狀結構。（2）基質的選擇4/7/202369瓊脂糖凝膠

一種直鏈多糖，凝膠態(tài)的瓊脂糖鏈呈平行螺旋狀，中間由氫鍵維系，這些多糖鏈縱橫交錯，成了多孔網狀結構，商品名為Sepharose或Bio-gelA，用2，3-二溴丙醇交聯(lián)的瓊脂糖凝膠，其商品名稱為SepharoseCL。

由于瓊脂糖鏈間沒有共價交聯(lián)，因此它在逆境中很不穩(wěn)定，使用溫度一般在0－40℃之間，pH范圍在4－9之間，而且一般加抗菌劑濕態(tài)保存。

4/7/202370聚丙烯酰胺凝膠

由單體丙烯酰胺和交聯(lián)劑N,N-亞甲基酸丙烯酰胺聚合而成的，其商品名為Bio-gelP,P后的不同數(shù)字表示排阻限度，如Bio-gelP-100表示允許進入凝膠顆粒內部的球蛋白或肽的最大分子量為100×1000=105。聚丙烯酰胺凝膠呈干粉狀，加水后溶脹，其結構較緊密，孔小，有些大分子不易滲入。其使用的pH范圍是2－10。4/7/202371葡聚糖凝膠

由右旋糖苷經環(huán)氧氯丙烷交聯(lián)而成的珠狀凝膠，商品名為Sephadex。它是一種小網孔型凝膠，而且與配體結合后多孔性大大降低。

4/7/202372纖維素

由葡萄糖殘基組成的鏈狀化合物，但商品纖維素具有不可忽略的吸附性，且結構不均一，限制了其在親和層析中的應用。4/7/202373多孔玻璃珠

一種硼硅酸鈉玻璃經高溫，酸和堿處理制備的控制孔徑的玻璃，常用CPG表示。多孔玻璃作為無機載體具有穩(wěn)定性高的優(yōu)點，不同CPG的孔徑大小適用于從酶和病毒直到完整的細胞。但是表面帶的電荷常會引起非專一吸附。

4/7/2023743．親和吸附劑的制備配體與基質偶聯(lián)才能成為親和吸附劑，不同基質與配體采用不同的方法，但其制備過程分步進行：（1）基質的活化；（2）讓配體與活化的基質進行偶聯(lián)反應，形成共價鍵，從而使配體接到基質上。4/7/202375（1）多糖類基質的溴化氰活化與偶聯(lián)溴化氰活化法4/7/202376（2）環(huán)氧乙烷法活化與偶聯(lián)4/7/202377（3）聚丙稀酰胺凝膠堿催化，產生一個羧基，在碳二亞胺作用下，與具有氨基的化合物偶聯(lián)。生成酰肼的衍生物，再經過?；?，烷化或在亞硝酸作用下生成?；B氮的衍生物，從而與另一個化合物偶聯(lián)。生成氨乙類的衍生物。4/7/2023784/7/202379（4）多孔玻璃基質的偶聯(lián)4/7/202380（5）基團特異性吸附劑基團特異性吸附劑基團特異性刀豆球蛋白瓊脂糖凝膠(concanavalin-A-agarose)帶吡喃葡聚糖的大分子及其他糖類物質（糖蛋白和糖脂）聚尿苷酸-瓊脂糖凝膠含有聚腺苷酸的核酸，聚尿苷酸結合的蛋白質聚腺苷酸瓊脂糖凝膠含有聚尿苷酸的核酸，mRNA連接的蛋白質亞胺基二乙酸瓊脂對重金屬具有親和力的蛋白質Cibracron-藍-瓊脂糖凝膠帶有核苷酸輔助因子的酶、血清蛋白蛋白質-A-瓊脂糖凝膠IgG-抗體4/7/2023814．親和吸附劑中“手臂”4/7/202382為了減少載體的立體障礙，增加配基的活動度，往往在配基與載體之間連接一個具有適當比度的“手臂”。一般采用２種方法：（１）先將手臂的一端與配體連接，再將手臂的另一端與載體偶聯(lián)；（２）先在載體上按上手臂，再把配基按到手臂上。4/7/202383是否商品親合吸附劑選擇凝膠配基緩沖液中膨化凝膠偶聯(lián)制備凝膠裝柱否是緩沖液平行層析柱內固定相上樣洗脫，除去樣品中的其它物質再洗脫，洗脫要分離的大分子物質收集并分析所得的洗脫液凝膠再生4/7/202384

柱裝好后選用合適的緩沖液平衡柱，所用緩沖液的組成、pH值和離子強度有利于親合復合物的形成，通常選擇中性pH為吸附條件。4/7/202385層析柱中的配基與被分離物之間以H鍵、離子間的相互作用或疏水效應相連接，當采用洗脫劑洗脫時，通過削弱他們之間的鍵力，使被分離物和配基分離，并被洗脫下來。如果待分離的物質與固定配體之間的親和力較弱，可以連續(xù)地用大體積的平衡柱用的緩沖液洗脫。如果配基和生物分子之間的親和力很高時，改變pH或是離子強度，從而改變配基和生物分子的解離程度，以降低其與固定配體間的親和力，并從層析柱中洗脫下來。

4/7/202386有時可采用Chaotropic試劑洗脫，即在緩沖液中加入較弱的變性劑，如尿素，胍-鹽酸，CCl3-COO-等，變性劑可使生物大分子發(fā)生某種程度的變形，減低親合凝膠上所形成的大分子配基復合物的穩(wěn)定性，從而有利于大分子物質的洗脫。但是有時親和吸附存在著較強的非專一吸附，親和吸附劑不僅能吸附待分離的生物大分子，同時也能吸附一定量的雜蛋白或其它雜質。4/7/202387欲達到純化的目的可選擇一種和配基親和力很強的物質加到洗脫緩沖液中洗脫時，該物質及被吸附的大分子物質和配基發(fā)生競爭性結合，當洗脫液內物質搶占了配基之后，原來結合在配基上的生物大分子被取代而脫離配基，這種洗脫方式稱為專一性洗脫。4/7/202388親和吸附劑使用一段時間后，會發(fā)生雜蛋白的積累，引起柱子性質的改變，因此層析洗脫之后柱子需要更加充分的洗滌，通常每次層析之后應該用2mol/L的KCl—6mol/L尿素洗滌層析柱。為了恢復親和柱的吸附容量，通常把污染了的親和吸附劑與非專一性的蛋白酶一起保溫過夜，這種方法幾乎可以完全恢復柱的吸附容量。通過這樣的處理，可大大地延長層析柱的壽命。4/7/202389四．凝膠層析

1.凝膠層析的基本原理2.凝膠層析的基本概念3.凝膠的結構和性質

4/7/202390凝膠層析（GelChromatography）又稱分子篩層析，凝膠過濾，排阻層析(elusionchromatography)等。凝膠層析是指混合物（如蛋白質）隨流動相經固定相（凝膠）的色柱時，混合物中各組份按其分子的大小不同進行分離的技術。

用于凝膠層析的凝膠有交聯(lián)葡聚糖（商品名為Sephadex）,瓊脂糖凝膠（商品名為Sepharose）和聚丙稀酰胺凝膠（商品名為Bio-GelP）以及交聯(lián)聚苯乙烯，氧化鋅交聯(lián)的氯丁橡膠等。4/7/2023911．凝膠層析的基本原理凝膠是一種具有立體網狀結構的物質，凝膠層析的機理是分子篩效應。當含有大小分子的混合物樣品加入到色譜柱中。這些物質隨洗脫液的流動而移動。大分子不能進入凝膠內部而沿凝膠顆粒間的空隙隨洗脫液移動，最先流出柱外；而小分子可通過凝膠網孔進入粒子內部，然后再擴散出來，流速緩慢，以至最后流出色譜柱。也就是，凝膠層析是按溶質分子量的大小，分別先后流出色譜柱，大分子先流出，小分子后流出。

4/7/202392當兩種以上不同分子量的分子均能進入凝膠粒子內部時，則由于它們被排阻和擴散程度不同，在層析柱內所經過的時間和路程長短不同，從而使樣品分子大小不同的物質得到分離。4/7/202393凝膠裝柱后，柱床容積（Vt）可分為三個組分，即：

Vt=Vo+Vi+Vg

Vo為外容積柱床內凝膠顆粒之間液體的體積，相當于一般層析法中柱內流動相容積；

Vi為內容積，即凝膠顆粒內部所含的液體體積，相當于一般層析法中的固定相容積；

Vg為凝膠顆粒本身的體積。

4/7/202394每個溶質分子在流動相和固定相之間有一個特定的分配系數(shù)Kd,則它的洗脫體積Ve為：

Ve=Vo+KdVi

4/7/202395Kd可有下列幾種情況：

當Kd=0時，Ve=Vo,即溶質分子完全不能進入凝膠顆粒內，完全被排阻于凝膠顆粒微孔之外而最先洗脫下來。當Kd=1時，Ve=Vo+Vi，即溶質分子完全滲入凝膠內部，在洗脫過程中將最后流出柱外。當0<Kd<1時,Ve=Vo+KdVi，即溶質分子以某種程度向凝膠顆粒內擴散，Kd愈大，進入凝膠顆粒內的程度愈大，此時Ve在Vo與Vo+Vi之間變化。一般情況下，凝膠對組分沒有吸附作用，有時Kd>1,即凝膠對組分有吸附作用，此時Ve>Vo+Vi，如苯丙氨在SephadexG-25中的Kd值為１.2。4/7/202396可以看出，對某一凝膠介質，兩種全排出的分子即Kd都等于零，雖然分子大小有差別，但不能有分離效果。同樣，兩種分子如都能進入內部空隙，即都等于1，它們即使分子大小有不同，也沒有分離效果。因此不同型號的凝膠介質，有它一定的使用范圍。上式中總床體積Vt，可由圓柱形層析柱的體積計算（V=0.25πD2h）,而外體積Vo的測定，可采用一個分子量遠超過凝膠排阻極限的有色大分子的溶液通過色譜床，其洗脫體積就等于Vo，最常用的參照物為分子量約200萬的藍色葡聚糖-2000。Vi可由Wg求得，g為干凝膠重(g)，WR為凝膠的吸水量(ml/g)，或選用一個自由擴散的小分子通過色譜床，此時Kd=1，則Vi=Ve-Vo。4/7/202397在實際工作中對小分子物質也得不到Kd=1的數(shù)值，Vi不易正確測定，故把整個凝膠都作為固定相，則分配系數(shù)Kav定義如下：

Ve=Vo+Kav(Vt-Vo)4/7/2023982．凝膠層析的基本概念（1）得水率（waterregain,Wr）

1克凝膠吸收水的克數(shù)稱為得水率。如SephadexG-100，型號后的數(shù)字表示凝膠的得水率乘以10，其得水率為10，即1克G-100干凝膠膨化時能吸收10克水。這個數(shù)值只表示吸進凝膠顆粒內部的水分，不包括凝膠顆粒周圍的水分。4/7/202399

排阻極限是指不能擴散進入凝膠顆粒網孔內部的最小溶質分子的分子量。

如典型的葡聚糖凝膠SephadexG-75，排阻限度為7*104道爾頓，樣品混合物中凡是分子量大于7*104道爾頓的化合物分子在這種凝膠上層析時就得不到有效的分離。（2）排阻極限（exclusionlimit）4/7/2023100使溶質分子在某種凝膠中得到很理想的線性分離的范圍就稱為這種凝膠的分級分離范圍（Fractionationrage）。如SephadexG-50，分級分離范圍為1.5*103-3.0*104道爾頓。4/7/20231013．凝膠的結構和性質

天然的和人工合成的凝