第三章動植物細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)酶

本章主要內(nèi)容第一節(jié)動植物細(xì)胞中酶生物合成的調(diào)節(jié)第二節(jié)植物細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)酶第三節(jié)動物細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)酶現(xiàn)在是1頁\一共有40頁\編輯于星期四概述動植物細(xì)胞培養(yǎng)定義：是通過特定技術(shù)獲得優(yōu)良的動物和植物細(xì)胞，然后在人工控制條件的反應(yīng)器中進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，以獲得所需產(chǎn)物的技術(shù)過程。現(xiàn)在是2頁\一共有40頁\編輯于星期四概述獲取方法培養(yǎng)方式培養(yǎng)目的動物細(xì)胞離心分離、雜交瘤技術(shù)、胰蛋白酶消化懸浮培養(yǎng)、貼壁培養(yǎng)、微載體培養(yǎng)獲得功能蛋白質(zhì)植物細(xì)胞機(jī)械搗碎、酶解、誘導(dǎo)愈傷組織、分離原生質(zhì)體固體培養(yǎng)、液體淺層培養(yǎng)、液體懸浮培養(yǎng)獲得次生代謝產(chǎn)物現(xiàn)在是3頁\一共有40頁\編輯于星期四第一節(jié)動植物細(xì)胞中酶生物合成的調(diào)節(jié)動植物細(xì)胞更復(fù)雜，調(diào)節(jié)層次更多。細(xì)胞水平個體水平（激素、神經(jīng)水平）下面著重從細(xì)胞水平討論。現(xiàn)在是4頁\一共有40頁\編輯于星期四第一節(jié)動植物細(xì)胞中酶生物合成的調(diào)節(jié)一、細(xì)胞分化改變酶的生物合成原因：基因表達(dá)具有時空性如：胰蛋白酶主要在胰細(xì)胞中合成木瓜蛋白酶主要在果皮細(xì)胞中合成端粒酶在胚胎細(xì)胞、生殖細(xì)胞、干細(xì)胞、分化程度低的癌細(xì)胞中具活性?，F(xiàn)在是5頁\一共有40頁\編輯于星期四第一節(jié)動植物細(xì)胞中酶生物合成的調(diào)節(jié)2、基因擴(kuò)增加速酶的生物合成即通過增加基因的數(shù)量來調(diào)節(jié)基因表達(dá)的一種方式。如：對藥物的抗性。3、增強(qiáng)子促進(jìn)酶的生物合成增強(qiáng)子能促進(jìn)同源或異源啟動基因的轉(zhuǎn)錄活性。4、抗原誘導(dǎo)抗體酶的生物合成半抗原誘導(dǎo)法酶蛋白誘導(dǎo)法現(xiàn)在是6頁\一共有40頁\編輯于星期四第二節(jié)植物細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)酶近年來通過植物細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)酶的研究已經(jīng)取得可喜進(jìn)展現(xiàn)在是7頁\一共有40頁\編輯于星期四含酶制品——嫩肉粉現(xiàn)在是8頁\一共有40頁\編輯于星期四第二節(jié)植物細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)酶一、植物細(xì)胞的特性大生長及代謝率低營養(yǎng)要求簡單需光對剪切力敏感生產(chǎn)次級代謝產(chǎn)物現(xiàn)在是9頁\一共有40頁\編輯于星期四第二節(jié)植物細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)酶二、植物細(xì)胞培養(yǎng)的特點提高產(chǎn)率縮短周期易于管理，減輕勞動強(qiáng)度提高產(chǎn)品質(zhì)量其他：需光照等現(xiàn)在是10頁\一共有40頁\編輯于星期四第二節(jié)植物細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)酶外植體的選擇和處理→愈傷組織的誘導(dǎo)→細(xì)胞的獲取→細(xì)胞培養(yǎng)→分離純化→產(chǎn)物外植體的選擇與處理：選擇外植體、切取片段、消毒處理。植物愈傷組織直接分離法機(jī)械搗碎發(fā)：動作輕柔酶分解法：纖維素酶、果膠酶等過濾、離心分離愈傷組織誘導(dǎo)法能迅速增殖、無特定結(jié)構(gòu)和功能的薄壁細(xì)胞團(tuán)外植體半固體培養(yǎng)基滅菌、冷卻生長素、分裂素插入培養(yǎng)25℃愈傷組織1-3周分散、接種原生質(zhì)體再生去除細(xì)胞壁后得到的微球體三、植物細(xì)胞培養(yǎng)的工藝條件及其控制（一）植物細(xì)胞培養(yǎng)的工藝流程植物細(xì)胞的獲取：現(xiàn)在是11頁\一共有40頁\編輯于星期四第二節(jié)植物細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)酶三、植物細(xì)胞培養(yǎng)的工藝條件及其控制（一）植物細(xì)胞培養(yǎng)的工藝流程外植體→細(xì)胞的獲取→細(xì)胞培養(yǎng)→分離純化→產(chǎn)物1、外植體的選擇與處理2、植物細(xì)胞的獲取3、細(xì)胞懸浮培養(yǎng)4、分離純化現(xiàn)在是12頁\一共有40頁\編輯于星期四第二節(jié)植物細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)酶三、植物細(xì)胞培養(yǎng)的工藝條件及其控制（二）植物細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基1、植物細(xì)胞培養(yǎng)基的特點與微生物培養(yǎng)基的主要不同點如下：（1）植物細(xì)胞的生長和代謝需要大量的無機(jī)鹽（2）植物細(xì)胞需要多種維生素和植物生長激素（3）植物細(xì)胞要求的氮源一般為無機(jī)氮源（4）植物細(xì)胞一般以蔗糖為碳源現(xiàn)在是13頁\一共有40頁\編輯于星期四第二節(jié)植物細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)酶三、植物細(xì)胞培養(yǎng)的工藝條件及其控制（二）植物細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基2、幾種常用的植物細(xì)胞培養(yǎng)基

1）MS培養(yǎng)基硝酸鹽濃度高，廣泛用于培養(yǎng)植物細(xì)胞、組織及原生質(zhì)體。2）B5培養(yǎng)基銨的濃度較低，適于雙子葉植物特別是木本植物的組織、細(xì)胞培養(yǎng)。3）White培養(yǎng)基無機(jī)鹽濃度低，適用于生根培養(yǎng)。4）KM-8P培養(yǎng)基主要用于原生質(zhì)體培養(yǎng)。現(xiàn)在是14頁\一共有40頁\編輯于星期四第二節(jié)植物細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)酶三、植物細(xì)胞培養(yǎng)的工藝條件及其控制（二）植物細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基3、植物細(xì)胞培養(yǎng)基的配制為取用方便及減小誤差，先配成母液保存?zhèn)溆谩＃?）大量元素母液：即含有N、P、S、K、Ca、Mg、Na等大量元素的無機(jī)鹽混合液。一般配成10倍濃度的母液。需單獨(dú)溶解，按順序攪拌混合。避免生成沉淀。（2）微量元素母液：即含有B、Mn、Zn、Co、Cu、Mo、I等微量元素的無機(jī)鹽混合液。一般配制成100倍濃度的母液。現(xiàn)在是15頁\一共有40頁\編輯于星期四第二節(jié)植物細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)酶三、植物細(xì)胞培養(yǎng)的工藝條件及其控制（二）植物細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基3、植物細(xì)胞培養(yǎng)基的配制（3）鐵鹽母液：單獨(dú)配制，一般采用敖和鐵，通常配制成100倍濃度母液。（4）維生素母液：是各種維生素和氨基酸的混合液，一般配成100倍濃度母液。（5）植物激素母液：各種植物激素單獨(dú)配制成母液。一般濃度為100mg/L.（注：一般難溶于水，需先用有機(jī)溶劑或酸、堿溶解，再用水定容。）現(xiàn)在是16頁\一共有40頁\編輯于星期四第二節(jié)植物細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)酶三、植物細(xì)胞培養(yǎng)的工藝條件及其控制（三）溫度的控制：一般室溫（25℃左右）溫度高，有利細(xì)胞生長；溫度低，有利于次級代謝產(chǎn)物積累。（四）pH的控制：一般微酸性（Ph5.0~6.0）（五）溶解氧的控制:通風(fēng)攪拌供給（不能太劇烈）?，F(xiàn)在是17頁\一共有40頁\編輯于星期四第二節(jié)植物細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)酶三、植物細(xì)胞培養(yǎng)的工藝條件及其控制（六）光照的控制：對強(qiáng)度及時間有要求。（七）前體的添加：前提指處于目的代謝途徑上游的物質(zhì)。（八）刺激劑的應(yīng)用：微生物細(xì)胞壁碎片、果膠酶、纖維素酶等微生物胞外酶?，F(xiàn)在是18頁\一共有40頁\編輯于星期四第二節(jié)植物細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)酶四、植物細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)酶的工藝過程1、大蒜愈傷組織的誘導(dǎo)2、大蒜細(xì)胞懸浮培養(yǎng)3、超氧化物歧化酶的分離純化現(xiàn)在是19頁\一共有40頁\編輯于星期四

第三節(jié)動物細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)酶由于動物細(xì)胞體外培養(yǎng)具有明顯的表達(dá)產(chǎn)物的優(yōu)點，為傳統(tǒng)微生物發(fā)酵所無法取代，因此，生物技術(shù)中許多有價值的生物制品，需要借助于動物細(xì)胞培養(yǎng)而獲得，這種需求極大地促進(jìn)了動物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展。現(xiàn)在是20頁\一共有40頁\編輯于星期四第三節(jié)動物細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)酶早在1907年，美國的Harrison在世界上首次將蛙的神經(jīng)組織在試管內(nèi)培養(yǎng)成功，建立起動物組織體外培養(yǎng)的第一塊基石。1950年前后，Enders及其同事發(fā)表了第一篇關(guān)于在培養(yǎng)細(xì)胞中生長病毒的報告，開拓了以動物病毒為研究對象的新領(lǐng)域。作為大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)，Copsik等人成功的進(jìn)行了有關(guān)倉鼠腎細(xì)胞的懸浮培養(yǎng)?，F(xiàn)在是21頁\一共有40頁\編輯于星期四第三節(jié)動物細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)酶隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展，人們逐漸認(rèn)識到有許多基因產(chǎn)物不能在原核細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，它們需要經(jīng)過真核細(xì)胞所特有的翻譯后修飾，以及正確的切割、折疊后，才能形成與自然分子一樣的功能和抗原性。使得動物細(xì)胞一躍成為一種重要的宿主細(xì)胞，用以生產(chǎn)多種生物制品等。這些采用大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)貴重藥品在臨床診斷、治療和預(yù)防等方面都有重要意義?，F(xiàn)在是22頁\一共有40頁\編輯于星期四動物細(xì)胞培養(yǎng)與微生物培養(yǎng)的不同點a.動物細(xì)胞無細(xì)胞壁，機(jī)械強(qiáng)度低，適應(yīng)環(huán)境能力差；b.生長速度緩慢，易受微生物污染，培養(yǎng)時需要抗生素；c.大多數(shù)動物細(xì)胞需附著在固體或半固體的表面生長；d.對營養(yǎng)要求嚴(yán)格；e.大規(guī)模培養(yǎng)時，不可簡單地套用微生物培養(yǎng)的經(jīng)驗。現(xiàn)在是23頁\一共有40頁\編輯于星期四

第三節(jié)動物細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)酶動物細(xì)胞生長十分緩慢，并易為大多數(shù)微生物污染物所破壞。支原體對動物細(xì)胞培養(yǎng)的威脅最大，因為其感染力強(qiáng)且不易檢出。因此，大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)成功的必要條件是要有一個設(shè)備精良的細(xì)胞庫。在細(xì)胞庫中的冷凍細(xì)胞不受污染?，F(xiàn)在是24頁\一共有40頁\編輯于星期四

第三節(jié)動物細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)酶動物細(xì)胞培養(yǎng)基的配方十分復(fù)雜，并且還需補(bǔ)充血清。原料的質(zhì)量控制和培養(yǎng)基的生產(chǎn)是大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)的主要問題。因為血清來源困難，質(zhì)量不穩(wěn)定，殘留血清給產(chǎn)物提純帶來困難等。現(xiàn)在是25頁\一共有40頁\編輯于星期四第三節(jié)動物細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)酶動物細(xì)胞培養(yǎng)主要用于生產(chǎn)下列功能蛋白質(zhì)：疫苗激素多肽生長因子酶單克隆抗體非抗體免疫調(diào)節(jié)劑狂犬病疫苗——培養(yǎng)VERO（非洲綠猴腎細(xì)胞）生產(chǎn)重組人白細(xì)胞干擾素現(xiàn)在是26頁\一共有40頁\編輯于星期四一、動物細(xì)胞的特性（1）沒有細(xì)胞壁，細(xì)胞適應(yīng)能力差，十分脆弱。（2）體積比微生物大，比植物細(xì)胞稍小。（3）相互粘連以集群形式存在。（4）營養(yǎng)要求復(fù)雜，培養(yǎng)基一般要添加血清?，F(xiàn)在是27頁\一共有40頁\編輯于星期四二、動物細(xì)胞培養(yǎng)的特點（1）主要用于功能蛋白質(zhì)和多肽的生產(chǎn)（2）生長較慢，15-100h（3）需要添加抗生素以防染菌（4）無細(xì)胞壁，體積較大，對剪切力敏感，要求嚴(yán)格控制培養(yǎng)條件如通風(fēng)、攪拌、pH、滲透壓等（5）大部分動物細(xì)胞有錨地依賴性，需要貼壁培養(yǎng)（6）培養(yǎng)基成分復(fù)雜，分離純化復(fù)雜，成本較高，多用于高價值藥物的生產(chǎn)（7）原代細(xì)胞培養(yǎng)50代之后即會退化死亡，需要重新分離細(xì)胞現(xiàn)在是28頁\一共有40頁\編輯于星期四三、動物細(xì)胞培養(yǎng)方式1、懸浮培養(yǎng)：血液細(xì)胞等對剪切力敏感2、貼壁培養(yǎng)：上皮、成纖維細(xì)胞等。滾瓶培養(yǎng)微載體培養(yǎng)3、固定化細(xì)胞培養(yǎng)吸附法包埋法培養(yǎng)瓶CGIII-12懸浮、貼壁培養(yǎng)細(xì)胞轉(zhuǎn)瓶機(jī)現(xiàn)在是29頁\一共有40頁\編輯于星期四細(xì)胞培養(yǎng)微載體系統(tǒng)現(xiàn)在是30頁\一共有40頁\編輯于星期四四、動物細(xì)胞培養(yǎng)的工藝條件及其控制工藝流程：制備細(xì)胞懸液→接種→培養(yǎng)→收集培養(yǎng)液→分離純化目的物現(xiàn)在是31頁\一共有40頁\編輯于星期四培養(yǎng)動物細(xì)胞的步驟1.無菌取出目的細(xì)胞所在的組織用培養(yǎng)液漂洗干凈；2.用無菌刀割掉多余部分并切成小組織塊；3.小組織塊置于解離液中離散細(xì)胞；4.低速離心洗滌細(xì)胞后，將目的細(xì)胞吸移到培養(yǎng)瓶中?，F(xiàn)在是32頁\一共有40頁\編輯于星期四動物細(xì)胞培養(yǎng)現(xiàn)在是33頁\一共有40頁\編輯于星期四小鼠組織塊，用胰蛋白酶處理后變成單個細(xì)胞，24h后（貼壁生長）的成纖維細(xì)胞現(xiàn)在是34頁\一共有40頁\編輯于星期四（一）動物細(xì)胞培養(yǎng)基的組成成分氨基酸：必需氨基酸谷氨酰胺作碳源及能源維生素血清提供或補(bǔ)充B族維生素、Vc等無機(jī)鹽調(diào)節(jié)滲透壓、提供必需元素等葡萄糖作碳源及能源激素維持正常的分裂與代謝（血清提供或添加）生長因子血清提供或添加現(xiàn)在是35頁\一共有40頁\編輯于星期四（二）動物細(xì)胞培養(yǎng)基的配制自制：配制母液并過濾除菌備用無血清培養(yǎng)基特定營養(yǎng)成分的添加購買：商品化培養(yǎng)基細(xì)胞培養(yǎng)用小牛血清無血清動物細(xì)胞培養(yǎng)基Wako(和光純藥)細(xì)胞培養(yǎng)無血清培養(yǎng)基SericinGIT現(xiàn)在是36頁\一共有40頁\編輯于星期四（三）溫度的控制溫度影響生長與代謝36.5℃+0.25℃溫度影響pH（通過影響CO2的溶解度影響pH）現(xiàn)在是37頁\一共有40頁\編輯于星期四（四）pH的控制一般控制在pH7.0~7.6微堿性范圍，通常pH7.4下生長最好。調(diào)節(jié)方法：通常用CO2與NaHCO3維持pH穩(wěn)定：緩沖系統(tǒng)CO2與NaHCO3系統(tǒng)、檸檬酸與檸檬酸鹽系統(tǒng)等pH監(jiān)測：酚紅指示劑pH7.6藍(lán)紅色pH7.4紅色橙色pH7.0黃色pH6.5現(xiàn)在是38頁\一共有40頁\編輯