微生物正交實驗

微生物正交實驗第1頁/共69頁

菌種的擴大培養(yǎng)是發(fā)酵生產(chǎn)的第一道工序,該工序又稱為種子制備。菌體數(shù)量增加種子制備高質(zhì)量的種子種子的擴大培養(yǎng)任務(wù)：獲得純而壯且活力旺盛、接種數(shù)量足夠的培養(yǎng)物。

發(fā)酵時間長短和接種量的大小有關(guān)。將較多數(shù)量的成熟菌體接入發(fā)酵罐中，有利于縮短發(fā)酵時間，提高發(fā)酵罐利用率，減少染菌機會。第2頁/共69頁一、種子制備的過程1、固體培養(yǎng)基上生產(chǎn)大量孢子的孢子制備

2、液體培養(yǎng)基中生產(chǎn)大量菌絲的過程第3頁/共69頁1、孢子制備

孢子制備是種子制備的開始，孢子的質(zhì)量、數(shù)量對以后菌絲的生長、繁殖、發(fā)酵產(chǎn)量有明顯影響。（1）放線菌孢子的制備限制碳源、氮源（碳源1％，氮源不超過0.5％）；添加麩皮、豌豆浸汁、蛋白胨、無機鹽；干燥。放線菌發(fā)酵生產(chǎn)的工藝流程：菌種母斜面子斜面搖瓶種子

種子罐

發(fā)酵罐（孢子）（孢子）（菌絲）第4頁/共69頁（2）霉菌孢子的制備一般以大米、小米、玉米、麩皮等天然農(nóng)產(chǎn)品為培養(yǎng)基（3）細菌培養(yǎng)物的制備斜面多為碳源限量、氮源豐富的配方第5頁/共69頁2、種子制備

種子制備是將固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)出的孢子或菌體轉(zhuǎn)入到液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，使其繁殖成大量菌絲或菌體的過程。（1）搖瓶種子制備：某些孢子發(fā)芽和菌絲繁殖速度緩慢的菌種，需將孢子經(jīng)搖瓶培養(yǎng)成菌絲后再進入種子罐，這就是搖瓶種子。分母瓶和子瓶。（2）種子罐種子制備：因菌種不同而異，一般可分為一級種子、二級種子和三級種子的制備。第6頁/共69頁A、一級種子：孢子或搖瓶菌絲被接入到體積較小的種子罐中，經(jīng)培養(yǎng)后形成大量菌絲。一級種子轉(zhuǎn)入到發(fā)酵罐內(nèi)發(fā)酵，稱為二級發(fā)酵。B、二級種子：將一級種子轉(zhuǎn)入體積較大的種子罐中，經(jīng)過培養(yǎng)形成更多的菌絲。二級種子轉(zhuǎn)入到發(fā)酵罐內(nèi)發(fā)酵，稱為三級發(fā)酵。C、三級種子，四級發(fā)酵種子罐的級數(shù)主要決定于菌株性質(zhì)和菌體生長速度及發(fā)酵設(shè)備的合理應(yīng)用。第7頁/共69頁二、種子培養(yǎng)

表面培養(yǎng)法：好氧靜置培養(yǎng)法固體培養(yǎng)法：曲法培養(yǎng)

液體深層培養(yǎng)液體表面培養(yǎng)固體表面培養(yǎng)淺盤固體培養(yǎng)深層固體培養(yǎng)第8頁/共69頁液體深層培養(yǎng)

液體深層種子罐從罐底部通氣，送入的空氣由攪拌漿葉分散成微小氣泡以促進氧的溶解。這種由罐底部通氣攪拌的培養(yǎng)方法，相對于氣液界面靠自然擴散使氧溶解的表面培養(yǎng)法，稱為深層培養(yǎng)法。深層培養(yǎng)基本操作的三個控制點：

Ⅰ滅菌Ⅱ溫度控制Ⅲ通氣、攪拌第9頁/共69頁幾種深層培養(yǎng)法（1）控制培養(yǎng)法：根據(jù)罐內(nèi)部的變化情況，掌握短時間內(nèi)狀態(tài)變量的變化以及可能測定的環(huán)境因子對微生物代謝活動的影響，以此為基礎(chǔ)作控制培養(yǎng)，以達到產(chǎn)物的最優(yōu)培養(yǎng)條件。（2）載體培養(yǎng)法：以天然或人工合成的多孔材料代替麩皮之類的固體基質(zhì)作為微生物的載體。（3）兩步法：酶制劑的兩步深層培養(yǎng)中，將菌體生長（營養(yǎng)期）和產(chǎn)酶條件（繁殖期）區(qū)分開。第10頁/共69頁三、種子質(zhì)量控制種子質(zhì)量主要受孢子質(zhì)量、培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件、種齡和接種量等因素的影響。種子的質(zhì)量是發(fā)酵能否正常進行的重要因素之一，因為種子制備不僅是要提供一定數(shù)量的菌體，更為重要的是要為發(fā)酵生產(chǎn)提供適合發(fā)酵、具有一定生理狀態(tài)大的菌體。種子質(zhì)量的控制將以此為出發(fā)點。第11頁/共69頁三、種子質(zhì)量控制1、培養(yǎng)基：盡量選擇一些有利于孢子發(fā)芽和菌絲生長的培養(yǎng)基；營養(yǎng)成分要盡可能和發(fā)酵培養(yǎng)基相近。2、培養(yǎng)條件：最適溫度；通氣攪拌的控制。青霉素生產(chǎn)：通氣充足和通氣不足的種子都接入發(fā)酵罐，發(fā)酵單位可相差一倍。土霉素發(fā)酵生產(chǎn)：一級種子罐通氣量小卻有利。攪拌不足會引起菌絲結(jié)團、菌絲粘壁等異常第12頁/共69頁3、種齡：即種子培養(yǎng)時間。一般選對數(shù)生長期，菌體量尚未達到最高峰時移種。最適種齡：細菌——7～24h；霉菌——16～50h；放線菌——21～64h

同一菌種的不同罐批培養(yǎng)相同的時間，得到種子質(zhì)量也不完全一致，因此最適的種齡更應(yīng)通過多次試驗，根據(jù)本批種子質(zhì)量來確定。第13頁/共69頁4、接種量：即移入的種子液體積和接種后培養(yǎng)液體積的比例。接種量大小與該菌在發(fā)酵罐中生長繁殖的速度有關(guān)。

近年來，生產(chǎn)上多以大接種量和豐富培養(yǎng)基作為高產(chǎn)措施，如谷氨酸生產(chǎn)：采用高生物素、大接種量、添加青霉素加大接種量雙種法種子罐染菌或不理想倒種法、混種進罐第14頁/共69頁5、種子質(zhì)量標準（1）細胞或菌體：菌體形態(tài)：顯微鏡觀察

菌體健壯、菌形一致、均勻整齊（單細胞菌體種子）菌絲粗壯、對某些染料著色力強、生產(chǎn)旺盛、菌絲分枝和內(nèi)含物情況良好（霉菌和放線菌種子）菌體生長量：離心沉淀法、光密度法、物質(zhì)代謝的反應(yīng)種子液外觀：顏色、粘度。第15頁/共69頁

（2）生化指標：種子液的糖、氮、磷、和pH值變化（3）產(chǎn)物生成量：（4）酶活力5、種子質(zhì)量標準第16頁/共69頁6、種子異常的分析種子異常往往表現(xiàn)為：（1）菌種生長發(fā)育緩慢或過快：和孢子質(zhì)量和種子罐的培養(yǎng)條件有關(guān)。（2）菌絲結(jié)團：液體培養(yǎng)條件下，繁殖的菌絲不分散舒展而聚集成團為菌絲團，與攪拌效果差、接種量小有關(guān)。（3）菌絲粘壁：與攪拌效果差、泡沫過多、種子罐裝料系數(shù)過少等有關(guān)。第17頁/共69頁種子帶菌及其防治：

a種子帶菌：發(fā)酵前期染菌的重要原因之一，是發(fā)酵成敗的關(guān)鍵。

b種子帶菌原因：保藏的斜面試管菌種染菌、培養(yǎng)基和器具滅菌不徹底、種子轉(zhuǎn)移和接種過程染菌以及種子培養(yǎng)基所涉及的設(shè)備和裝置染菌等。第18頁/共69頁C種子染菌防治：

嚴格控制無菌室污染；制備種子時對沙土管、斜面、搖瓶等嚴格進行管理，防止雜菌的進入而受到污染；對每一級種子的培養(yǎng)物進行嚴格的無菌檢查；對菌種培養(yǎng)基或器具進行嚴格的滅菌處理。

第19頁/共69頁工業(yè)培養(yǎng)基及制備第20頁/共69頁培養(yǎng)基

定義：提供微生物生長繁殖和生物合成各種代謝產(chǎn)物所需要的按一定比例配制的多種營養(yǎng)物質(zhì)的混合物。第21頁/共69頁一、工業(yè)培養(yǎng)基的選擇從微生物的特點來選擇培養(yǎng)基液體和固體培養(yǎng)基選擇從生產(chǎn)實踐和科學試驗的不同要求選擇從經(jīng)濟效益方面考慮選擇生產(chǎn)原料第22頁/共69頁二、培養(yǎng)基配置原則根據(jù)不同微生物的營養(yǎng)需要配制不同的培養(yǎng)基營養(yǎng)成分的恰當配比滲透壓pH值氧化還原電位第23頁/共69頁三、工業(yè)發(fā)酵培養(yǎng)基

消耗每克底物將產(chǎn)生最大的菌體得率或產(chǎn)物得率能產(chǎn)生最高的產(chǎn)品或菌體濃度能得到產(chǎn)物的最大速率副產(chǎn)品的得率小價廉質(zhì)量穩(wěn)定來源豐富且供應(yīng)充分第24頁/共69頁蚌埠豐原生化運用先進的生物發(fā)酵和現(xiàn)代化工分離技術(shù)，以生物發(fā)酵技術(shù)為起點，大力發(fā)展農(nóng)產(chǎn)品深加工產(chǎn)業(yè)，發(fā)展成為集生物化工、制藥、食品加工、油脂加工、生物新材料為一體的加工制造產(chǎn)業(yè)集團。

檸檬酸及其鹽類產(chǎn)品生產(chǎn)能力處于全國發(fā)酵產(chǎn)品行業(yè)第一位，在世界同行業(yè)排名前列，位居全國精細化工之首。豐原生化以玉米、小麥、油料等農(nóng)作物為原料，借助自己獨創(chuàng)的“利用玉米清液一次發(fā)酵生產(chǎn)檸檬酸”專利技術(shù)，國內(nèi)首家開發(fā)利用,開辟了檸檬酸生產(chǎn)的新途徑，選育了適應(yīng)該原料的新菌株，縮短了發(fā)酵周期，提高了收率，總收率達80%以上。降低了成本，提高了產(chǎn)品質(zhì)量，其綜合經(jīng)濟技術(shù)指標處于國內(nèi)領(lǐng)先水平。以玉米代替山芋干為原料，避免了環(huán)境污染，副產(chǎn)品還可開發(fā)利用。第25頁/共69頁1、工業(yè)常用碳源2、工業(yè)常用氮源3、無機鹽4、生長因子5、前體物質(zhì)和促進劑四、工業(yè)發(fā)酵培養(yǎng)基成分第26頁/共69頁工業(yè)常用碳源功能：供給菌體生命活動所需的能量構(gòu)成菌體細胞以及代謝的基礎(chǔ)谷物淀粉、甘蔗糖蜜、甜菜糖蜜、大麥酒精、簡單的有機酸、烷烴甲醇、甲烷第27頁/共69頁工業(yè)常用氮源

功能：構(gòu)成菌體細胞物質(zhì)和代謝產(chǎn)物無機氮源：氨水、銨鹽、硝酸鹽等有機氮源：玉米漿、豆餅粉、魚粉、酵母浸出液等

第28頁/共69頁無機鹽硫酸鹽、磷酸鹽、氯化物、含鉀、鈣、鈉、鎂、鐵的化合物微量元素：銅、錳、鋅、鉬等功能：構(gòu)成菌體成分、酶的組成部分、酶的激活劑或抑制劑、調(diào)節(jié)培養(yǎng)滲透壓、調(diào)節(jié)pH和氧化還原電位第29頁/共69頁生長因子定義：凡是微生物生長不可缺少的微量有機物質(zhì)，如：氨基酸、嘌呤、嘧啶、維生素（生物素、硫胺素）。功能：構(gòu)成細胞的組成，促進生命活動的進行。并非必需的。提供生長因子的農(nóng)副產(chǎn)品原料：玉米漿、麩皮水解液、糖蜜、酵母第30頁/共69頁谷氨酸產(chǎn)生菌：生物素缺陷型生物素對菌體和谷氨酸積累都有影響發(fā)酵中添加“亞適量”濃度第31頁/共69頁前體物質(zhì)目的：有助于調(diào)節(jié)產(chǎn)物的形成，大幅度提高發(fā)酵產(chǎn)率、降低成本。絲氨酸前體甘氨酸色氨酸前體吲哚/氨茴酸前體直接被菌體在微生物合成過程中結(jié)合到產(chǎn)物分子上，而其自身結(jié)構(gòu)并沒有多大變化，產(chǎn)物產(chǎn)量大幅度提高。第32頁/共69頁促進劑

定義：在氨基酸、抗生素、酶制劑發(fā)酵生產(chǎn)過程中，可在發(fā)酵培養(yǎng)基中加入某些對發(fā)酵起一定促進作用的物質(zhì)，稱為促進劑。例如：酶制劑發(fā)酵過程，添加誘導(dǎo)物、表面活性劑等促進劑。第33頁/共69頁總之，培養(yǎng)基配置可參照前人的經(jīng)驗配方，再結(jié)合菌種和產(chǎn)品的特性，采用搖瓶等小發(fā)酵設(shè)備對碳、氮、無機因子等單因子逐個試驗，觀察這些因子對菌體生長和產(chǎn)物合成的影響，再綜合考慮各因素的影響，以得到最優(yōu)配方。為減少試驗次數(shù)，可考慮用“正交試驗設(shè)計”等方法確定培養(yǎng)基的組分和濃度。第34頁/共69頁正交試驗法定義：用正交表安排多因素試驗與分析試驗結(jié)果的辦法，簡稱正交試驗。因素：影響試驗指標的條件水平：因素所處的狀態(tài)第35頁/共69頁簡化試驗次數(shù)諸因素中哪些因素對指標的影響較大，哪些因素較小。所考察的因素各取什么水平能使實驗指標較好指標在不同水平時的變化規(guī)律等正交試驗意義第36頁/共69頁

常用的正交表例如：

L4（23），L16（44），L27（313）正交表格式：Ln（tq）

L代表正交表，n代表實驗次數(shù)，

t代表因素水平數(shù)，q代表因素數(shù)。

常用的正交表可查閱有關(guān)統(tǒng)計學書籍直接套用。第37頁/共69頁正交表選擇依據(jù)：在能容納所研究的因素數(shù)和因素水平數(shù)的前提下選用試驗次數(shù)最少的正交表來安排試驗正交表安排試驗注意事項：盡可能使各因素的水平數(shù)相等，試驗的重復(fù)次數(shù)相當。第38頁/共69頁正交設(shè)計試驗結(jié)果分析

直觀分析

方差分析第39頁/共69頁直觀分析

K1：每一因素每一水平下試驗指標值的總和k1：每一因素每一水平下試驗指標值的平均數(shù)R（級差）：試驗指標隨因素水平變化而改變的最大范圍第40頁/共69頁正交設(shè)計表表頭設(shè)計

考察指標：糖酸轉(zhuǎn)化率（％）第41頁/共69頁

L16(44)正交實驗

第42頁/共69頁正交實驗結(jié)果直觀分析第43頁/共69頁實驗結(jié)果分析各因素對產(chǎn)酸影響的大小順序為：葡萄糖>KH2PO4>尿素>玉米漿，各因素的水平為：A2，B3，C2，D3

由此最終確立了菌株的優(yōu)化配方：葡萄糖4％；尿素1.5％；玉米漿1％；KH2PO40.5％。第44頁/共69頁直觀分析優(yōu)點：簡便、計算工作量小直觀分析缺點：判斷因素效應(yīng)的精度不夠，也不能給出誤差的大小。第45頁/共69頁正交試驗結(jié)果方差分析考察指標：糖酸轉(zhuǎn)化率（％）第46頁/共69頁L16(44)正交實驗結(jié)果

第47頁/共69頁試驗結(jié)果的方差分析第48頁/共69頁

以n表示試驗的總次數(shù)，t代表A、B、C、D四因素每個水平的重復(fù)試驗次數(shù)。n＝16，t＝4，方差分析的平方和

QA＝（∑Ki2）/t－（∑Xi）2/n

＝111818/4－6362/16＝2673.5QB＝19182/4－6362/16＝14.5QC＝101258/4－6362/16＝33.5QD＝101550/4－6362/16=106.5

Q＝∑Xi2－（∑Xi）2/n＝28137.6－6362/16

＝2856.4

Qe＝Q－(QA+QB+QC+QD)＝28.4第49頁/共69頁F＝s12/s22F檢驗法通過計算方差之比來檢驗兩組數(shù)據(jù)是否存在顯著性差異F（f1，f2）0.05＝9.28F（f1，f2）0.01＝29.46

第50頁/共69頁當F>F（f1，f2）0.05時，該處理引起的差別有顯著意義；當F>F（f1，f2）0.01時，該處理引起的差別有非常顯著意義；當F<F（f1，f2）0.05時，該處理引起的差別有無顯著意義查單側(cè)F分布表第51頁/共69頁

根據(jù)F檢驗可以看出因素A非常顯著，方差分析觀點認為，只需對顯著的因素進行選擇，不顯著的因素原則上可選試驗范圍內(nèi)的任一點。因此可選A2，因素B、C、D可在試驗范圍內(nèi)任取一點或由其它指標確定。第52頁/共69頁微生物發(fā)酵方法第53頁/共69頁發(fā)酵方法

好氧發(fā)酵厭氧發(fā)酵：液體表面發(fā)酵固體表面發(fā)酵通氧深層發(fā)酵不通氧的深層發(fā)酵第54頁/共69頁

無論好氧或厭氧發(fā)酵都可通過深層培養(yǎng)來實現(xiàn)，這種培養(yǎng)均在具有一定徑高比的圓柱形發(fā)酵罐內(nèi)完成，操作方法可分為一下五種：分批式操作半分批式操作（流加式操作）反復(fù)分批式操作反復(fù)半分批式操作連續(xù)式操作第55頁/共69頁深層發(fā)酵操作方法（一）分批發(fā)酵（二）補料分批發(fā)酵法（三）連續(xù)發(fā)酵法

1、開放式連續(xù)發(fā)酵

2、封閉式連續(xù)發(fā)酵第56頁/共69頁（一）分批發(fā)酵

（batchfermentation)

每一批發(fā)酵過程都經(jīng)歷接種、生長繁殖、菌體衰老進而結(jié)束發(fā)酵，最終提取出產(chǎn)物。發(fā)酵工業(yè)常見單罐深層分批發(fā)酵特點：微生物所處的環(huán)境是不斷變化的，可進行少量多品種的發(fā)酵生產(chǎn)，發(fā)生雜菌污染能夠很容易終止操作，當運轉(zhuǎn)條件發(fā)生變化或需要生產(chǎn)新品種時，易改變處理對策，對原料組成要求粗放。第57頁/共69頁遲緩期對數(shù)期穩(wěn)定期衰亡期第58頁/共69頁（二）補料分批發(fā)酵法

(fed-batchfermentation)補料分批發(fā)酵法又稱半連續(xù)發(fā)酵或半連續(xù)培養(yǎng)，是指在分批培養(yǎng)過程中，間歇或連續(xù)地補加新鮮培養(yǎng)基的培養(yǎng)方法。補料分批發(fā)酵法廣泛適用于抗生素、氨基酸、酶制劑、有機酸、高聚物等的生產(chǎn)。與分批發(fā)酵相比，其優(yōu)點在于使發(fā)酵系統(tǒng)中維持很低的基質(zhì)濃度低基質(zhì)濃度優(yōu)點①可以除去快速利用碳源的阻遏效應(yīng)，并維持適當?shù)木w濃度，不致加劇供氧的矛盾②避免培養(yǎng)基積累有毒代謝物第59頁/共69頁（三）連續(xù)發(fā)酵法

(continuousfermentation)

當微生物培養(yǎng)到對數(shù)生長期時，在發(fā)酵罐中一方面以一定速度連續(xù)不斷地流加新鮮液體培養(yǎng)基，另一方面又以同樣地速度連續(xù)不斷地將發(fā)酵液排出，使發(fā)酵罐中微生物的生長和代謝活動始終保持旺盛的穩(wěn)定狀態(tài)，而pH值、溫度、營養(yǎng)成分的濃度、溶解氧等都保持一定，并從系統(tǒng)外部予以調(diào)整，使菌體維持在恒定生長速度下進行連續(xù)生長和發(fā)酵，大大提高發(fā)酵的生長效率和設(shè)備利用率。第60頁/共69頁連續(xù)發(fā)酵類型1、開放式連續(xù)發(fā)酵：培養(yǎng)系統(tǒng)中的微生物細胞隨著發(fā)酵液的流出而一起流出，細胞流出速度等于新細胞生成速度?？墒辜毎麧舛忍幱谀撤N穩(wěn)定狀態(tài)。最后流出的發(fā)酵液如部分返回（反饋）發(fā)酵罐進行重復(fù)使用，則該裝置叫做循環(huán)系統(tǒng)，發(fā)酵液不重復(fù)使用的裝置叫做不循環(huán)系統(tǒng)。第61頁/共69頁（1）單罐均勻混合連續(xù)發(fā)酵：培養(yǎng)液以一定的流速不斷地流加到帶機械攪拌的發(fā)酵罐中，與罐內(nèi)發(fā)酵液充分混合，同時帶有細胞和產(chǎn)物的發(fā)酵液又以同樣流速連續(xù)流出。如果用一個裝置將流出的發(fā)酵液中部分細胞返回發(fā)酵罐，則構(gòu)成循環(huán)系統(tǒng)

單罐連續(xù)發(fā)酵

1－發(fā)酵罐2－分離器第62頁/共69頁（2）多罐均勻混合連續(xù)發(fā)酵將若干攪拌發(fā)酵罐串連起來，就構(gòu)成多罐均勻混合連續(xù)發(fā)酵裝置。新鮮培養(yǎng)液不斷流入第一次發(fā)酵罐，在最后一只罐中流出。多級連續(xù)發(fā)酵可以在每個罐中控制不同的環(huán)境