微生物的遺傳變異和育種待定

微生物的遺傳變異和育種待定第1頁(yè)/共121頁(yè)第一節(jié)遺傳變異的物質(zhì)基礎(chǔ)第二節(jié)基因突變和誘變育種第三節(jié)基因重組和雜交育種第四節(jié)基因工程第五節(jié)菌種的衰退、復(fù)壯和保藏第七章微生物的遺傳變異和育種第2頁(yè)/共121頁(yè)幾個(gè)概念遺傳(heredity)變異(variation)遺傳型(genotype)表型(phenotype)飾變(modification)第3頁(yè)/共121頁(yè)第一節(jié)遺傳變異的物質(zhì)基礎(chǔ)

三個(gè)經(jīng)典實(shí)驗(yàn)

轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)噬菌體的感染實(shí)驗(yàn)病毒的拆開(kāi)和重建實(shí)驗(yàn)第4頁(yè)/共121頁(yè)（一）轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)材料：StreptococcuspneumoniaeStreptococcuspneumoniae的幾種形態(tài)S型和R型第5頁(yè)/共121頁(yè)轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)第6頁(yè)/共121頁(yè)轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)第7頁(yè)/共121頁(yè)第8頁(yè)/共121頁(yè)

從活的S菌中抽提各種細(xì)胞成分（DNA，蛋白質(zhì)，莢膜多糖等），并對(duì)各組分進(jìn)行轉(zhuǎn)化試驗(yàn)第9頁(yè)/共121頁(yè)（二）噬菌體感染實(shí)驗(yàn)第10頁(yè)/共121頁(yè)

實(shí)驗(yàn)材料：E.coli

噬菌體第11頁(yè)/共121頁(yè)（三）病毒的拆開(kāi)和重建實(shí)驗(yàn)(TMV和HRV)第12頁(yè)/共121頁(yè)結(jié)論核酸是負(fù)載遺傳信息的真正物質(zhì)基礎(chǔ)第13頁(yè)/共121頁(yè)二、遺傳物質(zhì)在細(xì)胞中的存在方式(一)細(xì)胞水平(二)細(xì)胞核水平(三)染色體水平(四)核酸水平(五)基因水平(六)密碼子水平(七)核苷酸水平

核酸的七個(gè)水平第14頁(yè)/共121頁(yè)遺傳物質(zhì)類型核基因組真核生物的原核生物的核外染色體真核生物的原核生物的細(xì)胞質(zhì)基因線粒體葉綠體等共生生物2um質(zhì)粒等F因子(F質(zhì)粒)R因子(R質(zhì)粒)Col質(zhì)粒Ti質(zhì)粒巨大質(zhì)粒降解性質(zhì)粒等有核膜包裹的真核(DNA+組蛋白)無(wú)核膜包裹的核區(qū)(環(huán)狀雙鏈DNA)(二)細(xì)胞核水平第15頁(yè)/共121頁(yè)原核生物的質(zhì)粒1.質(zhì)粒的定義指游離于原核生物核基因組以外，具有獨(dú)立復(fù)制能力的小型共價(jià)閉合環(huán)狀的dsDNA分子，即cccDNA(circularcovalentlyclosedDNA)。第16頁(yè)/共121頁(yè)2.特點(diǎn)超螺旋結(jié)構(gòu)；攜帶某些特殊功能的基因（核基因組上所缺少），如具有接合、產(chǎn)毒、抗藥、固氮或降解環(huán)境毒物功能的基因；某些質(zhì)?？膳c核染色體發(fā)生整合或脫離—附加體；當(dāng)用一些理化因素處理時(shí)，可使子代細(xì)胞中的質(zhì)粒消除，如丫啶類染料、絲裂霉素、紫外線或高溫等因素；具有重組的功能

—質(zhì)粒與質(zhì)粒間、質(zhì)粒與染色體之間；有些質(zhì)粒不表現(xiàn)任何功能—隱蔽性質(zhì)粒；第17頁(yè)/共121頁(yè)3.質(zhì)粒的種類

按其復(fù)制與核染色體的復(fù)制是否同步嚴(yán)緊型質(zhì)粒(stringentreplicationplasmid)

松弛型復(fù)制控制質(zhì)粒(relaxedreplicationplasmid)

按其功能接合性質(zhì)粒：如F質(zhì)?？顾幮再|(zhì)粒：如R質(zhì)粒產(chǎn)細(xì)菌素的質(zhì)粒：如Col質(zhì)粒具有生理功能的質(zhì)粒：如固氮的mega質(zhì)粒、降解質(zhì)粒等產(chǎn)毒質(zhì)粒：如Ti質(zhì)粒第18頁(yè)/共121頁(yè)4.典型質(zhì)粒簡(jiǎn)介1）F質(zhì)粒(Fplasmid)是E.coli等細(xì)菌決定性別并有轉(zhuǎn)移功能的質(zhì)粒。

第19頁(yè)/共121頁(yè)2）R質(zhì)粒(Rplasmid,resistanceplasmid)第20頁(yè)/共121頁(yè)3）Col質(zhì)粒(colplasmid)大腸桿菌素

是一類由E.coli某些菌株所產(chǎn)生的細(xì)菌素，具有通過(guò)復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)譯或能量代謝等方式而專一性地殺死它種腸道菌或同種其他菌株的能力，由Col質(zhì)粒編碼；第21頁(yè)/共121頁(yè)4）Ti質(zhì)粒(tumorinducingplasmid)Agrobacteriumtumefaciens（根癌土壤桿菌）從一些雙子葉植物的受傷根部侵入，最后在其中溶解，釋放出Ti質(zhì)粒，其上的T-DNA片段與植物細(xì)胞中的核染色體組發(fā)生整合，合成正常菌株所沒(méi)有的冠癭堿類，破壞控制細(xì)胞分裂的激素調(diào)節(jié)系統(tǒng)，從而使它轉(zhuǎn)變成癌細(xì)胞。第22頁(yè)/共121頁(yè)致癌區(qū)冠嬰堿合成區(qū)冠嬰堿分解區(qū)Ti質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移區(qū)(tra)毒性區(qū)(vir)DNA復(fù)制區(qū)(rep)6個(gè)功能區(qū)：第23頁(yè)/共121頁(yè)

可遺傳變異不可遺傳變異-----飾變基因突變?nèi)旧w畸變生物的變異突變基因重組第24頁(yè)/共121頁(yè)第二節(jié)基因突變和誘變育種一、基因突變（genemutation）

（一）定義核酸上一對(duì)或幾對(duì)堿基突然發(fā)生的可遺傳的變化。第25頁(yè)/共121頁(yè)DNA、RNA的一級(jí)結(jié)構(gòu)

DNA一級(jí)結(jié)構(gòu)5′3′OHOHOH5′3′RNA一級(jí)結(jié)構(gòu)第26頁(yè)/共121頁(yè)DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)的形成5′3′5′3′5′3′5′3′磷酸核糖堿基T-A堿基對(duì)C-G堿基對(duì)第27頁(yè)/共121頁(yè)

氫鍵堿基堆集力磷酸基上負(fù)電荷被胞內(nèi)組蛋白或正離子中和堿基處于疏水環(huán)境中DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)穩(wěn)定因素

第28頁(yè)/共121頁(yè)（二）基因突變的類型基因突變的類型有哪些？哪些突變型是選擇性突變株？哪些是非選擇性突變株？為什么？舉例說(shuō)明如何篩選抗性突變株？第29頁(yè)/共121頁(yè)突變株的表型選擇性突變株非選擇性突變株?duì)I養(yǎng)缺陷型抗性突變型條件致死突變型形態(tài)突變型抗原突變型產(chǎn)量突變型第30頁(yè)/共121頁(yè)細(xì)菌的變異現(xiàn)象形態(tài)、結(jié)構(gòu)變異毒力變異耐藥性變異菌落變異第31頁(yè)/共121頁(yè)形態(tài)結(jié)構(gòu)變異

3-6%食鹽

鼠疫耶氏菌多形態(tài)性

陳舊培基物

第32頁(yè)/共121頁(yè)

青霉素、溶菌酶

正常形態(tài)細(xì)菌

L型變異抗體或補(bǔ)體

(部分或完全失去胞壁)

第33頁(yè)/共121頁(yè)特殊結(jié)構(gòu)的變異

42-43℃

炭疽桿菌失去形成芽胞能力,毒性降低

10-20天

變形桿菌0.1%石炭酸遷徙生長(zhǎng)（H）點(diǎn)狀生長(zhǎng)、單個(gè)菌落（O）鞭毛變異第34頁(yè)/共121頁(yè)毒力變異

β棒狀噬菌體

白喉棒狀桿菌

獲得白喉毒素增強(qiáng)

膽汁、甘油、馬鈴薯培養(yǎng)基

牛分枝桿菌卡介苗減弱

13年(230代)

第35頁(yè)/共121頁(yè)耐藥性變異

細(xì)菌對(duì)某種抗菌藥物有敏感變成耐藥的變異稱為耐藥性變異。金黃色葡萄球菌有些細(xì)菌還同時(shí)耐受多種抗菌藥物，即多重耐藥性，甚至產(chǎn)生藥物依賴性。含鏈霉素培基

痢疾桿菌依鏈株

長(zhǎng)期培養(yǎng)

第36頁(yè)/共121頁(yè)菌落變異

在陳舊培養(yǎng)基中長(zhǎng)期培養(yǎng)

光滑型菌落粗糙型菌落

S

R

原因：失去LPS的特異多糖第37頁(yè)/共121頁(yè)（三）突變率每一個(gè)細(xì)胞在每一世代中發(fā)生某一性狀突變的幾率；自發(fā)突變幾率一般在10-6~10-9范圍內(nèi)；突變率為10-9的含義第38頁(yè)/共121頁(yè)抗性突變是最常見(jiàn)的突變類型；細(xì)菌產(chǎn)生抗藥性的途徑基因突變抗藥性質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移生理適應(yīng)由基因突變引起的抗藥性的原因？第39頁(yè)/共121頁(yè)兩種觀點(diǎn)：突變的性狀與引起突變的原因間呈對(duì)應(yīng)性—

抗性突變株的產(chǎn)生是由環(huán)境因素誘發(fā)出來(lái)的，屬定向變異；突變是自發(fā)產(chǎn)生的，與環(huán)境是否存在該物質(zhì)無(wú)關(guān)。第40頁(yè)/共121頁(yè)1.變量試驗(yàn)（fluctuationtest）實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)者美國(guó)的魯里亞和德?tīng)柌艨烁鶕?jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)原理設(shè)計(jì)；時(shí)間：1943年實(shí)驗(yàn)材料：對(duì)T1噬菌體敏感的大腸桿菌實(shí)驗(yàn)?zāi)康尿?yàn)證突變的性狀與引起突變的原因間有無(wú)直接對(duì)應(yīng)關(guān)系實(shí)驗(yàn)過(guò)程第41頁(yè)/共121頁(yè)103/mL24-36h第42頁(yè)/共121頁(yè)如果突變的性狀與引起突變的原因間呈對(duì)應(yīng)性結(jié)果如何？如何解釋得到的實(shí)驗(yàn)結(jié)果？噬菌體的作用？實(shí)驗(yàn)結(jié)果討論第43頁(yè)/共121頁(yè)突變的發(fā)生在時(shí)間上是隨機(jī)的第44頁(yè)/共121頁(yè)2.涂布試驗(yàn)（Newcombeexperiment）實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)者1949年紐康布實(shí)驗(yàn)材料對(duì)T1噬菌體敏感的大腸桿菌采用固體平板培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)過(guò)程第45頁(yè)/共121頁(yè)第46頁(yè)/共121頁(yè)突變率的計(jì)算接種時(shí)每一平皿的細(xì)胞數(shù)：5×104培養(yǎng)5h后每一平皿的細(xì)胞數(shù)：

5×104×212.3（5100）=2.6×1086個(gè)平皿上共發(fā)現(xiàn)28個(gè)突變菌落突變率=突變的細(xì)胞數(shù)/增加的細(xì)胞總數(shù)

=28/6×（2.6×108-5×104）=1.8×10-8第47頁(yè)/共121頁(yè)3.平板影印試驗(yàn)（replicaplating）實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)者1952年，美國(guó)的萊德伯格夫婦實(shí)驗(yàn)材料E.coliK12實(shí)驗(yàn)過(guò)程第48頁(yè)/共121頁(yè)Lederberg的平板培養(yǎng)法第49頁(yè)/共121頁(yè)第50頁(yè)/共121頁(yè)（四）突變的特點(diǎn)不對(duì)應(yīng)性自發(fā)性稀有性獨(dú)立性誘變性穩(wěn)定性可逆性第51頁(yè)/共121頁(yè)(五)基因突變及其機(jī)制突變誘變自發(fā)突變基因突變?nèi)旧w畸變：缺失、添加、易位、倒位堿基置換移碼突變

轉(zhuǎn)換顛換

缺失

添加第52頁(yè)/共121頁(yè)誘變劑：凡能顯著提高突變頻率的理化因子；1）堿基置換轉(zhuǎn)換（transition）嘌呤被嘌呤所置換或嘧啶被嘧啶所置換顛換（transversion）嘌呤被嘧啶所置換或嘧啶被嘌呤所置換1.誘發(fā)突變第53頁(yè)/共121頁(yè)直接引起置換的誘變劑直接與核酸的堿基發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，體內(nèi)或離體均有作用。如：亞硝酸、羥胺、和各種烷化劑；間接引起置換的誘變劑通過(guò)活細(xì)胞的代謝活動(dòng)摻入到DNA分子中后引起的變化。如：堿基類似物；誘變劑種類第54頁(yè)/共121頁(yè)2）移碼突變

DNA分子中的一個(gè)或少數(shù)幾個(gè)核苷酸的增添或缺失，從而使該部位后面的全部遺傳密碼發(fā)生轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)譯錯(cuò)誤的一類突變；誘變劑種類：丫啶類染料（原黃素、丫啶黃、丫啶橙、-氨基丫啶等）和ICR類化合物；第55頁(yè)/共121頁(yè)3）染色體畸變某些強(qiáng)烈理化因子，如電離輻射（X射線等）和烷化劑、亞硝酸等引起DNA分子的大片段損傷；染色體結(jié)構(gòu)上的缺失、重復(fù)、插入、易位和倒位；染色體數(shù)目的變化；第56頁(yè)/共121頁(yè)染色體的易位

轉(zhuǎn)座DNA序列通過(guò)非同源重組的方式，從染色體某一部位轉(zhuǎn)移到同一染色體上另一部位或其他染色體上某一部位的現(xiàn)象。轉(zhuǎn)座(因)子IS插入序列(insertionsequence)Tn轉(zhuǎn)座子(transposon)Mu噬菌體(mutatorphage)ababab第57頁(yè)/共121頁(yè)2.自發(fā)突變(spontaneousmutation)1、由背景輻射和環(huán)境因素引起；2、由微生物自身有害代謝物引起；3、由DNA復(fù)制過(guò)程中堿基配對(duì)錯(cuò)誤引起等。第58頁(yè)/共121頁(yè)（六）紫外線對(duì)DNA的損傷及其修復(fù)胞嘧啶水合物胸腺嘧啶二聚體二氫胸腺嘧啶胸腺嘧啶-胞嘧啶二聚體第59頁(yè)/共121頁(yè)1.光復(fù)活作用PREA-AT=TPREA-AT=TA-AT-TPREUV可見(jiàn)光二聚體解離PRE光激活酶(photoreactivatingenzyme)A-AT-T5‘3‘5‘3‘第60頁(yè)/共121頁(yè)A-AT-T5‘3‘5‘3‘A-AT=T5‘3‘5‘3‘A-AT=T5‘3‘5‘3‘OHPA-A5‘3‘5‘3‘OHPT=TA-AT-T5‘3‘5‘3‘UV酶I酶II酶III酶IV2.暗修復(fù)（切除修復(fù)）酶I——核酸內(nèi)切酶酶II——核酸外切酶酶III——DNA聚合酶酶IV——DNA連接酶第61頁(yè)/共121頁(yè)（一）自發(fā)突變與育種

從生產(chǎn)中育種定向培育優(yōu)良菌株（二）誘變育種二、突變與育種

指利用物理、化學(xué)等誘變劑處理均勻分散的微生物細(xì)胞群，在促進(jìn)其突變率顯著提高的基礎(chǔ)上，采用簡(jiǎn)便、快速和高效的篩選方法，從中挑選出少數(shù)符合目的的突變株，以供科學(xué)試驗(yàn)或生產(chǎn)實(shí)踐使用。第62頁(yè)/共121頁(yè)

誘變育種的基本環(huán)節(jié)誘變育種的原則突變株的篩選方法產(chǎn)量突變株的篩選抗藥性突變株的篩選營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變株的篩選第63頁(yè)/共121頁(yè)

春日霉素產(chǎn)生菌的孢子懸液

誘變涂布平板培養(yǎng)2天（29℃）

培養(yǎng)4-5天(29℃)生物鑒定板上含供試菌種培養(yǎng)17-18小時(shí)(29℃）檢查抑菌圈的大小保持合適的溫、濕度產(chǎn)量突變株的篩選第64頁(yè)/共121頁(yè)抗藥性突變株的篩選第65頁(yè)/共121頁(yè)營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株?duì)I養(yǎng)缺陷型是指通過(guò)誘變產(chǎn)生的，由于發(fā)生了喪失某酶合成能力的突變，因而只能在加有該酶合成產(chǎn)物的培養(yǎng)基中才能生長(zhǎng)的突變株?；九囵B(yǎng)基（MM，符號(hào)為[-]）是指僅能滿足某微生物的野生型菌株生長(zhǎng)所需的最低成分的合成培養(yǎng)基。完全培養(yǎng)基(CM，符號(hào)為[+])是指可滿足某種微生物的一切營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株的營(yíng)養(yǎng)需要的天然或半合成培養(yǎng)基。補(bǔ)充培養(yǎng)基（SM，符號(hào)為[A]或[B]等）是指在基本培養(yǎng)基中添加某種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)以滿足該營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)缺陷型菌株生長(zhǎng)需求的合成或半合成培養(yǎng)基。

第66頁(yè)/共121頁(yè)營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變株的篩選(1)與篩選營(yíng)養(yǎng)缺陷型有關(guān)的三類培養(yǎng)基基本培養(yǎng)基(minimalmidium，MM)—[-]完全培養(yǎng)基(completemedium,CM)—[+]補(bǔ)充培養(yǎng)基(supplementalmedium,SM)—[A]（2）與營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變有關(guān)的菌體野生型(wildtype)—

能在[-]中生長(zhǎng)營(yíng)養(yǎng)缺陷型(auxotroph)—

能在[+]或[A]生長(zhǎng)原養(yǎng)型(prototroph)—

能在[-]中生長(zhǎng)第67頁(yè)/共121頁(yè)抗生素法菌絲過(guò)濾法青霉素法制霉菌素法原菌株(出發(fā)菌株)誘變劑處理淘汰野生型檢出缺陷型鑒定缺陷型同一培養(yǎng)皿夾層培養(yǎng)法限量補(bǔ)充培養(yǎng)法不同培養(yǎng)皿逐個(gè)檢出法影印接種法生長(zhǎng)譜法營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變株的篩選方法第68頁(yè)/共121頁(yè)營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變株的篩選方法夾層培養(yǎng)法夾層培養(yǎng)法

先在培養(yǎng)皿底部倒一薄層不含菌的基本培養(yǎng)基，待凝，添加一層混有經(jīng)誘變劑處理菌液的基本培養(yǎng)基，其上再澆一薄層不含菌的基本培養(yǎng)基，經(jīng)培養(yǎng)后，對(duì)首次出現(xiàn)的菌落用記號(hào)筆一一標(biāo)在皿底。然后再加一層完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)后新出現(xiàn)的小菌落多數(shù)都是營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變株。

第69頁(yè)/共121頁(yè)限量補(bǔ)充培養(yǎng)法限量補(bǔ)充培養(yǎng)法

把誘變處理后的細(xì)胞接種在含有微量（＜0.01%）蛋白胨的基本培養(yǎng)基平板上，野生型細(xì)胞就迅速長(zhǎng)成較大的菌落，而營(yíng)養(yǎng)缺陷型則緩慢生長(zhǎng)成小菌落。若需獲得某一特定營(yíng)養(yǎng)缺陷型，可再在基本培養(yǎng)基中加入微量的相應(yīng)物質(zhì)。

營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變株的篩選方法第70頁(yè)/共121頁(yè)逐個(gè)檢出法逐個(gè)檢出法

把經(jīng)誘變處理的細(xì)胞群涂布在完全培養(yǎng)基的瓊脂平板上，待長(zhǎng)成單個(gè)菌落后，用接種針或滅過(guò)菌的牙簽把這些單個(gè)菌落逐個(gè)整齊地分別接種到基本培養(yǎng)基平板和另一完全培養(yǎng)基平板上，使兩個(gè)平板上的菌落位置嚴(yán)格對(duì)應(yīng)。經(jīng)培養(yǎng)后，如果在完全培養(yǎng)基平板的某一部位上長(zhǎng)出菌落，而在基本培養(yǎng)基的相應(yīng)位置上卻不長(zhǎng)，說(shuō)明此乃營(yíng)養(yǎng)缺陷型。

營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變株的篩選方法第71頁(yè)/共121頁(yè)影印接種法營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變株的篩選方法abc[-][+]影印平板法

將誘變劑處理后的細(xì)胞群涂布在一完全培養(yǎng)基平板上，經(jīng)培養(yǎng)長(zhǎng)出許多菌落。用特殊工具——“印章”把此平板上的全部菌落轉(zhuǎn)印到另一基本培養(yǎng)基平板上。經(jīng)培養(yǎng)后，比較前后兩個(gè)平板上長(zhǎng)出的菌落。如果發(fā)現(xiàn)在前一培養(yǎng)基平板上的某一部位長(zhǎng)有菌落，而在后一平板上的相應(yīng)部位卻呈空白，說(shuō)明這就是一個(gè)營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變株。第72頁(yè)/共121頁(yè)第四步，鑒定缺陷型生長(zhǎng)譜法是指在混有供試菌的平板表面點(diǎn)加微量營(yíng)養(yǎng)物，視某營(yíng)養(yǎng)物的周圍有否長(zhǎng)菌來(lái)確定該供試菌的營(yíng)養(yǎng)要求。鑒定營(yíng)養(yǎng)缺陷型的操作是：把生長(zhǎng)在完全培養(yǎng)液里的營(yíng)養(yǎng)缺陷型細(xì)胞經(jīng)離心和無(wú)菌水清洗后，配成適當(dāng)濃度的懸液（如107～108個(gè)／ml），取0.1ml與基本培養(yǎng)基均勻混合后，傾注在培養(yǎng)皿內(nèi)，待凝固、表面干燥后，在皿背劃幾個(gè)區(qū)，然后在平板上按區(qū)加上微量待鑒定缺陷型所需的營(yíng)養(yǎng)物粉末（用濾紙片法也可），例如氨基酸、維生素、嘌呤或嘧啶堿基等。經(jīng)培養(yǎng)后，如發(fā)現(xiàn)某一營(yíng)養(yǎng)物的周圍有生長(zhǎng)圈，就說(shuō)明此菌就是該營(yíng)養(yǎng)物的缺陷型突變株。用類似方法還可測(cè)定雙重或多重營(yíng)養(yǎng)缺陷型。營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變株的篩選方法第73頁(yè)/共121頁(yè)(4)營(yíng)養(yǎng)缺陷型的篩選舉例——枯草桿菌氨基酸缺陷型菌體前培養(yǎng)氨基酸缺陷型菌株的營(yíng)養(yǎng)要求的鑒定細(xì)胞懸浮液制備誘變處理中間培養(yǎng)淘汰野生型營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株的檢出（使細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期）（UV照射60s）（調(diào)整細(xì)胞濃度為108個(gè)/ml）（30度CM中振蕩過(guò)夜培養(yǎng)）（青霉素法）（生長(zhǎng)譜法）營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變株的篩選方法第74頁(yè)/共121頁(yè)

無(wú)菌水洗下離心清洗后配成菌懸液（107-108/ml）0.1ml[—].[+]上生長(zhǎng)的營(yíng)養(yǎng)缺陷型

培養(yǎng)營(yíng)養(yǎng)缺陷型的鑒定——生長(zhǎng)譜法第75頁(yè)/共121頁(yè)作為研究代謝途徑和基因重組等遺傳規(guī)律的標(biāo)記菌種；作為氨基酸、維生素或堿基等物質(zhì)生物測(cè)定的試驗(yàn)菌種；用作發(fā)酵生產(chǎn)核苷酸、氨基酸等代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)菌株；；營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變株的應(yīng)用第76頁(yè)/共121頁(yè)

Amestest測(cè)定潛在化學(xué)治癌物

理論依據(jù)一切生物的遺傳物質(zhì)基礎(chǔ)都是核酸尤其是DNA，所以任何能改變核酸結(jié)構(gòu)的因素都可引起核酸生物學(xué)功能的改變。生物化學(xué)統(tǒng)一性法則生物的“三致”（致突變、致畸變、致癌變）物質(zhì)可引起核酸結(jié)構(gòu)的改變，從而引起其功能的改變；反之亦然?；驹鞸almonellatyphimurium

的his-菌株在[-]的平板上不能生長(zhǎng)，如發(fā)生回復(fù)突變，則能生長(zhǎng)。第77頁(yè)/共121頁(yè)試驗(yàn)步驟：可疑“三致”試樣

+

鼠肝勻漿S.this-[-]吸入濾紙片保溫S.this+[-]

陽(yáng)性

陰性

培養(yǎng)第78頁(yè)/共121頁(yè)1、某突變菌株在基本培養(yǎng)基上無(wú)法生長(zhǎng)，而在添加了0.1%堿水解酵母核酸后，該菌株能生長(zhǎng)。請(qǐng)?jiān)O(shè)計(jì)一實(shí)驗(yàn)方案以進(jìn)一步確定該菌株的生長(zhǎng)必需物。2、什么叫做營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株?在實(shí)驗(yàn)室中如何從原養(yǎng)型菌株獲得營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株?請(qǐng)?jiān)O(shè)計(jì)一個(gè)具體實(shí)驗(yàn)方案。3、怎樣用實(shí)驗(yàn)證明突變是自發(fā)產(chǎn)生的，而不是受環(huán)境誘導(dǎo)產(chǎn)生的？思考題第79頁(yè)/共121頁(yè)第三節(jié)基因重組(generecombination)第80頁(yè)/共121頁(yè)基因重組的定義兩個(gè)獨(dú)立基因組內(nèi)的遺傳基因，通過(guò)一定的途徑轉(zhuǎn)移到一起，形成新的穩(wěn)定基因組的過(guò)程稱為基因重組或遺傳重組，簡(jiǎn)稱重組。重組和雜交的關(guān)系重組是在核酸分子水平上的雜交，與細(xì)胞水平上的雜交有明顯區(qū)別雜交中必然包含著重組，而重組則不限于雜交一種形式。第81頁(yè)/共121頁(yè)一、原核生物的基因重組（一）轉(zhuǎn)化（transformation）1.定義：受體菌直接吸收供體菌的DNA片段而獲得后者部分遺傳性狀的現(xiàn)象。形成的雜種后代稱為轉(zhuǎn)化子。2.能進(jìn)行轉(zhuǎn)化的微生物種類Streptococcuspneumoniae；Bacillus；Rhizobium；Pseudomonas；Staphylococcus；Saccharomycescerevisiae；Neurosporacrassa；Aspergillusniger等。但腸道菌科的細(xì)菌如E.coli等很難進(jìn)行轉(zhuǎn)化。第82頁(yè)/共121頁(yè)3.影響菌株間發(fā)生轉(zhuǎn)化的因素與它們?cè)谶M(jìn)化過(guò)程中的親緣關(guān)系有關(guān)；最易與細(xì)胞表面結(jié)合的是dsDNA；發(fā)生轉(zhuǎn)化的細(xì)胞必須處于感受態(tài);轉(zhuǎn)化的頻率低（0.1-1%，最高為20%）;轉(zhuǎn)化需要的DNA濃度極低;4.感受態(tài)（competence）指受體細(xì)胞最易接受外源DNA片段并能實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)化的一種生理狀態(tài)。不同菌種感受態(tài)細(xì)胞所占比例、出現(xiàn)的時(shí)間和維持時(shí)間不同外界環(huán)境因子如環(huán)腺苷酸（cAMP）和Ca2+等可提高受體細(xì)胞的感受態(tài)水平。調(diào)節(jié)感受態(tài)的是一類特異蛋白—感受態(tài)因子第83頁(yè)/共121頁(yè)dsDNA供體（strR）感受態(tài)受體（strS）同源區(qū)段配對(duì)單鏈整合，形成一小段雜合DNA區(qū)段轉(zhuǎn)化子（strR）非轉(zhuǎn)化子（strS）復(fù)制與分離5.轉(zhuǎn)化過(guò)程第84頁(yè)/共121頁(yè)6.轉(zhuǎn)染(transfection)用提純的病毒核酸（DNA或RNA）去感染其宿主細(xì)胞，可增殖出一群正常病毒后代的現(xiàn)象稱為轉(zhuǎn)染。第85頁(yè)/共121頁(yè)1.定義通過(guò)完全缺陷或部分缺陷噬菌體的媒介，把供體細(xì)胞的小片段DNA攜帶到受體細(xì)胞中，通過(guò)交換與整合，使后者獲得前者部分遺傳性狀的現(xiàn)象。獲得的重組細(xì)胞稱為轉(zhuǎn)導(dǎo)子。2.轉(zhuǎn)導(dǎo)的種類普遍轉(zhuǎn)導(dǎo)局限轉(zhuǎn)導(dǎo)（二）轉(zhuǎn)導(dǎo)(transduction)第86頁(yè)/共121頁(yè)供體菌受體菌轉(zhuǎn)導(dǎo)噬菌體細(xì)菌DNA噬菌體DNA第87頁(yè)/共121頁(yè)第88頁(yè)/共121頁(yè)

通過(guò)極少數(shù)完全缺陷噬菌體對(duì)供體菌基因組上任何DNA小片段的“誤包”，而將其遺傳性狀傳遞給受體菌的現(xiàn)象；一般用溫和噬菌體作為普遍轉(zhuǎn)導(dǎo)的媒介；可分為完全普遍轉(zhuǎn)導(dǎo)和流產(chǎn)普遍轉(zhuǎn)導(dǎo)；普遍轉(zhuǎn)導(dǎo)(generalizedtransduction)第89頁(yè)/共121頁(yè)完全普遍轉(zhuǎn)導(dǎo)(generalizedtransduction)供體受體第90頁(yè)/共121頁(yè)（2）流產(chǎn)普遍轉(zhuǎn)導(dǎo)外源DNA片段不與受體細(xì)胞核染色體組進(jìn)行交換、整合和復(fù)制，僅表現(xiàn)穩(wěn)定的轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)譯和性狀表達(dá)，且每經(jīng)過(guò)一次分裂，就受到一次“稀釋”。第91頁(yè)/共121頁(yè)通過(guò)部分缺陷的溫和噬菌體把供體菌少數(shù)特定基因攜帶到受體菌中，并與后者的基因組整合、重組，形成轉(zhuǎn)導(dǎo)子的現(xiàn)象；特點(diǎn)：只局限于傳遞供體菌核染色體上的個(gè)別特定基因；該特定基因由部分缺陷的溫和噬菌體攜帶；缺陷噬菌體的形成方式是在脫離宿主核染色體過(guò)程中，發(fā)生低頻率（-10-5）的誤切；需要通過(guò)UV等因素對(duì)溶源菌的誘導(dǎo)；分為低頻轉(zhuǎn)導(dǎo)和高頻轉(zhuǎn)導(dǎo)局限轉(zhuǎn)導(dǎo)(restrictedtransduction)第92頁(yè)/共121頁(yè)

galdgal1)低頻轉(zhuǎn)導(dǎo)（LFT）部分缺陷噬菌體以大腸桿菌噬菌體為例

gal

bio正常切割不正常切割biodbio

其頻率為10-4—10-6

（LFT裂解物）E.coliK12gal-

少數(shù)穩(wěn)定的gal+轉(zhuǎn)導(dǎo)子低m.o.i.第93頁(yè)/共121頁(yè)2)高頻轉(zhuǎn)導(dǎo)（HFT）雙重溶源菌（doublelysogen）同時(shí)感染有正常噬菌體和缺陷噬菌體的受體菌；被紫外線等誘導(dǎo)時(shí)，正常的噬菌體具有補(bǔ)償缺陷噬菌體（如

dgal）所缺失的部分基因的功能，使兩種噬菌體同時(shí)獲得復(fù)制；存在于雙重溶源菌的正常噬菌體被稱作助體噬菌體；雙重溶源菌產(chǎn)生的裂解物中含有等量的和

dgal粒子HFT裂解物低m.o.i.

Ecoli.K12gal-

高頻地把它轉(zhuǎn)化成

穩(wěn)定的gal+轉(zhuǎn)導(dǎo)子；

高m.o.i.的LFT裂解物感染

Ecoli.K12gal-

?第94頁(yè)/共121頁(yè)低頻轉(zhuǎn)導(dǎo)和高頻轉(zhuǎn)導(dǎo)的異同點(diǎn)相同點(diǎn)只能轉(zhuǎn)導(dǎo)供體菌的個(gè)別特定基因該特定基因由部分缺陷的溫和噬菌體攜帶不同點(diǎn)低頻轉(zhuǎn)導(dǎo)：在裂解物中所含的部分缺陷噬菌體的比例極低，稱為低頻轉(zhuǎn)導(dǎo)裂解物。用其感染宿主，只獲得極少量的局限轉(zhuǎn)導(dǎo)子高頻轉(zhuǎn)導(dǎo)：產(chǎn)生高頻轉(zhuǎn)導(dǎo)裂解物，用其感染宿主，可獲得較多的轉(zhuǎn)導(dǎo)子。第95頁(yè)/共121頁(yè)

當(dāng)溫和噬菌體感染其宿主而使之發(fā)生溶源化時(shí)，因噬菌體基因整合到宿主基因上，而使后者獲得了除免疫性以外新性狀的現(xiàn)象，稱溶源轉(zhuǎn)變。溶源轉(zhuǎn)變第96頁(yè)/共121頁(yè)（三）接合（conjugation）供體菌通過(guò)性菌毛與受體菌直接接觸，把F質(zhì)粒或其攜帶的核基因組傳遞給后者，使后者獲得若干新遺傳性狀的現(xiàn)象。能進(jìn)行結(jié)合的微生物種類主要在細(xì)菌和放線菌中存在；研究得最清楚的是E.coli；E.coli有性別分化，決定性別的是一種質(zhì)粒，即F因子——是屬于附加體的質(zhì)粒。根據(jù)F因子在細(xì)胞內(nèi)的存在方式，將E.coli分為四種類型：

第97頁(yè)/共121頁(yè)F+菌株含有游離的F因子，在細(xì)胞表面還有性菌毛F-菌株不含F(xiàn)因子，細(xì)胞表面沒(méi)有性菌毛。Hfr（高頻重組）菌株F因子整合在核染色體組特定位點(diǎn)上F’菌株Hfr菌株內(nèi)的F因子因不正常切離而脫離核染色體組時(shí)形成的游離的但攜帶一小段核染色體基因的特殊F因子

初生的F’菌株大腸桿菌的四種類型第98頁(yè)/共121頁(yè)F質(zhì)粒的4種存在方式及相互關(guān)系第99頁(yè)/共121頁(yè)大腸桿菌的接合方式F+×F-

F++F+

Hfr×

F-

Hfr+

F-（多數(shù)情況下）Hfr×

F-

Hfr+

Hfr（少數(shù)情況下）F’×F-

F’+F’F因子轉(zhuǎn)導(dǎo)以F’質(zhì)粒通過(guò)接合來(lái)傳遞供體基因的方式第100頁(yè)/共121頁(yè)F質(zhì)粒的接合F+F-F+F-F+F+F+F+DonorRecipientF+第101頁(yè)/共121頁(yè)第102頁(yè)/共121頁(yè)第103頁(yè)/共121頁(yè)中斷實(shí)驗(yàn)第104頁(yè)/共121頁(yè)（四）原生質(zhì)體融合(protoplastfusion)通過(guò)人為的方法，使遺傳性狀不同的兩細(xì)胞的原生質(zhì)體發(fā)生融合，借以獲得兼有雙親遺傳性狀的穩(wěn)定重組子的過(guò)程。此重組子稱為融合子。能進(jìn)行原生質(zhì)體融合的細(xì)胞極其廣泛原核生物、真核生物、高等動(dòng)植物、人體第105頁(yè)/共121頁(yè)原生質(zhì)體融合的主要步驟：1選擇親本有特殊價(jià)值有選擇性遺傳標(biāo)記2獲得原生質(zhì)體脫壁酶去除細(xì)胞壁（細(xì)菌、放線菌、真菌）3原生質(zhì)體融合促融合劑PEG(聚乙二醇)或電脈沖4篩選穩(wěn)定的融合子第106頁(yè)/共121頁(yè)原生質(zhì)體融合的主要步驟：各種融合子長(zhǎng)成菌落影印接種[-]檢出[A+B+]篩選優(yōu)良性狀的融合子篩選[+]第107頁(yè)/共121頁(yè)原生質(zhì)體融合的特點(diǎn)1.重組頻率高2.不受親緣關(guān)系的影響3.能轉(zhuǎn)移多數(shù)基因，可獲得生產(chǎn)性狀更為優(yōu)良的新物種4.兩個(gè)原生質(zhì)體表面直接接觸，對(duì)等融合形成（雙向轉(zhuǎn)移）第108頁(yè)/共121頁(yè)原生質(zhì)體融合第109頁(yè)/共121頁(yè)二、真核微生物的基因重組基因重組的方式：有性雜交、準(zhǔn)性雜交、原生質(zhì)體融合和遺傳轉(zhuǎn)化；