發(fā)酵飼料生產(chǎn)工藝與應(yīng)用培訓(xùn)資料

發(fā)酵飼料生產(chǎn)工藝與應(yīng)用靈璧縣立騰同創(chuàng)農(nóng)牧科技有限責(zé)任公司二0一二年十一月目錄安徽省立騰同創(chuàng)農(nóng)牧科技有限公司簡(jiǎn)介安徽省立騰同創(chuàng)農(nóng)牧科技有限公司企業(yè)文化安徽省立騰同創(chuàng)農(nóng)牧科技有限公司的十年發(fā)展戰(zhàn)略—————安徽省立騰同創(chuàng)農(nóng)牧科技有限公司的第一個(gè)發(fā)展五年發(fā)展計(jì)劃發(fā)酵飼料生產(chǎn)的菌種及發(fā)酵工藝發(fā)酵飼料生產(chǎn)技術(shù)第一章發(fā)酵飼料生產(chǎn)的菌種及發(fā)酵工藝概述發(fā)酵飼料的定義發(fā)酵飼料的定義是：在人為可控制的條件下，以植物性農(nóng)副產(chǎn)品為主要原料，通過微生物的代謝作用，降解部分多糖、蛋白質(zhì)和脂肪等大分子物質(zhì)，生成有機(jī)酸、可溶性多肽等小分子物質(zhì)，形成營養(yǎng)豐富、適口性好、活菌含量高的生物飼料或飼料原料。采用發(fā)酵技術(shù)生產(chǎn)的動(dòng)物飼料或飼料原料，其特性主要是：（1）含有大量的活性微生物；（2）多數(shù)以厭氧發(fā)酵方式進(jìn)行生產(chǎn)；（3）未經(jīng)干燥的物料含水量通常在30%以上；（4）物料的酸性物質(zhì)明顯增加，營養(yǎng)組成更合理；（5）生產(chǎn)原料以植物性農(nóng)副產(chǎn)品為主。也有發(fā)酵成品是經(jīng)過干燥處理的，比較典型的有發(fā)酵豆粕和發(fā)酵棉粕。在發(fā)酵過程中有大量的活性乳酸菌和酵母菌發(fā)生的代謝作用，經(jīng)過干燥以后，乳酸菌基本都失活了，但是它們也屬于發(fā)酵飼料。發(fā)酵飼料的概述發(fā)酵飼料的生產(chǎn)工藝基本都是以固態(tài)發(fā)酵的方式進(jìn)行的，生產(chǎn)菌種以乳酸菌、芽孢桿菌和酵母菌為主，絕大多數(shù)采用厭氧或兼性厭氧發(fā)酵。發(fā)酵物料的含水量為30%~50%，發(fā)酵時(shí)間和溫度受環(huán)境影響很大，基本不進(jìn)行人為控制和調(diào)節(jié)。在實(shí)際生產(chǎn)中也有采用好氧發(fā)酵方式進(jìn)行的，生產(chǎn)菌種以霉菌和假絲酵母為主，生產(chǎn)用的蛋白原料主要是一些乳酸菌和酵母菌難以降解的雜粕和膠質(zhì)蛋白。但是生產(chǎn)設(shè)備復(fù)雜，物料溫度和濕度變化很大，控制及其困難。成品主要是作為飼料蛋白原料的替代物，能降低飼料生產(chǎn)成本，但基本不具備生物學(xué)活性和功能。本節(jié)主要論述厭氧固態(tài)發(fā)酵工藝，常規(guī)的發(fā)酵飼料生產(chǎn)流程如：原料→消毒→冷卻接種→培養(yǎng)→干燥→包裝工業(yè)化規(guī)模的微生物發(fā)酵過程基本上都是純培養(yǎng)過程，原料需要消毒，空氣需要過濾等。這些操作都是為了確保在發(fā)酵產(chǎn)品生產(chǎn)和儲(chǔ)存過程中不受雜菌的侵襲和干擾，但也正是這些常規(guī)操作使產(chǎn)品的生產(chǎn)成本居高不下，影響了微生物發(fā)酵產(chǎn)品在動(dòng)物飼養(yǎng)中的大劑量使用。大量試驗(yàn)證明，在不考慮動(dòng)物飼養(yǎng)成本的前提下，大劑量（在配合飼料中添加5.0%以上）使用高活菌含量的微生物發(fā)酵飼料可以明顯改善動(dòng)物的生產(chǎn)性能，提高動(dòng)物的健康水平，甚至可以進(jìn)行無抗生素飼養(yǎng)。但是采用傳統(tǒng)的生產(chǎn)工藝獲得的高活菌產(chǎn)品其生產(chǎn)成本通常都在10元/kg以上，如果以10%的比例使用在配合飼料中，每噸配合飼料的成本至少需要增加800元，這個(gè)增加值對(duì)傳統(tǒng)的畜禽養(yǎng)殖業(yè)來說是難以接受的。降低發(fā)酵飼料生產(chǎn)成本最直接的方式就是簡(jiǎn)化生產(chǎn)工藝，其中原料的蒸煮、消毒和干燥是最耗能的操作過程，是導(dǎo)致生產(chǎn)成本增加的主要步驟，也是導(dǎo)致生產(chǎn)設(shè)備投資增加的主要原因。如能簡(jiǎn)化生產(chǎn)操作工藝步驟，同時(shí)又能保證產(chǎn)品質(zhì)量的安全穩(wěn)定，就能使發(fā)酵飼料的生產(chǎn)和應(yīng)用具備強(qiáng)大的市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力。發(fā)酵飼料的生產(chǎn)菌種發(fā)酵飼料的生產(chǎn)菌種很多，主要有：乳酸菌、芽孢桿菌、酵母菌和霉菌。乳酸菌目前生產(chǎn)中使用的乳酸菌至少有30多種。按乳酸菌的代謝途徑，大致可歸納為四種類型：同型乳酸發(fā)酵、專性異型乳酸發(fā)酵、兼性乳酸發(fā)酵和雙歧桿菌異型乳酸發(fā)酵。同型乳酸發(fā)酵C6H12O6——→2CH3CH(OH)COOH一分子葡萄糖分解成兩分子乳酸，整個(gè)過程不產(chǎn)氣，發(fā)酵轉(zhuǎn)化理想，產(chǎn)物最合適，效率最高。典型的生產(chǎn)菌種主要有：德氏乳酸桿菌、嗜酸乳桿菌、唾液乳桿菌、嗜熱乳桿菌、糞腸球菌、乳酸乳球菌。專性異型乳酸發(fā)酵C6H12O6——→CH3CH(OH)COOH+CH3COOH+CO2↑一分子葡萄糖轉(zhuǎn)化成一分子乳酸和一分子乙酸，另外還釋放一分子二氧化碳。相比同型乳酸發(fā)酵，這種發(fā)酵的轉(zhuǎn)化效率要低得多，而且還有產(chǎn)氣損失。典型的生產(chǎn)菌種主要有:發(fā)酵乳桿菌、高加索酸奶桿菌、短乳桿菌、巴氏乳桿菌。兼性乳酸發(fā)酵兼性乳酸發(fā)酵能同時(shí)進(jìn)行同型乳酸發(fā)酵和異型乳酸發(fā)酵，這兩種代謝進(jìn)行的程度和比例取決于菌種的性質(zhì)和外界培養(yǎng)條件。典型的生產(chǎn)菌種有：植物乳桿菌、干酪乳桿菌、鼠李糖桿菌、清酒乳桿菌。雙歧桿菌異型乳酸發(fā)酵2C6H12O6——→2CH3CH(OH)COOH+3CH3COOH比較典型的生產(chǎn)用菌種是動(dòng)物雙歧桿菌。雙歧桿菌的培養(yǎng)要求很嚴(yán)格，對(duì)厭氧要求極高，目前還很難在實(shí)際生產(chǎn)中應(yīng)用。乳酸菌分布廣、種類多，有桿狀和球形兩大類。有單個(gè)、成對(duì)和鏈狀排列的，基本上都是厭氧菌或微需氧菌。在飼料青儲(chǔ)、發(fā)酵開始時(shí)就繁殖，到飼料因密封缺氧后仍然能繁殖，只是增殖的速度慢一些，而乳酸的生成速度卻快一些。乳酸菌能分解飼料原料中的糖，形成乳酸。乳酸能提高飼料的營養(yǎng)價(jià)值和適口性，同時(shí)還能抑制大腸桿菌和沙門氏菌等有害微生物的生長代謝，使飼料產(chǎn)品能長期保存。在飼料青儲(chǔ)和發(fā)酵的過程中，同型和異型乳酸發(fā)酵同時(shí)存在，產(chǎn)物除乳酸外還有少量乙醇和CO2。芽孢菌目前在生產(chǎn)中應(yīng)用的芽孢菌有近十種，以桿菌為主，主要為以下三種：地衣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌和蠟樣芽孢桿菌。芽孢桿菌能耐受高溫，在有氧和無氧條件下都能存活。在營養(yǎng)缺乏、干旱等條件下形成芽孢，在條件適應(yīng)時(shí)又可以重新萌發(fā)成營養(yǎng)體。利用芽孢桿菌發(fā)酵飼料的目的主要是為了消耗培養(yǎng)體系中殘留的氧氣，為乳酸菌創(chuàng)造一個(gè)厭氧環(huán)境。另外，近年來研究還發(fā)現(xiàn)，有些芽孢桿菌能產(chǎn)生殺滅大腸桿菌和沙門氏菌等有害微生物的細(xì)菌素（也稱抗菌肽），這些抗菌肽有很強(qiáng)的針對(duì)性，只對(duì)某些類型的微生物細(xì)胞有破壞作用，對(duì)酵母菌和乳酸菌沒有影響。酵母菌酵母菌是一類單細(xì)胞真菌，形態(tài)多種多樣，主要有球形、卵形和絲狀形（如假絲酵母），以出芽的無性繁殖為主，最適宜生長溫度為25~35℃，pH偏酸性（4.0~6.0）。酵母菌基本上都是兼性厭氧菌，在有氧的條件下迅速增殖，在無氧的情況下進(jìn)行酒精發(fā)酵（EMP）。目前在生產(chǎn)中應(yīng)用的有20多種，主要為以下三種：釀酒酵母、熱帶假絲酵母、產(chǎn)朊假絲酵母。酵母菌的個(gè)體比乳酸菌大得多，直徑通常為2~6μm，體積幾乎是乳酸菌的1000倍左右。工業(yè)生產(chǎn)中常用的酵母菌主要有釀酒酵母和假絲酵母，釀酒酵母是生產(chǎn)啤酒、白酒等含乙醇類發(fā)酵物的重要菌種；假絲酵母主要用于好氧發(fā)酵生產(chǎn)動(dòng)物飼料或者廢水處理。霉菌目前在生產(chǎn)中應(yīng)用的霉菌有近十種，主要為：米曲霉、黑曲霉、白地霉。一般來說利用霉菌發(fā)酵，基本上都是有氧發(fā)酵，發(fā)酵過程會(huì)產(chǎn)生大量的代謝熱，生產(chǎn)過程中料曲的溫度控制往往是生產(chǎn)成敗的關(guān)鍵。霉菌發(fā)酵目前采用淺盤發(fā)酵，料曲厚度不超過5cm。如果采用厚層發(fā)酵，需采用強(qiáng)通風(fēng)裝置，生產(chǎn)能耗很大，從這一點(diǎn)上說，霉菌發(fā)酵不適于生產(chǎn)飼料或者飼料原料。目前，實(shí)際生產(chǎn)中利用霉菌主要是利用它能合成纖維素酶、半纖維素酶和蛋白酶的特性，利用廉價(jià)的粗蛋白原料作為發(fā)酵底物，生產(chǎn)高活性的蛋白飼料或者粗酶制劑。選用生產(chǎn)菌種的基本原則安全性（必須同時(shí)符合以下兩個(gè)要求）菌體本身不產(chǎn)生有毒有害物質(zhì)。不會(huì)危害環(huán)境固有的生態(tài)平衡（主要針對(duì)某些基因工程菌）。（二）有效性（能滿足一個(gè)要求即可）菌種本身具有很好的生長代謝活力，能有效降解大分子好抗?fàn)I養(yǎng)因子，合成小肽和有機(jī)酸等小分子物質(zhì)。能保護(hù)和加強(qiáng)動(dòng)物微生物區(qū)系的正平衡。這種功效主要是指能有效維護(hù)和提高有益微生物在動(dòng)物消化道中的數(shù)量?jī)?yōu)勢(shì)，其可通過兩種方式達(dá)到：一種方式是利用發(fā)酵飼料的生產(chǎn)菌種本身就是從飼養(yǎng)的目標(biāo)動(dòng)物的消化道中分離出來的有益菌，通過飼喂高比例的發(fā)酵飼料直接提高有益微生物的數(shù)量，形成數(shù)量?jī)?yōu)勢(shì)；另一種方式是利用生產(chǎn)菌種或代謝產(chǎn)物可以選擇性地抑制或者殺滅有害微生物，形成有益菌的數(shù)量?jī)?yōu)勢(shì)。實(shí)現(xiàn)第二種途徑的方式可以多種多樣，比較常用的有：耗盡氧氣，降低體系的氧化還原電位；降低環(huán)境的pH值；代謝物中含有能選擇性殺滅大腸桿菌和沙門氏菌等有害微生物的抗菌物質(zhì)等。發(fā)酵飼料生產(chǎn)菌種之間的相互關(guān)系目前人類可利用的這些發(fā)酵技術(shù)基本上都是純培養(yǎng)技術(shù)，而實(shí)際上在自然界中很難找出單一微生物存在的生態(tài)環(huán)境。據(jù)已有的微生物研究報(bào)道，地球上存在的微生物超過100萬種，而人類所分離的純種累計(jì)不超過10萬種，做過比較系統(tǒng)研究的不超過1萬種。根據(jù)目前已有的研究成果，大體可以把微生物之間的關(guān)系分為以下幾種：中性共生、同住、互惠共生、共生、競(jìng)爭(zhēng)、拮抗和寄生。中性共生這是指兩種或兩種以上的微生物同時(shí)存在于同一個(gè)環(huán)境中，但是它們之間沒有直接的生態(tài)關(guān)系，各自生活互不干擾。例如淡水中生長的衣藻和水生細(xì)菌。同住這是指兩種微生物同處在一個(gè)棲所內(nèi)，其中一個(gè)獲益，另一個(gè)不受影響。常見的現(xiàn)象是一種微生物產(chǎn)生一種代謝物供另一種微生物作為營養(yǎng)物質(zhì)，或者產(chǎn)生適合于另外一種微生物生長的環(huán)境。發(fā)酵飼料生產(chǎn)中比較常見的例子有以下幾種：酵母菌能在高濃度的糖液（25%左右）中生長。當(dāng)糖被酵母菌消耗以后，糖濃度的降低就有利于不耐受高滲透壓的微生物（如乳酸菌）的生長。能分泌淀粉酶的微生物（芽孢菌）水解淀粉產(chǎn)生寡糖和單糖，為另外一些只能利用還原性單糖的微生物生長提供營養(yǎng)。還有一種比較特殊的同住微生物，好氣性菌可消耗氧氣，降低環(huán)境的氧化還原電位，使之適合于厭氧微生物的生長。這種同住關(guān)系只能產(chǎn)生在開始階段，在后期就不是同住關(guān)系了。這種現(xiàn)象在發(fā)酵飼料到生產(chǎn)過程中經(jīng)常遇到，也是利用微生物組合發(fā)酵生產(chǎn)發(fā)酵飼料的重要理論基礎(chǔ)?；セ莨采@是兩種微生物互惠互利的現(xiàn)象，比較典型的菌種是阿拉伯糖乳桿菌和糞鏈球菌的組合。阿拉伯糖乳桿菌不能合成苯丙氨酸，糞鏈球菌不能合成葉酸。阿拉伯糖乳桿菌不能在缺少苯丙氨酸的培養(yǎng)基上生長，糞鏈球菌也不能在沒有葉酸的培養(yǎng)基上生長。但是把它們組合在一起，卻可以共同在沒有苯丙氨酸也沒有葉酸的培養(yǎng)基上生長，因?yàn)樗鼈兡芟嗷閷?duì)方提供必需的限制性營養(yǎng)物質(zhì)。這種現(xiàn)象在自然界中普遍存在，發(fā)酵飼料的菌種組合應(yīng)該多考慮這種組合優(yōu)勢(shì)。共生共生是指兩種微生物在同一個(gè)嚴(yán)酷環(huán)境中彼此相依為命。比較典型的例子是地衣，它是藍(lán)細(xì)菌（或藍(lán)藻）與真菌共同組成的一個(gè)形態(tài)和生理單位。藍(lán)藻或藍(lán)細(xì)菌的細(xì)胞僅限于特定的層內(nèi)，地衣內(nèi)的菌絲交織成菌絲組織，形成一個(gè)稠密的外皮層。皮層下為藍(lán)藻的細(xì)胞層，在下面為菌絲疏松交織的菌髓層。真菌可以從藍(lán)藻獲得碳水化合物，真菌菌絲所攝取的水和無機(jī)鹽又可以提供給藍(lán)藻，因此地衣能耐干旱、潮濕和抗寒冷。這種現(xiàn)象在發(fā)酵飼料的生產(chǎn)過程中很難遇到，少有實(shí)用的例子。競(jìng)爭(zhēng)當(dāng)兩種微生物對(duì)某種環(huán)境因子有相同要求時(shí)，就會(huì)發(fā)生生存競(jìng)爭(zhēng)。由于微生物的世代時(shí)間比較短，代謝強(qiáng)度大，所以生存競(jìng)爭(zhēng)往往表現(xiàn)的很激烈。在一個(gè)生存環(huán)境內(nèi)，不同的時(shí)間會(huì)出現(xiàn)不同的優(yōu)勢(shì)種。這種優(yōu)勢(shì)微生物在某種環(huán)境下能最有效地適應(yīng)當(dāng)時(shí)的環(huán)境，而環(huán)境條件一旦改變，就可能被另一種微生物代替并發(fā)育成新的優(yōu)勢(shì)種。目前工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)之所以采用純種培養(yǎng)，其主要原因就是消除其他微生物的競(jìng)爭(zhēng)。目標(biāo)代謝物合成能力強(qiáng)的微生物其生長速度往往比較低，至少比同類的野生菌低。野生菌的代謝活動(dòng)是很“經(jīng)濟(jì)的”。如果從生長速度分析，它們的物質(zhì)和能量的利用效率要遠(yuǎn)高于生產(chǎn)菌種。但是，由于生產(chǎn)成本的限制，發(fā)酵飼料的生產(chǎn)往往不能采用純種培養(yǎng)，所以微生物之間的生存競(jìng)爭(zhēng)不可避免。如何巧妙利用微生物之間的生存競(jìng)爭(zhēng)是研究微生物發(fā)酵飼料生產(chǎn)的一個(gè)非常重要的課題。從理論上分析，通過控制調(diào)節(jié)微生物生存環(huán)境可以調(diào)整物料中微生物的種類和數(shù)量分布，從而達(dá)到利用微生物有益菌群種群優(yōu)勢(shì)發(fā)酵飼料的目的，但是到目前為止，有關(guān)方面的成熟技術(shù)還是很少。六、拮抗一種微生物可以產(chǎn)生不利于另一種微生物生存的代謝物質(zhì)，或者通過代謝活動(dòng)改變生存環(huán)境，而這種環(huán)境不利于其他周圍微生物的生長，這種現(xiàn)象就稱為“拮抗”。如：青貯飼料接種的乳酸菌和醋酸菌在發(fā)酵過程中，不斷降低pH值，結(jié)果絕大多數(shù)不耐酸的微生物不能生存，甚至趨向死亡。酵母菌在無氧條件下將糖發(fā)酵成酒精，當(dāng)酒精濃度達(dá)到一定數(shù)值時(shí)，其他微生物就不能生存。研究發(fā)現(xiàn)拮抗還具有明顯選擇性，農(nóng)業(yè)部飼料工業(yè)中心分離獲得的枯草芽孢桿菌MA139能分泌殺滅大腸桿菌、沙門氏菌和金黃色葡萄球菌的抗菌肽（細(xì)菌素），但對(duì)自身、酵母菌和乳酸菌的生長代謝基本沒有影響，這種拮抗的選擇性是發(fā)酵飼料研究所希望的。七、寄生一種微生物生活在另一種微生物體內(nèi)或體外，依靠攝取寄生細(xì)胞的營養(yǎng)進(jìn)行生長繁殖，并使后者遭受損害甚至死亡，這種現(xiàn)象稱之為寄生。這種現(xiàn)象在飼料發(fā)酵過程中可能存在，目前在研究中還沒有遇到。微生物是發(fā)酵飼料的動(dòng)力來源，研究發(fā)酵飼料中微生物的相互關(guān)系是獲得高質(zhì)量發(fā)酵飼料的必要前提，也是飼料發(fā)酵生產(chǎn)的核心。第四節(jié)發(fā)酵飼料的生產(chǎn)工藝固態(tài)厭氧發(fā)酵高活性生物飼料相對(duì)于好氧發(fā)酵，厭氧發(fā)酵的能耗低，微生物代謝產(chǎn)生的熱量也要小得多，生產(chǎn)過程往往不需要翻拌散熱。另外，發(fā)酵產(chǎn)品只要密封得當(dāng)，即使長期存放也不會(huì)腐敗變質(zhì)。目前比較典型的固態(tài)厭氧發(fā)酵生物飼料的成功例子主要有兩種：一種是適合養(yǎng)殖戶自產(chǎn)自用的袋裝發(fā)酵飼料；另一種是屬于規(guī)?；魉€生產(chǎn)的袋裝發(fā)酵飼料。它們接種的微生物基本一致，主要有酵母菌、乳酸菌和芽孢桿菌。適合養(yǎng)殖戶自產(chǎn)自用的發(fā)酵袋是一種普通的密封包裝袋，物料接種以后裝袋，再將袋口用繩扎緊，物料的含水量為30%~40%。開始時(shí)，酵母菌消耗袋內(nèi)殘留的氧氣進(jìn)行增殖和呼吸代謝，同時(shí)也為乳酸菌創(chuàng)造一個(gè)厭氧的生活環(huán)境。然后，酵母菌在無氧條件下進(jìn)行糖酵解，產(chǎn)生酒精和CO2，乳酸菌也同時(shí)增殖、代謝，產(chǎn)生有機(jī)酸。隨著袋內(nèi)氣壓的不斷增加，不斷有CO2帶著酒精和有機(jī)酸排出袋外，管理飼料的飼養(yǎng)員可以根據(jù)排出的酸香味來判定物料發(fā)酵的成熟度。有氧發(fā)酵階段：C6H12O6+6O2——→6CO2+6H2O無氧發(fā)酵階段：C6H12O6——→2CO2+2C2H5OH(乙醇)在夏季，發(fā)酵3~5d就有明顯的酸香味。在冬季，時(shí)間需要延長。如果環(huán)境溫度低于12℃事實(shí)證明，如果環(huán)境溫度適宜，時(shí)間控制得當(dāng)，采用上述袋裝式土辦法發(fā)酵，也可以獲得質(zhì)量很好的微生物發(fā)酵飼料，活性乳酸菌的含量能達(dá)到108cuf/g以上。將其在生羊配合飼料中添加15%~20%，生羊采食量能明顯提高，最多能提高10%以上，而且增重速度和健康水平也有顯著提高。這種工藝雖然簡(jiǎn)單，但是受限制的因素很多，質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)也很難把握，實(shí)際推廣有一定困難。為了使這種袋裝發(fā)酵技術(shù)進(jìn)入程序化、工業(yè)化應(yīng)用，發(fā)酵飼料的質(zhì)量能得到有效保證，必須完成以下幾個(gè)前提：發(fā)酵過程不受環(huán)境溫度限制；產(chǎn)品質(zhì)量不受存放時(shí)間限制，或者保質(zhì)期能達(dá)到三個(gè)月以上；產(chǎn)品在儲(chǔ)存和運(yùn)輸過程中不受外界空氣干擾。農(nóng)業(yè)部飼料工業(yè)中心的微生物發(fā)酵飼料課題組發(fā)明了呼吸膜可移動(dòng)式固態(tài)厭氧發(fā)酵飼料（也稱袋裝發(fā)酵飼料）生產(chǎn)技術(shù)。這種發(fā)酵技術(shù)的具體工藝流程如圖1-1。發(fā)酵原料發(fā)酵原料粉碎機(jī)過渡倉電子秤攪拌機(jī)菌種液計(jì)量和包裝機(jī)成品原料接種以后直接進(jìn)入包裝袋中，包裝袋上附加一個(gè)可以調(diào)節(jié)氣壓的硅膠膜。在發(fā)酵過程中，微生物會(huì)產(chǎn)生CO2等氣體，使得袋內(nèi)的氣壓大于外界常壓。當(dāng)袋內(nèi)氣壓達(dá)到某一臨界值時(shí)，氣體通過硅膠膜排到外界。但是外界的氣體始終沒有機(jī)會(huì)進(jìn)入發(fā)酵體系，從而也就排除了外界雜菌的干擾。研制的特定微生物菌種組合能使乳酸菌迅速繁殖，占據(jù)數(shù)量?jī)?yōu)勢(shì)，原料不需要消毒就可以直接用于接種培養(yǎng)。這種工藝很簡(jiǎn)單，如果以日產(chǎn)30t計(jì)算，設(shè)備投資不超過40萬元，特別適合在我國廣大農(nóng)村推廣使用。發(fā)酵飼料生產(chǎn)技術(shù)發(fā)酵飼料用乳酸菌的分離篩選乳酸菌是一類最常見的益生菌，生物飼料的發(fā)酵生產(chǎn)一般都離不開乳酸菌。乳酸菌種類很多，市場(chǎng)上流行的產(chǎn)品也極多，至少有20多種。大量實(shí)驗(yàn)證明，只有動(dòng)物消化道國有的微生物才能在消化道內(nèi)定植，外源微生物只能短時(shí)間存活在消化道內(nèi)，不可能長期融合到動(dòng)物消化道的微生態(tài)系統(tǒng)中。篩選發(fā)酵飼料的生產(chǎn)菌種，其主體應(yīng)該來源于最終適用的動(dòng)物消化道，而乳酸菌細(xì)菌是動(dòng)物消化道內(nèi)起主要作用的微生物。樣品的采集為了獲得合適的生產(chǎn)用乳酸菌，樣品的采集很重要。適合于實(shí)際生產(chǎn)的乳酸菌必須來源于健康動(dòng)物的消化道，最好是在發(fā)生了瘟疫的養(yǎng)殖場(chǎng)而幸存的畜禽。發(fā)生瘟疫的養(yǎng)殖場(chǎng)，動(dòng)物大比例死亡，幸存的畜禽雖少，但是生命力很頑強(qiáng)，是極好的生產(chǎn)菌種采集樣本。以下以篩選符合生羊健康養(yǎng)殖需要的生物飼料用乳酸菌為例，敘述樣品的采集和乳酸菌的分離。在實(shí)驗(yàn)室中對(duì)生羊進(jìn)行攻毒試驗(yàn)，在飼料中不斷加大大腸桿菌（實(shí)驗(yàn)用E.ColiK88,這是一種常見的攻毒試驗(yàn)用大腸桿菌）的用量，以檢驗(yàn)生羊的抵抗力。經(jīng)過5~7d的試驗(yàn)，生羊的健康水平越來越差。我們選擇其中兩頭最健康的生羊進(jìn)行屠宰，在無菌環(huán)境中提取它的胃液、小腸液和大腸液，迅速保存在無菌生理鹽水（NaCl的濃度為0.9%）中。目標(biāo)乳酸菌一般都是厭氧菌，為了確保乳酸菌的活力，需要盡可能降低生理鹽水的氧化還原電位。最簡(jiǎn)便的方法是在溶液中加入適量的半胱氨酸，半胱氨酸有巰基（—SH），有很好的還原力，可以消除溶液中殘余的氧。乳酸菌的分離純化樣品中的目標(biāo)乳酸菌含量一般都不是很高，而且還污染了其他雜菌。為了提高篩選成功的幾率，在樣品進(jìn)行分離純化以前，可以對(duì)樣品進(jìn)行選擇性增殖培養(yǎng)，以增加目標(biāo)乳酸菌的含量。樣品的增殖培養(yǎng)比較簡(jiǎn)單，把經(jīng)過適當(dāng)處理的樣品接種到適于目標(biāo)乳酸菌生長的培養(yǎng)基中。比較常用的是牛奶增殖培養(yǎng)液，在無抗生素牛奶中補(bǔ)充6%~8%的蔗糖，高溫消毒、冷卻，然后用氮?dú)饣蛘叨趸简?qū)除溶液中殘留的空氣，再接入適量采集的樣品，在30~32℃樣品經(jīng)過預(yù)增殖培養(yǎng)以后，目標(biāo)乳酸菌含量明顯提高，可以進(jìn)入下一步分離純化操作。乳酸菌分離培養(yǎng)基通常采用MRS瓊脂培養(yǎng)基，其營養(yǎng)組成與pH如下：蛋白胨：5.0g/L；牛肉浸膏：4.0g/L；酵母膏：2.0g/L；葡萄糖：12.0g/L；玉米漿：10.0mL;司盤80：1ml;磷酸氫二鉀：1.0g/L；三水乙酸鈉：3.0g/L；檸檬酸三銨：1.0g/L；硫酸鎂：0.1g/L；硫酸錳：0.03g/L；瓊脂：18.0g/L。pH6.2±0.2。加熱溶解上述各組分，配制成均勻的溶液，分裝在厭氧滾管中（每個(gè)管中加5~6mL）。在115℃消毒殺菌30min。冷卻至50為了指示培養(yǎng)基的氧化還原電位，可以在培養(yǎng)基中加入極少量的刃天青（一種顯色劑），濃度0.02%就足夠了。在低電位時(shí)培養(yǎng)基顯藍(lán)色，隨氧化還原電位不斷上升，培養(yǎng)基的顏色逐步由藍(lán)轉(zhuǎn)為淺藍(lán)、粉紅、紅色。如果培養(yǎng)基的顏色轉(zhuǎn)成粉紅就基本不合格了。同增殖培養(yǎng)過程一樣，在MRS分離培養(yǎng)基中加入適量的半胱氨酸可以在一定時(shí)間內(nèi)維持環(huán)境的低電位。分離純化培養(yǎng)基準(zhǔn)備好以后，就可以進(jìn)行目標(biāo)乳酸菌的分離操作了。在超凈工作臺(tái)上（或者其他無菌環(huán)境中），對(duì)經(jīng)過增殖培養(yǎng)的樣品進(jìn)行梯度稀釋，稀釋液還是用無菌的生理鹽水，把稀釋后的樣品接種到厭氧滾管中，密封（滾管有密封蓋）。在30~32℃為了提高篩選幾率，可以同時(shí)做多個(gè)稀釋梯度樣品的培養(yǎng)。如果兩天以后不出現(xiàn)理想的菌落，可以再延長培養(yǎng)時(shí)間。雖然乳酸菌的最適宜生長溫度是37~40℃，但是經(jīng)過上述分離操作，我們獲得了5株乳酸菌，它們分別是：1.來源于羊胃的格氏乳桿菌（Lactobacillusgasseri）;2.來源于十二指腸的羅伊氏乳桿菌（Lactobacillusreuteri）;3.來源于小腸的屎腸球菌（Enterococcusfaecium）;4.來源于空腸的嗜酸乳桿菌（Lactobacillusacidophilus）;5.來源于結(jié)腸的發(fā)酵乳桿菌（Lactobacillusfermentium）。三、發(fā)酵力和耐酸穩(wěn)定性分析為了后續(xù)生產(chǎn)應(yīng)用的需要，我們對(duì)分離獲得的乳酸菌進(jìn)行發(fā)酵力測(cè)定和耐酸穩(wěn)定性試驗(yàn)。發(fā)酵力測(cè)定比較簡(jiǎn)單，主要測(cè)定其乳酸菌的產(chǎn)量，具體方法如下：接種分離獲得的細(xì)菌純種于試管培養(yǎng)液中，30~32℃恒溫培養(yǎng)12h，然后再擴(kuò)大接種到牛奶瓶中，30~32在乳酸發(fā)酵的過程中乳酸通常以乳酸鈣的形式存在，通過去除發(fā)酵液中的葡萄糖和蛋白質(zhì)，并加入適當(dāng)濃度硫酸酸化，鈣離子轉(zhuǎn)化成難溶的硫酸鈣沉淀，使溶解度不高的乳酸鈣全部轉(zhuǎn)變?yōu)槿樗?。乳酸在銅離子的催化下，與濃硫酸作用生成乙醛，乙醛能與對(duì)羥基聯(lián)苯作用生成在565nm處有特征吸收的紫色物質(zhì)。在一定濃度范圍內(nèi)，乳酸含量與565nm處波長吸光度呈線性關(guān)系，因此，可以通過測(cè)定565nm處的吸光度來測(cè)定乳酸的含量。實(shí)驗(yàn)室乳酸含量的測(cè)定一、原理稀乳酸在 濃硫酸作用下加熱，可以變成乙醛。乙醛與羥基聯(lián)苯作用可以生成紅色的復(fù)合物，在565nm條件下比色測(cè)定，可以確定乳酸含量。二、試劑1.4.0%硫酸銅溶液將4g無水硫酸銅溶解在水溶液中，定容至100ml。2.羥基聯(lián)苯（C6H5·C6H4OH）溶液將1g羥基聯(lián)苯溶解于100ml濃度為0.08mol/L的NaOH溶液中，儲(chǔ)存在褐色試劑瓶中。3.乳酸標(biāo)準(zhǔn)液將280mg純?nèi)樗徜嚾苡谒?，配?50mL溶液，其乳酸濃度為1mg/mL，存放于4℃冰箱中。在做標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)將溶液稀釋10倍，使乳酸含量為100μg/mL。在分別取1，2，3，4，5，6mL稀釋液，稀釋配制成1，2，3，4，5，6μg/mL乳酸標(biāo)準(zhǔn)液4.濃硫酸溶液在比色管中分別加入1mL乳酸標(biāo)準(zhǔn)液和0.05mL硫酸銅溶液，然后加入6mL濃硫酸，放置5min，冷卻至20℃三、標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備和乳酸含量的測(cè)定在上述比色管中加入0.05mL羥基聯(lián)苯溶液，混合均勻，在室溫下放置6~8h，過夜。在565nm波長下進(jìn)行比色測(cè)定，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。（1）最大吸收波長的確定乳酸發(fā)酵液樣品顯色后，表明，最大吸收波長為565nm。圖2-1最大吸收波長的確定（2）最佳顯色條件的選擇結(jié)果表明，氫氧化鈣和濃硫酸的加入量對(duì)顯色反應(yīng)影響顯著，其余因素的作用不顯著，最佳顯色條件為A2B3C2D1E1F3，即氫氧化鈣0.05g（3）乳酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備乳酸標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液濃度在10~80μg/ml范圍內(nèi)與吸光度值基本呈線性關(guān)系，當(dāng)濃度大于等于60μg/ml時(shí)吸光度值大于1，考慮到儀器誤差的因素，故制備標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)濃度范圍取在15、20、25、30、35、40、45、50μg/ml，得到如圖的乳酸標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為A=0.0189C－0.0808(A為吸光度值，C為乳酸濃度，n=8)，r=0.9989，在15~50μg/ml范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系。（圖2-2：乳酸標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液濃度與吸光度值之間的關(guān)系）（圖2-3：乳酸標(biāo)準(zhǔn)曲線）本實(shí)驗(yàn)對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行預(yù)處理，排除蛋白質(zhì)和葡萄糖的干擾，使測(cè)定結(jié)果更接近真實(shí)值；優(yōu)化了顯色條件，使測(cè)定時(shí)操作簡(jiǎn)便，精確度高，顯色穩(wěn)定，準(zhǔn)確度高，適合于發(fā)酵液中乳酸含量的測(cè)定。耐酸穩(wěn)定性分析主要是考慮乳酸菌在實(shí)際使用過程中過動(dòng)物胃酸的成活問題。生長育肥羊的胃酸pH比較低，一般的微生物很難在其中存活，這種功能實(shí)際上也利于生羊的健康，使它可以在衛(wèi)生條件比較差的環(huán)境中生存。但是這種特性不利于外源有益微生物的存活，外源有益菌必須先通過胃液的考驗(yàn)才能達(dá)到其發(fā)揮作用的場(chǎng)所（腸道）。所以耐胃酸穩(wěn)定性也是決定乳酸菌實(shí)際使用效果的一個(gè)重要指標(biāo)，具體檢驗(yàn)方法如下：取1.0mL活菌數(shù)量已知的培養(yǎng)液，在無菌條件下，接種到生長羊、牛的胃液中，在37℃在生長羊胃液中，上述5株菌都體現(xiàn)了很好的穩(wěn)定性，其存活率都在50%以上（見表2-4）表3-4各種乳酸細(xì)菌在生長羊胃液中的穩(wěn)定性時(shí)間/h123456格氏乳桿菌存活率/%88.282.691.495.8112136羅伊氏乳桿菌存活率/%88.481.371.466.957.246.8屎腸球菌存活率/%86.562.176.371.264.855.6嗜酸乳桿菌存活率/%91.288.684.276.871.364.2發(fā)酵乳桿菌存活率/%94.692.891.488.586.384.6本組試驗(yàn)均是在羊消化道中分離獲得的乳酸菌都是天然菌，沒有經(jīng)過基因工程改造，屬于安全菌株。遺傳性能穩(wěn)定，不會(huì)隨著傳代而發(fā)生變異，安全無毒?？梢源罅繎?yīng)用在牛、羊等飼料中。另有研究提出在模擬的胃酸中（pH值與真實(shí)胃液胃酸相同）進(jìn)行穩(wěn)定性試驗(yàn)，其結(jié)果不能代表乳酸菌在真正胃液胃酸中的穩(wěn)定性，其原因是真實(shí)胃液中蛋白酶對(duì)外來生物活性物質(zhì)具有極強(qiáng)的分解作用，破壞了相當(dāng)部分外來多酶蛋白和一些細(xì)菌素的活性。這是自然界一種自我保護(hù)的功能。第二節(jié)發(fā)酵飼料用芽孢桿菌的分離篩選和安全性評(píng)價(jià)芽孢桿菌也是一類比較常見的發(fā)酵飼料生產(chǎn)菌，但是這類菌的應(yīng)用效果與菌種來源、飼養(yǎng)環(huán)境和動(dòng)物類型都有很大的關(guān)系。雖然種類很多，但是真正能體現(xiàn)出穩(wěn)定的、優(yōu)良效果的還很少。另外，芽孢桿菌不同于乳酸菌和釀酒酵母（或者啤酒酵母），乳酸菌和酵母菌的安全穩(wěn)定性一般都很可靠（一些耗氧發(fā)酵的絲狀酵母除外），但是芽孢桿菌的安全穩(wěn)定性卻一直是行業(yè)主管部門關(guān)注的重點(diǎn)。芽孢桿菌一般都不是動(dòng)物消化道內(nèi)固有菌，它們發(fā)揮作用的原因至今還沒有統(tǒng)一的定論。但是目前人們對(duì)兩點(diǎn)原因是比較認(rèn)可的：產(chǎn)生能殺滅大腸桿菌和沙門氏菌等有害微生物的抗菌肽類物質(zhì)（或者稱為細(xì)菌素）；消耗環(huán)境中的氧氣，為乳酸菌的生長繁殖創(chuàng)造厭氧環(huán)境。芽孢桿菌的分離篩選主要也是依據(jù)上述兩個(gè)原則。安全性評(píng)價(jià)主要依據(jù)抗生素敏感性以及致毒性，相關(guān)的技術(shù)都比較成熟。一、樣品的采集和初篩與乳酸菌的分離篩選一樣，目標(biāo)芽孢桿菌也是從發(fā)生了瘟疫的動(dòng)物養(yǎng)殖場(chǎng)或者進(jìn)行攻毒試驗(yàn)幸存的動(dòng)物體中篩選。1.樣品的采集與初篩在發(fā)生了大批死亡的養(yǎng)殖場(chǎng)里，我們從土壤和糞便中采集樣品，共需采集24個(gè)樣品，每個(gè)樣品約2g，在無菌條件下分別保存在20mL無菌生理鹽水中，并用冰塊降溫，在12h內(nèi)進(jìn)行后續(xù)的培養(yǎng)分離，具體方法如下：（1）取0.5ml樣品液，加入到5ml的復(fù)合營養(yǎng)肉湯（MNB）中。MNB培養(yǎng)基組成與pH：葡萄糖：5.0g/L;蛋白胨：5.0g/L；牛肉膏：3.0g/L;酵母浸粉：1.0g/L;MgSO4·H2O:0.005g/L。pH:7.0±0.2把上述組分均勻溶解在水溶液中，在120℃（2）從24種樣品中分離得到芽孢桿菌菌株約120株，這些芽孢桿菌均具有革蘭氏陽性、過氧化物酶陽性、產(chǎn)生好氧芽孢的特性，但是僅有6株對(duì)E.coliK88具有強(qiáng)烈的抑制作用，它們都基本具備了芽孢桿菌的特性，將此6株菌株編號(hào)為：MA23、MA139、MA257、MA59、MA633和MA744，并將這6株作為后續(xù)復(fù)篩的備選菌種。二、菌種的復(fù)篩在芽孢桿菌的復(fù)篩過程中，設(shè)計(jì)了待篩菌與4種指示菌同步混合培養(yǎng)的方法，這種設(shè)計(jì)的目的：①創(chuàng)造豐富的營養(yǎng)條件便于候選菌株的富集生長；②采用指示菌混合培養(yǎng)，給候選的芽孢桿菌營造一個(gè)競(jìng)爭(zhēng)的環(huán)境，有利于產(chǎn)生高抗菌活性的芽孢桿菌，并能在有限的環(huán)境中為爭(zhēng)奪營養(yǎng)條件，拮抗其他細(xì)菌而存活下來。同時(shí)在不同的試管中分別接種4種指示菌（見表3.5），濃度約為106cfu/mL。表2-54種指示菌及其來源指示菌學(xué)名來源金黃色葡萄球菌鼠傷寒沙門氏菌大腸桿菌K88大腸桿菌K99StaphylococcusIVDCC56005SalmonellatyphimuriumIVDCC79-13EsherichiacoliIVDCC83901EsherichiacoliIVDCC83529中國獸醫(yī)微生物菌種保藏中心中國獸醫(yī)微生物菌種保藏中心中國獸醫(yī)微生物菌種保藏中心中國獸醫(yī)微生物菌種保藏中心在上述4個(gè)指示菌中，大腸桿菌K88的抵抗力最強(qiáng)，金黃色葡萄球菌抵抗力最弱。制備指示菌懸液時(shí)，用接種針從斜面上挑取少量的指示菌，分別接種到營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基（MNB）中，37℃培養(yǎng)18~24h，保證菌懸液的濃度為108接種菌液后，在37℃混合震蕩培養(yǎng)48h，培養(yǎng)液然后置于70℃的水浴中保溫30min，殺死營養(yǎng)細(xì)胞。存活的芽孢經(jīng)過10倍稀釋，取一定的稀釋液涂布于MNA固體培養(yǎng)基（在MNB培養(yǎng)液中加入1.8%左右的瓊脂）平皿表面，使之形成單菌落。根據(jù)菌落形態(tài)的差異，挑起產(chǎn)芽孢的、革蘭氏陽性的單菌落，接種到試管斜面中，編號(hào)后保存在然后在采用平板擴(kuò)散的方法，將分離出來的芽孢桿菌用滅菌牙簽蘸取少許分別點(diǎn)種到倒好的MNA平板中（平板在使用前置于37℃下培養(yǎng)24h，除去部分水份以便于抗菌物質(zhì)在培養(yǎng)基中擴(kuò)散），37℃培養(yǎng)24h，然后把平板倒扣于盛一薄層氯仿的培養(yǎng)皿蓋上并熏蒸約40min，以便殺死活細(xì)胞并能讓菌落固定于平板的表面，然后移去培養(yǎng)皿蓋并讓平板里殘余的氯仿?lián)]發(fā)30min（以揮發(fā)徹底）。在平板表面鋪一層剛培養(yǎng)好的指示菌培養(yǎng)液，均勻布滿后傾倒出剩余的菌液，晾干平板，置平板于這6種芽孢桿菌當(dāng)中，MA139對(duì)4株指示菌表現(xiàn)出最強(qiáng)的抗菌能力（見表2-6、圖2-7）。表2-6初分離出6株芽孢桿菌對(duì)4株指示菌的抑菌圈直徑菌株抑菌圈直徑/mmE.coliK88E.coliK99Staph.aureusS.typhimuriumMA2329.8±0.635.6±0.746.8±0.540.6±0.8MA13932.0±1.035.9±0.747.5±0.542.5±0.7MA35728.2±0.435.0±0.645.4±0.840.8±0.7MA55931.3±0.933.6±0.844.4±1.138.3±0.9MA63429.6±0.731.5±1.245.6±0.638.6±1.0MA74431.0±1.033.6±0.645.7±0.838.4±1.1注：表中值為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。圖2-7MA139對(duì)指示菌的抑制作用（A、B、C、D分別代表對(duì)大腸桿菌K88、K99、鼠傷寒沙門氏菌和金黃色葡萄球菌的抑制作用）三、芽孢桿菌的抗逆性試驗(yàn)與乳酸細(xì)菌的耐受性試驗(yàn)一樣，芽孢桿菌也需要進(jìn)行類似的檢驗(yàn)。芽孢桿菌必須在胃腸道存活，同時(shí)還必須能夠經(jīng)受住小腸液對(duì)菌體的破壞作用，也就是要求芽孢能夠抵抗小腸液中的膽鹽和胰液素對(duì)它的毒害作用。分別提取生長羊（體重40~60kg）的胃食糜和小腸食糜，分別是用4層無菌醫(yī)用紗布擠壓過濾，取濾液，檢驗(yàn)芽孢桿菌的耐受性。生羊胃液中含有的食糜量對(duì)胃酸的pH有很大影響，食糜量越少，酸度越大。為體現(xiàn)良好的代表性，生羊胃液的樣本數(shù)可以適當(dāng)多一些（通常取10份）混合以后在用紗布擠壓過濾。經(jīng)過篩選出來細(xì)菌MA139，活化兩次后接種于MNB培養(yǎng)基中，37℃下225r/min震蕩培養(yǎng)36h，將培養(yǎng)液置于80℃水浴保溫15min，離心收集芽孢（相對(duì)離心力為2500×g，5min），菌體用磷酸緩沖液（PBS:0.144%Na2HPO4,0.024%KH2PO4從試驗(yàn)的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在胃液中保持3h，活性芽孢的數(shù)量基本沒有下降，證明其對(duì)胃酸的耐受性很好。在小腸液中，起始24h內(nèi)不生長，而24h后開始生長，培養(yǎng)液變得渾濁。在試驗(yàn)的第5天，取樣染色分析，發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)液中有大量芽孢增殖。表明MA139在小腸液中開始受到了一定的抑制，但是隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，能夠適應(yīng)這種環(huán)境。表明MA139的芽孢可以在羊小腸中存活并通過營養(yǎng)體增殖。四、芽孢桿菌的鑒定通過上述的分離篩選，我們獲得了比較有價(jià)值的桿菌MA139，但是這株桿菌還沒有經(jīng)過生理生化鑒定，我們只是從篩選的過程中體現(xiàn)的發(fā)酵特性方面初步認(rèn)為是芽孢桿菌。在投入應(yīng)用前，我們必須做嚴(yán)格的鑒定。形態(tài)學(xué)鑒定首先進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定，觀察其單菌落的形態(tài)，并對(duì)活細(xì)胞進(jìn)行革蘭氏染色及芽孢染色。MA139的細(xì)胞呈直桿狀，芽孢橢圓形近中生，孢囊不膨大。在MNA培養(yǎng)基上培養(yǎng)12h，產(chǎn)生黏液，細(xì)胞形態(tài)為長桿狀；24h后菌落圓形，隆起，表面皺褶，不透明，干燥；培養(yǎng)至36h，菌體均以休眠體芽孢的形式存在，菌落呈白色[圖2-8（1）]。在液體靜止培養(yǎng)時(shí)有菌膜形成。圖2-8生理生化鑒定形態(tài)鑒定結(jié)果（圖2-8）符合芽孢桿菌的特性，接著進(jìn)行生理生化鑒定。生理生化鑒定比較復(fù)雜，涉及的操作步驟很多。參照《常見細(xì)菌細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》中的方法，對(duì)試驗(yàn)菌種進(jìn)行糖醇發(fā)酵試驗(yàn)、需氧性測(cè)定、V-P試驗(yàn)、淀粉水解試驗(yàn)、明膠水解試驗(yàn)、過氧化氫酶試驗(yàn)、檸檬酸鹽利用試驗(yàn)、石蕊牛奶試驗(yàn)等。芽孢桿菌鑒定用培養(yǎng)基如下：糖醇發(fā)酵培養(yǎng)基及葡萄糖產(chǎn)氣試驗(yàn)培養(yǎng)基組成：（NH4）2HPO41.0g/L;MgSo4·7H200.2g/L；酵母浸膏0.2g/L。配好后加入2%的溴百里香蘭指示劑1mL/L，調(diào)節(jié)pH為7.2，分別加入1%的底物（糖醇或者葡萄糖），按照底物類型分裝試管，并將杜蘭管口朝下放入試管，115℃（2）運(yùn)動(dòng)型培養(yǎng)基瓊脂：3g/L;牛肉膏：3.0g/L;氯化鈉：5.0/g；蛋白胨：10g/L。pH7.0~7.2。121℃（3）V-P試驗(yàn)培養(yǎng)基蛋白胨：5.0g/L；K2HPO4:5.0g/L;葡萄糖：5.0g/L。pH7.0±0.2。2mL/支分裝試管，121℃（4）耐鹽性試驗(yàn)培養(yǎng)基營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基分別加入2%、5%、7%、10%的NaCl,pH7.0~7.2。121℃（5）石蕊牛奶試驗(yàn)培養(yǎng)基石蕊乙醇溶液25mL，脫脂牛奶1000mL，4mL/支分裝試管，115℃（6）檸檬酸鹽試驗(yàn)培養(yǎng)基NaCl:5.0g/L；MgSO4·7H20:0.2g/L；（NH4）H2PO4：1.0g/L；K2HPO4：1.0g/L；檸檬酸鈉：5.0g/L溴百里草酚蘭（濃度為4%）。pH6.8±0.2。分裝試管，121℃（7）明膠水解培養(yǎng)基蛋白胨：0.5%；明膠：10%~15%。pH7.0~7.2。分裝試管，115℃（8）淀粉水解試驗(yàn)培養(yǎng)基可溶性淀粉：20g/L；KNO3：1.0g/L；NaCl:0.5g/L；K2HPO4：0.5g/L；MgSO4·7H2O:0.1g/L；瓊脂：2.0g/L。pH7.0~7.2。121℃（9）厭氧生長試驗(yàn)培養(yǎng)基營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，分裝厭氧試管，充氮除氧，121℃生理生化試驗(yàn)結(jié)果見表2-9。表2-9試驗(yàn)菌的生理生化試驗(yàn)結(jié)果項(xiàng)目MA139項(xiàng)目MA139葡萄糖發(fā)酵+葡萄糖產(chǎn)氣-麥芽糖發(fā)酵+運(yùn)動(dòng)性+棉籽糖發(fā)酵+厭氧生長-乳糖發(fā)酵+淀粉水解試驗(yàn)+甘露醇發(fā)酵+H2O2酶試驗(yàn)+2%NaCl+檸檬酸鹽試驗(yàn)+5%NaCl+石蕊牛奶還原+7%NaCl+V-P試驗(yàn)+10%NaCl-明膠液化試驗(yàn)+“+”為反應(yīng)陽性；“-”為反應(yīng)陰性。根據(jù)生理生化的試驗(yàn)結(jié)果，基本可以證明試驗(yàn)菌MA139是芽孢桿菌?；蜩b定：16SrRNA分析為了進(jìn)一步確證生理生化鑒定的可靠性，還可以補(bǔ)充進(jìn)行基因序列分析。16SrRNA分析是目前比較常用的分析手段。采用基因組DNA提純?cè)噭┖刑崛AA139基因組DNA，并以此為模版，選擇細(xì)菌16SrRNA基因特性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物提純回收，測(cè)定16SrRNA序列。目前這種試驗(yàn)在實(shí)驗(yàn)設(shè)備比較完善的生物研究所實(shí)驗(yàn)室都能進(jìn)行。其結(jié)果證實(shí)MA139是枯草芽孢桿菌。五、芽孢桿菌的安全性評(píng)價(jià)確證了芽孢桿菌的特性，接下來需要考慮其安全性問題。益生菌菌種的安全性是研究開發(fā)中必須關(guān)注的問題。這其中包括：①生產(chǎn)菌種必須屬于官方公布允許使用的飼用微生物菌種；②使用的菌種本身必須無毒無害，不會(huì)產(chǎn)生任何毒素；③不存在耐藥性的質(zhì)?；蛘吣退幮曰虿淮嬖谵D(zhuǎn)移的問題。以下還以枯草芽孢桿菌MA139為例，簡(jiǎn)要說明進(jìn)行芽孢桿菌安全性評(píng)價(jià)的方法。安全性試驗(yàn)的靶動(dòng)物一般都選用老鼠，具體可參考如下方法：選擇12只體重基本一致的SD大鼠（Sprague-Dawley,SD）,初始體重在200~220g比較適合，雌雄各半，分為兩個(gè)實(shí)驗(yàn)組，一組用5mL芽孢菌懸液（108cfu/mL）注射到大鼠腹腔中；另一組用5mL生理鹽水注射大鼠作為試驗(yàn)對(duì)照。注射前禁食6h。灌服后觀察其中毒癥狀，看是否出現(xiàn)呼吸困難、抽搐、肢體麻痹等。觀察時(shí)間為1周。灌服MA139的芽孢后，所有大鼠均無明顯臨床癥狀，無一死亡，試驗(yàn)組和對(duì)照組間，沒有明顯差異，證明MA139安全無毒。六、抗生素敏感性試驗(yàn)在實(shí)際生產(chǎn)中，絕大多數(shù)的動(dòng)物飼料都添加了抗生素，動(dòng)物的腸道經(jīng)常處于抗生素壓力之下，這種選擇性壓力更容易促進(jìn)細(xì)菌間耐藥性基因的傳遞和轉(zhuǎn)移。所以在選擇菌種的時(shí)候，對(duì)于哪些攜帶有可轉(zhuǎn)移耐藥性基因的質(zhì)粒的細(xì)菌，從長遠(yuǎn)考慮，在生產(chǎn)實(shí)際中一定不要采用。在抗生素尚未完全被益生素類的綠色添加劑完全取代的時(shí)候，抗生素有時(shí)會(huì)與益生素聯(lián)合添加，因而在菌株篩選的時(shí)候，會(huì)人為地篩選出對(duì)抗生素具有抗性的微生物應(yīng)用于實(shí)際，這種短期行為也加大了耐藥性細(xì)菌擴(kuò)散和轉(zhuǎn)移的可能。所以，為了確保芽孢桿菌的使用效果，需要對(duì)抗生素的敏感性進(jìn)行檢驗(yàn)。研究結(jié)果顯示（表2-10，圖2-11），MA139對(duì)試驗(yàn)的十種抗生素的敏感性不一樣，對(duì)桿菌肽鋅不敏感，對(duì)其它的抗生素都有一定的敏感性，對(duì)桿菌肽鋅的耐藥性可能與產(chǎn)生桿菌肽的細(xì)菌具有一定的同源性。圖2-11MA139對(duì)抗生素的敏感性表2-10MA139對(duì)抗生素的敏感性抗生素名稱濃度抑菌圈直徑/mm結(jié)果判定大觀霉素[Spectinomycin(SPT)]100μg/片26.5+桿菌肽[Bacitracin(B)]0.04IU/片0.0-卡那霉素[Kanamycin(K)]30μg/片24.1+多黏菌素B[PolymyxinB(PB)]300μg/片12.8+呋喃唑酮[Furazolidone(FR)]300μg/片21.3+紅霉素[Erythromycin(E)]15μg/片24.0+氯霉素[Chloramphenicol(C)]30μg/片28.7+四環(huán)素[Tetracycline(TE)]30μg/片17.7+萬古霉素[Vancomycin(VA)]30μg/片19.2+利福平[Rifampin(RA)]5μg/片27.8+注：“+”為敏感；“-”為不敏感。從上述分析可以發(fā)現(xiàn)，芽孢桿菌的分離篩選遠(yuǎn)比乳酸菌復(fù)雜，特別是在安全穩(wěn)定性方面的檢驗(yàn)更是極為繁瑣。但是這些都是必須完成的工作，在實(shí)際生產(chǎn)過程中，任何步驟出現(xiàn)差錯(cuò)都有可能導(dǎo)致很嚴(yán)重的后果。第三節(jié)發(fā)酵飼料生產(chǎn)菌種的制備和保存在獲得了飼料生產(chǎn)菌種以后，需要對(duì)生產(chǎn)菌種進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)和保存，在生產(chǎn)中稱為制種。生產(chǎn)企業(yè)的規(guī)模不同，準(zhǔn)備生產(chǎn)菌種的方式也有差別。大型生產(chǎn)企業(yè)由于用量比較大，往往自己制種，現(xiàn)生產(chǎn)現(xiàn)用。生產(chǎn)規(guī)模比較小的企業(yè)傾向于購買菌種，或者部分購買，部分自己制備。在前期的敘述中，我們已經(jīng)知道，發(fā)酵飼料的生產(chǎn)菌種主要是乳酸菌、酵母菌和芽孢桿菌?，F(xiàn)在就針對(duì)這三種微生物的擴(kuò)大培養(yǎng)和干燥保存進(jìn)行論述。一、乳酸菌的培養(yǎng)乳酸菌是最常用的有益菌，一般都是厭氧菌，很難制成干粉，最好現(xiàn)培養(yǎng)現(xiàn)用。乳酸菌培養(yǎng)最簡(jiǎn)便、最成熟的方式類似酸奶的發(fā)酵。在無抗生素污染的牛奶中加入6.0%~8.0%的糖，經(jīng)過消毒，冷卻至37℃選取無抗生素污染的純牛奶10L，加入600~800g白砂糖（也可用紅糖代替），加熱至60~70℃，直至蔗糖完全溶解，然后分裝在500mL三角瓶中，用棉花塞塞緊，外包牛皮紙。在110℃左右消毒滅菌10min，冷卻至在36~40℃需要強(qiáng)調(diào)的是一定要用無抗生素污染的牛奶。乳酸菌一般對(duì)抗生素很敏感，溶液中只要有5mg/kg的抗生素就會(huì)對(duì)乳酸的生長繁殖起到明顯的抑制作用，基本不能獲得合格的培養(yǎng)物。如果沒有合格的無抗生素污染牛奶，可以用無藥物污染的豆粕粉。豆粕經(jīng)過浸泡、磨漿以后可以替代牛奶，豆粕干物質(zhì)在溶液中的含量為8.0%左右，類似于豆?jié){，其后續(xù)的補(bǔ)糖和接種發(fā)酵過程與牛奶發(fā)酵過程類似。也可以用無抗生素污染的奶粉（如新西蘭奶粉）加水調(diào)漿（加水量是奶粉分量的8倍左右），恢復(fù)成原始牛奶的營養(yǎng)濃度。二、乳酸菌培養(yǎng)液的脫水干燥傳統(tǒng)的微生物培養(yǎng)液的干燥都是設(shè)法先除去培養(yǎng)液中的自由水。但是對(duì)乳酸菌培養(yǎng)液來說，除水是比較困難的單元操作。乳酸菌對(duì)熱和氧氣都很敏感，即使是高濃度的乳酸菌培養(yǎng)液，其含水量一般都超過90%，干物質(zhì)的含量不超過10%，除水通常需要較長的時(shí)間。對(duì)于厭氧的乳酸菌來說，與空氣接觸時(shí)間越長，活力損失也越大。采用常規(guī)的氣流干燥，乳酸菌的活性損失一般都要超過90%以上。即使采用瞬時(shí)噴霧干燥，活力損失也要超過85%。脫水后的制劑，在20℃近年來，世界各地的畜牧科研工作者在活性乳酸菌的干燥保存方面進(jìn)行了大量研究，提出了很多高科技的方法，其中比較常用的方法是抽真空冷凍干燥和包埋造粒。但因成本造價(jià)高昂，并不適合工業(yè)化生產(chǎn)。下面敘述是比較實(shí)用的乳酸菌脫水干燥方法：一般普通的大麥、小麥和玉米等農(nóng)副產(chǎn)品的含水量都在14%左右，經(jīng)過100℃氣流干燥以后，可以比較簡(jiǎn)單地把水份降低到6%左右。然后再用這些經(jīng)過干燥的載體以大比例（10倍以上）與乳酸絕培養(yǎng)液混合，使混合物的水份含量為11%~20%，從而使乳酸菌處于休眠狀態(tài)，不易失活。干燥冷卻后的載體可以迅速的吸附培養(yǎng)液中的游離水，然后在真空包裝。實(shí)驗(yàn)表明，此方法保存的乳酸菌，在室溫條件下保存3個(gè)月，乳酸菌的活力可以保存50%以上，保存6個(gè)月時(shí)，乳酸菌的活力保存在40%左右。此方法簡(jiǎn)便實(shí)用，成本低廉、質(zhì)量穩(wěn)定，保質(zhì)期長，且活性乳酸菌的回收率較活性乳酸菌脫水干燥流程抽真空密封包裝混合干燥載體抽真空密封包裝混合乳酸菌培養(yǎng)（二）流程說明1.載體的干燥載體為麥粉、玉米粉或者其他農(nóng)副產(chǎn)品。粉碎后過20目篩。對(duì)載體進(jìn)行氣流干燥，檢測(cè)其含水量。將干燥后的麥粉收集在緩沖倉內(nèi)，抽氣冷卻至40℃如果緩沖倉的物料不超過1t，冷卻時(shí)間一般不超過2h，干燥后麥粉的含水量只增加0.3%左右，對(duì)后續(xù)的吸附操作影響很小。必要時(shí)可在冷卻后將干燥后的麥粉進(jìn)行抽真空包裝，以防止吸濕回潮，包裝袋的容量為10-50kg比較合適。2.乳酸菌擴(kuò)大培養(yǎng)乳酸菌一般選用嗜熱鏈球菌，也稱為唾液鏈球菌嗜熱亞種、發(fā)酵乳桿菌和植物乳桿菌等常用的發(fā)酵飼料生產(chǎn)用乳酸菌。將乳酸菌種子液接種于培養(yǎng)基中（接種量為0.5%），在35℃條件下厭氧培養(yǎng)10~14h，得到擴(kuò)大培養(yǎng)液，乳酸菌的濃度為2.0~4.0×1011cfu/g。菌液中干物質(zhì)的含量為7.0%左右（即菌液的含水量為93.0%）。培養(yǎng)基按照如下方法配制：將紅糖（或白砂糖）溶解于無抗生素（或抗生素殘留量不超過0.5mg/kg）的純牛奶中，得到乳酸菌培養(yǎng)基。將培養(yǎng)基在95~105℃條件下消毒10~15min，冷卻至40℃3.干燥載體與乳酸菌菌液混合麥粉與乳酸菌菌液混合，得到的混合物即為乳酸菌劑制成品。將制備得到的乳酸菌劑成品裝于致密性很好的包裝袋中，抽真空密封。菌劑的保存期及活菌損失情況將真空包裝的菌劑置于常溫中保存，在保存時(shí)間為1,3,6個(gè)月時(shí)，分別菌劑中活菌損失情況。我們進(jìn)行了6次實(shí)際生產(chǎn)試驗(yàn)，結(jié)果如表2-11至2-17。表2-11嗜熱鏈球菌制劑保存試驗(yàn)（25℃，真空保存，含水量11.27%）保存時(shí)間/d103090180存活率/%91.481.254.231.8表2-12發(fā)酵乳桿菌制劑保存試驗(yàn)（25℃，真空保存，含水量12.88%）保存時(shí)間/d103090180存活率/%88.379.262.146.8表2-13發(fā)酵乳桿菌制劑保存試驗(yàn)（25℃，真空保存，含水量14.43%）保存時(shí)間/d103090180存活率/%81.664.455.231.5表2-14植物乳桿菌制劑保存試驗(yàn)（25℃，真空保存，含水量15.92%）保存時(shí)間/d103090180存活率/%67.542.337.632表2-15發(fā)酵乳桿菌制劑保存試驗(yàn)（25℃，真空保存，含水量17.36%）保存時(shí)間/d103090180存活率/%69.546.238.734.2表2-16發(fā)酵乳桿菌制劑保存試驗(yàn)（25℃，真空保存，含水量18.74%）保存時(shí)間/d103090180存活率/%53.238.734.628工業(yè)化干燥操作中，高溫氣流干燥1t含水量為14%的麥粉，最終含水量達(dá)到5%，即獲得干燥成品約900kg,需要的操作費(fèi)用約300元（包括電耗、煤耗和人工費(fèi)）。這些載體可以吸附干物質(zhì)含量為10%的高濃度乳酸菌培養(yǎng)液100kg，獲得活菌濃度降低10倍的活菌制劑1t，含水量仍然為14%左右；若每1kg成品一個(gè)單獨(dú)真空包裝，則1t成品的總生產(chǎn)成本不超過4000元。三、酵母菌粉的制備酵母菌是有氧培養(yǎng)的，也可以現(xiàn)培養(yǎng)現(xiàn)用。但是酵母菌干燥、保存比較方便，可以制成干粉備用。釀酒酵母是最常見的發(fā)酵飼料生產(chǎn)菌種之一，以下是一種比較常用的釀酒酵母的擴(kuò)大培養(yǎng)和干燥操作過程。酵母菌保存用固態(tài)培養(yǎng)基（以1000mL為計(jì)算基準(zhǔn)）：瓊脂15.0g，玉米漿20.0mL，蛋白胨5.0g，磷酸0.1g，硫酸銨2.0g，紅糖20.0g。種子用液體培養(yǎng)基（以1000ml為計(jì)算基準(zhǔn)）:玉米漿10ml，蛋白胨5.0g，磷酸0.3g，硫酸銨5.0g，紅糖40.0g。一級(jí)種子用三角瓶搖瓶培養(yǎng)，接種比為0.5%~2.0%，500ml三角瓶裝液量不超過150毫升，轉(zhuǎn)速控制在200~250r/min之間。在30℃恒溫培養(yǎng)8~10h，接入二級(jí)種子罐。表2-17各種菌劑的制備狀況匯總載體乳酸菌培養(yǎng)液乳酸菌制劑成品載體種類干載體質(zhì)量/kg干載體含水量/%乳酸菌種名培養(yǎng)液質(zhì)量/kg乳酸菌的濃度/(cfu/g)載體與乳酸菌培養(yǎng)液質(zhì)量比菌活力成品含水量/%成品質(zhì)量/kg活菌稀釋率/%活菌濃度/(cfu/g)麥粉9206嗜熱鏈球菌602.0×101115.3:1很高11.279806.121.23×1010玉米粉9207發(fā)酵乳桿菌804.2×101011.5:1高12.8810008.003.36×109麥麩9208發(fā)酵乳桿菌1004.2×10109.2:1較高14.4310209.804.12×109玉米粉9206植物乳桿菌1203.8×10107.7:1較高15.92104011.544.37×109麥粉9205發(fā)酵乳桿菌1404.2×10106.6:1一般17.36106013.215.53×109麥麩9206發(fā)酵乳桿菌1604.2×10105.8:1一般18.74108014.816.18×109二級(jí)種子用80~100L小罐，接種比為2.0%~5.0%，通風(fēng)量為1.0~1.2vvm*。在30℃通風(fēng)培養(yǎng)7~8h，接入生產(chǎn)用大罐。大罐的容積是3~5t。大罐的接種比為1.0%~8.0，通風(fēng)量控制在0.4~0.6vvm。

附錄資料：不需要的可以自行刪除汽車修理工常用工具安全操作規(guī)程鉗工臺(tái)1.鉗工（臺(tái)桌）一般緊靠墻壁，人站在一面工作，對(duì)面不準(zhǔn)有人；如大型鉗臺(tái)對(duì)邊有人工作時(shí)鉗臺(tái)上必須設(shè)置密度適當(dāng)?shù)陌踩W(wǎng)，鉗臺(tái)（桌）必須安裝牢固，不得作鐵錚。2.鉗臺(tái)（桌）上使用照明等電壓不得超過36伏。3.鉗臺(tái)（桌）上的雜物要及時(shí)清理，工具和工件要放在指定地方。二、臺(tái)虎鉗1.臺(tái)虎鉗上不要放置工具，以防滑下傷人。2.使用轉(zhuǎn)座臺(tái)虎鉗工作時(shí)，必須把固定螺絲扳緊。3.臺(tái)虎鉗的絲桿、螺母要經(jīng)常擦洗和加油，并保持清潔。如有損壞，不得使用。4.鉗口要保持完好，磨平時(shí)要及時(shí)修復(fù)以防工件滑脫。鉗口緊固螺絲要經(jīng)常檢查，以防松動(dòng)，不準(zhǔn)使用已滑扣的螺絲。5.用臺(tái)虎鉗夾持工件時(shí)，只許使用鉗口最大行程的，不得用管子套在手柄上或用手錘錘擊手柄。6.工件必須放正夾緊，手柄朝下。7工件超出鉗口部分太長，要加支承。裝卸工件時(shí)，必須防止工件摔下傷人。三、手錘（頭）手錘柄必須要用硬質(zhì)木料制成，大小長短要適宜。錘柄要有適當(dāng)?shù)男倍?，垂頭口必須加鐵鍥，以免工作時(shí)甩摔錘頭傷人。兩人擊錘，站立位置要錯(cuò)開方向。扶鉗釘錘要穩(wěn)，落錘要準(zhǔn)，動(dòng)作要協(xié)調(diào)，以免再傷對(duì)方。手錘使用前，應(yīng)檢查錘柄與錘頭是否松動(dòng)，是否裂紋，錘頭上有否卷邊或毛刺，如有缺陷，必須修復(fù)后使用。手上、手錘柄上、錘頭上有油污時(shí)，必須擦干凈后才能進(jìn)行操作。錘頭火要適度，不要直接打硬鋼和火的部件，以免崩傷。掄大錘時(shí)，對(duì)面和后面不準(zhǔn)站人，并注意周圍人員的安全。扁鏟、鏨子、沖頭1不準(zhǔn)用高速鋼做扁鏟2使用時(shí)柄頂端切勿沾油，以免打滑。不準(zhǔn)對(duì)著人鏟工件，以免鐵屑崩出傷人。3.工具頂端如有卷邊時(shí)，要技師修磨后消除隱患，工具有裂紋時(shí)，不準(zhǔn)使用。4.工作時(shí)，應(yīng)聚精會(huì)神地把視線集中在工件上，不要四周觀望或他人閑談。5.不得鏟、沖火材料。6.鏨子不得短于150毫米。刃部火要適當(dāng)、不能過硬。使用時(shí)要保持適當(dāng)?shù)娜薪?。不?zhǔn)用廢鉆代替沖頭。五、銼刀、刮刀1.木柄必須裝有金屬、禁止使用沒有手柄或手柄松動(dòng)的銼刀和刮刀。2.銼刀、刮刀桿不準(zhǔn)火。使用前要仔細(xì)檢查有無裂紋，以防折斷發(fā)生事故。3.推銼要平，壓力和速度要適當(dāng)，回拖要輕，以防發(fā)生事故。4.禁止把銼刀、刮刀代替手錘、棒或沖頭使用，以防折斷傷人。5.工件和刀上有油污時(shí)，要及時(shí)擦凈，以防打滑，使用銼刀，也要防止滑動(dòng)。6.使用三角刮刀時(shí)，應(yīng)握住木柄進(jìn)行工作，工作完畢把刮刀裝入套內(nèi)。7.使用半圓刮刀時(shí)，刮削方向禁止站人，防止刀出傷人。8.清除鐵屑，應(yīng)用專門工具，不應(yīng)用手擦或用最吹。六、起子1.起子的平口，必須平整，厚薄要適當(dāng)，與槽口配合要完好。起子用力時(shí)，其用力方向不要對(duì)著自己或別人，以防脫落傷人。2.使用起子時(shí)，姿勢(shì)要正確，場(chǎng)地要寬闊，用力要均勻。在狹窄、站立不便的地方使用起子時(shí)，尤其要注意安全。3.不能把起子當(dāng)子使用，也不能當(dāng)棒使用。4.使用電動(dòng)起子要注意絕緣良好，防止觸電。七、手鋸1.工件必須夾緊不準(zhǔn)松動(dòng)，以防鋸條折斷傷人。2.鋸割時(shí)，鋸要靠近鉗口，方向要正確，壓力和速度要適當(dāng)。3安裝鋸條時(shí)，松緊度要適當(dāng)，方向要正確，不準(zhǔn)斜歪。4.工件將要鋸斷時(shí)，要輕輕用力，以防壓斷鋸條或工件落下傷人。八、扳牙、絲攻及鉸刀1.攻絲和鉸孔時(shí)要對(duì)正對(duì)直，用力適當(dāng)均勻，以防折斷。2.活絡(luò)鉸刀進(jìn)刀要適量，退刀不能逆轉(zhuǎn)。3.攻套絲和鉸孔時(shí)，不要用最吹里面的鐵屑。以防傷眼；不要用手擦拭工件的表面，以防鐵屑刺手。九、電烙鐵1.不同大小的焊接應(yīng)選用相應(yīng)規(guī)格的電烙鐵。2.焊接時(shí)，應(yīng)將焊件的表面的污垢或氧化層清除干凈，抹上松香或焊油，將帶錫的焊鐵頭焊接處，待錫在焊接處鋪開進(jìn)再移烙鐵，注意不要來回移動(dòng)，那樣容易造成虛焊。3.焊接較大焊件時(shí)，先用烙鐵將焊件加溫到一定程度再進(jìn)行焊接。4.焊接中如電烙鐵暫時(shí)不用，應(yīng)放在安全可靠的地方，避免發(fā)生事故。十、手電鉆1.電鉆導(dǎo)線要保護(hù)好，嚴(yán)禁亂拖、亂拉、防止扎亂、割破。更不準(zhǔn)把電線拖到油水中，嚴(yán)防油水腐蝕電線。2.在潮濕的地方工作時(shí)，必須戴橡皮手套，穿膠皮鞋，最好站在橡皮或干燥的木板上工作；以防觸電。3.使用當(dāng)中如發(fā)現(xiàn)故障或異響，應(yīng)立即停止工作，檢查修復(fù)后再使用。4.停電、休息或離開工作場(chǎng)地時(shí)，應(yīng)切斷電源。5.如用力壓電鉆時(shí)，必須使用鉆垂直工件，而且固定端要特別牢固。6.工作完畢應(yīng)將電鉆、導(dǎo)線及絕緣用品一并放到指定地方。7.電鉆外殼必須接有電線或中線。8.電鉆不能在含有易燃、易爆和腐蝕性氣體、潮濕環(huán)境中使用。9.安裝電鉆頭必須用專用鑰匙，不準(zhǔn)用手錘敲擊卡緊鉆頭，更不準(zhǔn)將超過規(guī)格的粗鉆頭車尾部裝在小電鉆上使用。十一、電動(dòng)砂輪機(jī)電動(dòng)砂輪機(jī)必須有牢固的防護(hù)罩和良好的接地裝置，否則，禁止使用。使用前，必須認(rèn)真檢查各部位螺絲有無松動(dòng)，砂輪片有無裂紋，金屬外殼和電源線有無漏電之處。使用前，首先要進(jìn)行空轉(zhuǎn)試轉(zhuǎn)，無異常時(shí)方可使用。工作時(shí)要戴防護(hù)用品，工作者不準(zhǔn)對(duì)準(zhǔn)砂輪，必須站在砂輪側(cè)面。工件要拿穩(wěn)，就靠砂輪水平中心線間并緩慢接觸砂輪，不準(zhǔn)撞擊和猛壓，使用時(shí)要用砂輪正面，不準(zhǔn)側(cè)面。正在轉(zhuǎn)動(dòng)的砂輪機(jī)不準(zhǔn)任意放在地上，待砂輪停穩(wěn)后，放在指定地方，砂輪暫時(shí)不用時(shí)或工作者離開砂輪機(jī)時(shí)，必須關(guān)閉電門，切斷電源。換砂輪時(shí)，要認(rèn)真間檢查砂輪片有無裂紋或缺損，配合要適當(dāng)，緊固螺帽，松動(dòng)度適當(dāng)。砂輪機(jī)要放在干燥處，嚴(yán)禁放在潮濕地方。十二、電動(dòng)葫蘆1.嚴(yán)格遵守行吊工的有關(guān)安全操作規(guī)程。2.吊動(dòng)前應(yīng)該檢查設(shè)備的機(jī)械、電器、鋼絲繩、吊鉤限位器等，是否完好可靠。3.不得超負(fù)荷起吊，手不準(zhǔn)握在繩索與物件之間，吊物上升時(shí)嚴(yán)防撞頂。4.電動(dòng)葫蘆應(yīng)有專人操作，并熟悉其性能。5.點(diǎn)動(dòng)啟動(dòng)時(shí)，每小時(shí)合閘次數(shù)不得超過60-120次。6.電動(dòng)葫蘆要定期檢查保養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)問題及時(shí)保修。7.工作完畢后，必須把電源開關(guān)拉開。十三、行燈1.行燈使用前，必須檢查絕緣是否良好，以防觸電。2..一般使用的行燈電壓是36伏，必須使用高于36伏的，必須有可靠的接地配置。十四、空壓機(jī)操作者必須熟悉空壓機(jī)的結(jié)構(gòu)和性能。空壓機(jī)啟動(dòng)前，應(yīng)作一次檢查，按規(guī)定加足油水，使用結(jié)束應(yīng)關(guān)掉空壓機(jī)，不得擅自走掉，冬季每天應(yīng)把冷卻水放掉，以免凍壞缸體。經(jīng)常注意壓力表的壓力是否正常，壓力表控制范圍不得任意調(diào)正。儲(chǔ)氣筒及中間冷卻器要經(jīng)常放油放水。壓縮機(jī)及儲(chǔ)氣筒安全閘要保持靈敏正確，定期進(jìn)行試驗(yàn)。運(yùn)轉(zhuǎn)時(shí)發(fā)現(xiàn)異常應(yīng)及時(shí)停機(jī)保修。壓力容器按規(guī)定應(yīng)每年試壓一次?？諌簷C(jī)周圍應(yīng)保持清潔，通道暢通，不得堆放要物。十五、充電機(jī)機(jī)殼應(yīng)接地可靠。接通交流電源前，調(diào)壓手輪或調(diào)壓旋鈕應(yīng)放在最小位置。蓄電池的正負(fù)極和充電機(jī)的正負(fù)接線應(yīng)分別接牢，并注意電壓表的指針擺動(dòng)方向是否正確。接到交流電源后，應(yīng)慢慢調(diào)節(jié)電壓，使充電電流達(dá)到規(guī)定值。嚴(yán)防輸出線路短路，并防止充電機(jī)過截。如工作時(shí)及其溫度過高，可打開上蓋和后蓋，以便通風(fēng)冷卻。充電機(jī)停止工作后，應(yīng)把調(diào)壓手輪或旋鈕調(diào)到最小位置。充電機(jī)周圍不得有腐蝕性氣體和易燃?xì)怏w，以免損壞絕緣性能等，以保證安全。舉升機(jī)安全操作說明車輛駛?cè)腠斳嚈C(jī)時(shí)，車身應(yīng)置于機(jī)體中央，并拉起手剎車，車輛底盤頂起位置墊入橡膠墊，以保持車輛底盤?？蹓荷仙粹o，將車輛頂起至車輛離地時(shí)停止，檢視車輛是否水平及車輛頂起位置是否適當(dāng)。繼續(xù)扣壓上升按鈕車輛升至最高位置自動(dòng)停止，檢視安全卡標(biāo)確保嵌入安全排齒內(nèi)再進(jìn)行車輛修護(hù)作業(yè)，下降前先上升一小降距離，使卡標(biāo)脫離排齒再下降，下降前先檢視機(jī)殼下方四周是否有異物，操作者使用必需于控制箱旁，并且目視機(jī)殼之上升狀況。操作者或則使用者修護(hù)者得于機(jī)殼之周旁，并視使用者之方便性，唯不得有人員于機(jī)殼周旁修護(hù)，同時(shí)有人員于控制箱上操作，故操作、使用者于機(jī)殼上升至使用高度時(shí)，必需將控制箱上之鑰匙開關(guān)切換至0度，并取下鑰匙方可進(jìn)入機(jī)殼周旁進(jìn)行修護(hù)工作。操作中，絕對(duì)禁止人員位于車輛下方，假如車輛掉落之虞，確保人員離開掉落范圍。頂車機(jī)只限于受過訓(xùn)練之熟練操作人員使用。當(dāng)頂車機(jī)下降時(shí)，車輛下方不可使用輔助支架或木棒。車輛于頂車機(jī)上時(shí)，避免過度搖晃車輛，不可使用不合乎標(biāo)準(zhǔn)的附加裝置，嚴(yán)禁車輛單邊升降，車輛頂高時(shí)，嚴(yán)禁極端偏荷重，避免造成車輛傾斜滑落。車頂機(jī)下降前注意足部安全，絕對(duì)禁止改造頂車機(jī)之安全機(jī)橫，使用前請(qǐng)先閱讀指導(dǎo)手冊(cè)，車輛保持與頂車機(jī)平衡平行，機(jī)器坑道內(nèi)應(yīng)該保持清潔干凈，避免積水、廢物積壓，避免洗車及安裝于室外?？刂葡鋬?nèi)高壓電注意電擊，拆除車輛較重零件，應(yīng)注意平衡避免車輛傾斜滑落，頂車機(jī)升降時(shí)，手腳應(yīng)避免開×處或連桿刀臂。操作環(huán)境的限制：溫度：+5℃～+40濕度：溫度超過+40℃時(shí)，相對(duì)濕度不得高于50%使用場(chǎng)所：海平面1000M以下運(yùn)送或儲(chǔ)存：-25℃～+55℃若不超過24小時(shí)，最高溫度可至+機(jī)殼于操作之音量低于70db(A)，若音量超過時(shí)，則必須檢修。大、小事故維修注意事項(xiàng)為使事故車的維修更加規(guī)范順利交車，特制定一下工藝流程：維修車輛入廠，首先維修主管第一時(shí)間確定事故車級(jí)別，然后告訴調(diào)度根據(jù)派工輪流表及實(shí)際情況安排維修班組。維修班組拿到事故車施工單，根據(jù)施工單上內(nèi)容及提示訴與實(shí)際情況相結(jié)合施工。對(duì)可訴車輛必須拆檢全面，該訴的全部拆掉，仔細(xì)檢查損壞件，以避免漏零件。對(duì)事故車可發(fā)動(dòng)或移動(dòng)車輛，撞到底盤或懸掛件，必須做到四輪定位，檢查定位數(shù)據(jù)，并確定損壞零件。在施工中碰到因受撞擊而引起不可確定或不能發(fā)動(dòng)的試車件，如：（方向機(jī)、空調(diào)泵、發(fā)動(dòng)機(jī)、波箱等），必須在報(bào)告單中寫上隱損件。對(duì)大事故或不確定零件不能做定位車輛，需在報(bào)告單注明待查或發(fā)動(dòng)試車后再查等信息。在檢查過程中機(jī)修班組必須與鈑金班組互相配合交流以避免遺留零件，不可相互扯皮，相互推卸責(zé)任。維修班組填寫的報(bào)告單必須規(guī)范，字跡工整，填寫內(nèi)容區(qū)分明顯（發(fā)動(dòng)機(jī)、底盤、電器、附件）。維修班組必須將報(bào)告單交與鈑金主管或車間主管審核，正確校對(duì)更換零件。事故車維修的確定，班組長出完報(bào)告必須與零件元根據(jù)報(bào)告內(nèi)容準(zhǔn)確核對(duì)所訂零件。對(duì)已定事故車施工單及訂貨單，班組長必須對(duì)更換件再做進(jìn)一步核實(shí)，哪些零件該換，哪些零件不同意換，明確具體施工內(nèi)容。維修班組必須及時(shí)了解維修車輛進(jìn)度及零件供貨狀況，根據(jù)實(shí)際情況施工。維修班組必須了解車輛的交車時(shí)間，如因零件供貨或交接問題延遲交車時(shí)間的，必須向調(diào)度或主管反應(yīng)情況，及時(shí)調(diào)整交車時(shí)間。在施工過程中如有意外損壞件，必須及時(shí)與