(52)-第27.7章HLA分型方法的應(yīng)用

第27章第7部分HLA分型方法的應(yīng)用大家好！在前面的授課中我跟大家一起學(xué)習(xí)了HLA分型方法，也就是組織配型的方法。接下來，在本節(jié)課中我要跟大家一起分享的內(nèi)容是HLA分型方法的應(yīng)用。（在介紹此標(biāo)紅部分內(nèi)容時(shí)插入下面的文字）HLA分型方法主要可以應(yīng)用于以下3個(gè)方面:第一個(gè)應(yīng)用是供、受者HLA配型；第二個(gè)應(yīng)用是HLA交叉配型與預(yù)存抗體的檢測；第三個(gè)應(yīng)用是群體反應(yīng)性抗體的檢測。首先我們來看HLA分型方法在供、受者HLA配型中的應(yīng)用。器官移植時(shí)常采用HLA配型選擇合適的供者，以減輕移植排斥反應(yīng)。（在介紹此標(biāo)紅部分內(nèi)容時(shí)插入下面的文字）1987年，美國器官分配聯(lián)合網(wǎng)制定了強(qiáng)制性HLA-A、B、DR六抗原相配標(biāo)準(zhǔn)，主要用于腎臟移植前的配型。但臨床應(yīng)用顯示達(dá)到六抗原相配的移植僅占2-5%。1995年，美國器官分配聯(lián)合網(wǎng)將六抗原相配標(biāo)準(zhǔn)延伸為HLA-A、B、DR六抗原無錯(cuò)配，即國際上通用的HLA六抗原無錯(cuò)配標(biāo)準(zhǔn)，簡稱0AgMM。1995年，全美國達(dá)到HLA六抗原無錯(cuò)配標(biāo)準(zhǔn)的腎移植占15%，1996-1997年達(dá)到17%，2000年達(dá)到22%。鑒于HLA抗原配型標(biāo)準(zhǔn)的臨床實(shí)際應(yīng)用受到諸多特征條件的限制，尋找更為實(shí)用、臨床可行的配型策略，成為移植免疫學(xué)者、組織配型專家以及臨床醫(yī)師共同關(guān)注的重要課題。1996年3月，Terasaki教授領(lǐng)導(dǎo)的世界著名的UCLA組織配型中心提出了HLA-I類氨基酸殘基配型，簡稱ResM。同年10月，國內(nèi)譚建明教授等率先研究中國漢族人HLA-I、II類氨基酸殘基配型標(biāo)準(zhǔn)，并于1998年成功的將HLA-A、B、DR近500個(gè)等位基因的排列組合，按關(guān)鍵氨基酸殘基的不同，簡化為17個(gè)殘基組。氨基酸殘基配型標(biāo)準(zhǔn)的建立大大提高了移植相配率，并顯著改善了移植效果。（在介紹此標(biāo)紅部分內(nèi)容時(shí)插入下面的文字）那么，HLA配型與移植物的存活之間究竟有何關(guān)系？研究發(fā)現(xiàn)，二者之間有密切的關(guān)系，主要體現(xiàn)在以下3個(gè)方面：第一、供、受者HLA-A和HLA-B相配的位點(diǎn)數(shù)越多，移植物的存活概率越高；第二、供、受者HLA-DR位點(diǎn)相配更為重要，當(dāng)DR位點(diǎn)相配時(shí)，一般DQ位點(diǎn)也相配，因?yàn)槎呋虼嬖诤軓?qiáng)的連鎖不平衡。第三、由于不同地區(qū)HLA位點(diǎn)連鎖不平衡性存在差異，不同地區(qū)HLA匹配程度與移植結(jié)果的關(guān)系有著不同的預(yù)測價(jià)值。從以上3個(gè)方面可以看出，HLA配型與移植物存活之間的關(guān)系受多種因素的影響，不能用一個(gè)統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)來衡量。除了前面提到的供、受者HLA配型外，HLA分型方法還可應(yīng)用于交叉配型和預(yù)存抗體的檢測。移植前，如果受者血清中預(yù)先存在抗供者淋巴細(xì)胞的抗體，移植后80%會發(fā)生超急性排斥反應(yīng)。因此，必須做HLA交叉配型，從而檢測受者體內(nèi)抗供者淋巴細(xì)胞的細(xì)胞毒性抗體。HLA交叉配型采用補(bǔ)體依賴的細(xì)胞毒試驗(yàn)。（在介紹此標(biāo)紅部分內(nèi)容時(shí)插入下面的文字）根據(jù)反應(yīng)時(shí)參與的細(xì)胞成分不同，HLA交叉配型有3種方法：第一種方法是淋巴細(xì)胞交叉配型，它又分為外周血淋巴細(xì)胞交叉配型、T淋巴細(xì)胞毒性交叉配型、B淋巴細(xì)胞毒性交叉配型。下面以外周血淋巴細(xì)胞交叉配型為例，介紹一下它的操作流程：將受者的血清與供者的外周血混合，室溫下放置30分鐘，再加入補(bǔ)體，室溫下放置1個(gè)小時(shí)。然后加入染色液，放置3分鐘；最后，加入甲醛溶液室溫使細(xì)胞靜置沉降30分鐘，最后計(jì)數(shù)死亡細(xì)胞的比例。對于T和B淋巴細(xì)胞毒性交叉配型的方法和外周血淋巴細(xì)胞交叉配型的方法一樣，不同之處在于將外周血淋巴細(xì)胞換成了單純的T或B淋巴細(xì)胞。因?yàn)門淋巴細(xì)胞不含HLA-II類分子，所以只能用B淋巴細(xì)胞進(jìn)行抗HLA-II類分子的抗體檢測。另外，對于弱的HLA-I類分子而言，B淋巴細(xì)胞的敏感性要優(yōu)于T淋巴細(xì)胞，因?yàn)锽淋巴細(xì)胞與T淋巴細(xì)胞相比，其表面攜帶的HLA-I類分子更多，密度更大。（在介紹此標(biāo)紅部分內(nèi)容時(shí)插入下面的文字和圖片）HLA交叉配型的第2種方法是流式細(xì)胞術(shù)交叉配型。它是將受者的血清與供者的T或B淋巴細(xì)胞反應(yīng)，進(jìn)而與熒光標(biāo)記的二抗共孵育，經(jīng)流式細(xì)胞儀測定，得到細(xì)胞數(shù)與熒光強(qiáng)度的直方圖。熒光陽性的細(xì)胞越多，說明能與供者淋巴細(xì)胞表面的HLA分子結(jié)合的受者血清中的HLA抗體越多，但究竟是HLA-I類還是II類抗體，需要在配型的同時(shí)用T或B細(xì)胞表型抗體進(jìn)一步檢測后才能確定。（在介紹此標(biāo)紅部分內(nèi)容時(shí)插入下面的文字和圖片）HLA交叉配型的第三個(gè)方法是自身交叉配型。在自身交叉配型中，應(yīng)用受者自身的血清和自身的淋巴細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞毒性試驗(yàn)，如果有自身抗體存在，就會導(dǎo)致與供者的交叉配型為假陽性。自身交叉配型與供者的交叉配型一般同時(shí)開展。但自身抗體陽性不作為移植的禁忌。（在介紹此標(biāo)紅部分內(nèi)容時(shí)插入下面的文字和圖片）交叉配型的目的就是檢測受者體內(nèi)是否存在抗供者的抗體，如果為陽性，組織配型結(jié)果再好，也不能實(shí)施移植；但如果為陰性，即使組織配型差，仍可實(shí)施移植。另外，同學(xué)們要知道，目前腎臟移植時(shí)常做交叉配型，而其他器官移植時(shí)一般不做，因?yàn)槠渌鞴僖浦舶l(fā)生的排斥反應(yīng)與預(yù)存抗體的關(guān)系不大。最后，我們來介紹一下HLA分型方法在群體反應(yīng)性抗體檢測中的應(yīng)用。（在介紹此標(biāo)紅部分內(nèi)容時(shí)插入下面的文字和圖片）那么，什么是群體反應(yīng)性抗體？群體反應(yīng)性抗體是由HLA同種異基因免疫致敏誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體，比如說輸血、妊娠和器官移植都能導(dǎo)致抗HLA特異性抗體的產(chǎn)生。群體反應(yīng)性抗體的百分率可以反映體內(nèi)HLA抗體的水平，從而判斷器官移植時(shí)受者的敏感程度。（在介紹此標(biāo)紅部分內(nèi)容時(shí)插入下面的文字和圖片）群體反應(yīng)性抗體的檢測方法主要有補(bǔ)體依賴的細(xì)胞毒試驗(yàn)、ELISA和流式細(xì)胞術(shù)這3種方法。因?yàn)檠a(bǔ)體依賴的細(xì)胞毒試驗(yàn)只能檢測補(bǔ)體結(jié)合的細(xì)胞，而且需要活的淋巴細(xì)胞，并且不影響移植效果的IgM抗體對結(jié)果會有影響，因此這個(gè)方法在臨床當(dāng)中已經(jīng)不再使用。（在介紹此標(biāo)紅部分內(nèi)容時(shí)插入下面的文字和圖片）目前比較常用的檢測群體反應(yīng)性抗體的方法是ELISA方法。具體操作步驟如下：用純化的、包括當(dāng)?shù)厝酥薪^大部分的HLA特異性抗原預(yù)先包被酶標(biāo)板，檢測時(shí)加入待檢血清，然后再加入酶標(biāo)記物，最后加入底物顯色，根據(jù)顯色深淺就可以判斷出抗HLA抗體的特異性和效價(jià)。目前已有市售的針對這個(gè)方法的試劑盒。群體反應(yīng)性抗體檢測的第三種方法是流式細(xì)胞術(shù)，一般采用磁性微球法。將純化的HLA-I和II類抗原分別包被在不同的磁性微球上，檢測時(shí)加入待測血清，孵育后，再加入熒光標(biāo)記的抗人IgG抗體，然后在流式細(xì)胞儀上分析樣本中存在的抗HLA抗體的特異性及其效價(jià)。群體反應(yīng)性抗體在實(shí)體器官移植排斥反應(yīng)當(dāng)中發(fā)揮著重要作用。它的存在以及強(qiáng)度不僅與超急性排斥反應(yīng)密切相關(guān)，而且與移植物功能延遲、急性排斥反應(yīng)、慢性排斥反應(yīng)以及移植物存活率的下降關(guān)系密切。因此，臨床上要求對受者的群體反應(yīng)性抗體以及抗體特異性進(jìn)行定期檢查。本次課我們主要學(xué)習(xí)了HLA分型方法的應(yīng)用，主要有3個(gè)應(yīng)用，這3個(gè)應(yīng)用容易混淆，其實(shí)三者的檢測目的不同：對于供、受者HLA分型，檢測的是受者和供者淋巴細(xì)胞表面的HLA抗原類型或基因類型；對于HLA交叉配型，主要檢測的是受者血