信號通路與腫瘤發(fā)生II6

TNFNF-κB信號1975年，E.A.Carswell和L.J.Old等人發(fā)現(xiàn)已接種卡介苗的小鼠注射脂多糖后，小鼠血清中產(chǎn)生了一種可引起動物腫瘤組織出血壞死的物質(zhì)，該物質(zhì)對體外培養(yǎng)的多種腫瘤細胞株都具有細胞殺傷作用，于是他們將這種物質(zhì)命名為腫瘤壞死因子（tumournecrosisfactor,TNF）。TNF是迄今發(fā)現(xiàn)的抗腫瘤效果最強的細胞因子?，F(xiàn)在是1頁\一共有44頁\編輯于星期二TNF的發(fā)現(xiàn)1968,Dr.GaleAGrangerfromtheUniversityofCalifornia,Irvine,reportedacytotoxicfactorproducedbylymphocytesandnameditlymphotoxin(LT).[1968，Dr.NancyH.RuddlefromYaleUniversity,whoreportedthesameactivityinaseriesofback-to-backarticlespublishedinthesamemonthandyear.1975Dr.LloydJ.OldfromMemorialSloan-KetteringCancerCenter,NewYork,reportedanothercytotoxicfactorproducedbymacrophages,andnamedittumornecrosisfactor(TNF).BothfactorsweredescribedbasedontheirabilitytokillmousefibrosarcomaL-929cells.現(xiàn)在是2頁\一共有44頁\編輯于星期二TNF的命名1984WhenthecDNAsencodingLTandTNFwerecloned,theywererevealedtobesimilar.ThebindingofTNFtoitsreceptoranditsdisplacementbyLTconfirmedthefunctionalhomologybetweenthetwofactors.

ThesequentialandfunctionalhomologyofTNFandLTledtotherenamingofTNFasTNFαandLTasTNFβ.現(xiàn)在是3頁\一共有44頁\編輯于星期二TNFalphaModel

現(xiàn)在是4頁\一共有44頁\編輯于星期二TNF是一種糖蛋白，它以兩種形式存在：TNF-α和TNF-β。TNF-α由單核細胞和巨噬細胞產(chǎn)生，它可引起腫瘤組織出血壞死，而脂多糖Lipopolysaccharides,LPS）是較強的刺激劑?，F(xiàn)在是5頁\一共有44頁\編輯于星期二單核巨噬細胞系統(tǒng)單核細胞來源粒--單系祖細胞，經(jīng)原單核細胞、幼稚單細胞階段分化成單核細胞，然后由骨髓釋放入血，在血中3~~4天后進入組織和漿膜腔轉(zhuǎn)變成巨噬細胞。二者是相同但在部位不同名稱不一樣，共同構(gòu)成單核巨噬細胞系統(tǒng)。現(xiàn)在是6頁\一共有44頁\編輯于星期二單核-巨噬細胞家族單核-巨噬細胞系統(tǒng)（mononuclearphagocytesystem）包括血液中的單核細胞和組織中固定或游走的巨噬細胞，在功能上都具有吞噬作用。單核-巨噬細胞均起源于骨髓干細胞，在骨髓中經(jīng)前單核細胞分化發(fā)育為單核細胞，進入血液，隨血流到全身各種組織，進入組織中隨即發(fā)生形態(tài)變化，如肝臟中的枯否氏細胞(kupffercell)，肺臟中的塵細胞（dustcells)，結(jié)締組織中的組織細胞（histocytes)，神經(jīng)組織中的小膠質(zhì)細胞（microglialcells)，脾和淋巴結(jié)中的固定和游走巨噬細胞等?，F(xiàn)在是7頁\一共有44頁\編輯于星期二TNF-β是一種淋巴因子，又稱淋巴毒素（lymphotoxin,LT）?？乖蚪z裂原均可刺激T淋巴細胞分泌TNF-β，具有腫瘤殺傷及免疫調(diào)節(jié)功能?，F(xiàn)在是8頁\一共有44頁\編輯于星期二T淋巴細胞定義：表達T細胞受體和CD3復(fù)合物的淋巴細胞。來源于胚肝或骨髓的原T細胞，在胸腺微環(huán)境中分化、發(fā)育，成熟后遷移至外周血，繼而定居于外周淋巴組織，可介導(dǎo)細胞免疫應(yīng)答，并輔助機體針對T細胞依賴性抗原產(chǎn)生體液免疫應(yīng)答。T淋巴細胞來源于骨髓的多能干細胞（胚胎期則來源于卵黃囊和肝）。在人體胚胎期和初生期，骨髓中的一部分多能干細胞或前T細胞遷移到胸腺內(nèi)，在胸腺激素的誘導(dǎo)下分化成熟，成為具有免疫活性的T細胞?，F(xiàn)在是9頁\一共有44頁\編輯于星期二T細胞分類（根據(jù)不同的分類方法）可分為不同亞群（一）初始、效應(yīng)、記憶T細胞從未接受過抗原刺激的成熟T細胞為初始T細胞，接受抗原刺激而活化，分化為效應(yīng)T細胞和記憶T細胞。（二）αβT細胞和γδT細胞根據(jù)表達的TCR類型，T細胞可分為αβ+T即細胞和γδ+T細胞。αβ+T細胞分布廣泛，識別抗原具有MHC限制性，抗原識別受體具有多樣性，既可分化為輔助性T細胞（Th），也可分化為細胞毒性T細胞（CTL）；γδ+T細胞分布于皮膚粘膜組織，識別抗原無MHC限制性，抗原識別受體缺乏多樣性，只識別多種病原體表達的共同抗原，效應(yīng)細胞為CTL.現(xiàn)在是10頁\一共有44頁\編輯于星期二（三）CD4+和CD8+T細胞αβT細胞又可分為CD4+T細胞和CD8+T細胞。CD4+T細胞識別MHCⅡ類分子所提呈的外源性抗原肽，活化后主要分化為Th.CD8+T細胞識別MHCⅠ類分子所提呈的內(nèi)源性抗原肽，活化后主要分化為CTL.（四）Th、CTL和Tr細胞根據(jù)功能可將T細胞分為Th、CTL和調(diào)節(jié)性T細胞（Tr細胞），均為效應(yīng)細胞。Th細胞可分化為Th1、Th2、Th3三類細胞，分別分泌不同的細胞因子，Th1和Th2在細胞和體液免疫中發(fā)揮作用；Th3對免疫應(yīng)答起負調(diào)節(jié)作用。CTL細胞可分化為Tc1和Tc2，分泌細胞因子不同，Tc1與Th1相似；Tc2與Th2相似。Tr細胞參與免疫應(yīng)答的負調(diào)節(jié)及在自身免疫耐受中發(fā)揮作用?，F(xiàn)在是11頁\一共有44頁\編輯于星期二TNF基因人的TNF-α基因長2.76kb，由4個外顯子和3個內(nèi)含子組成，定位在第六號染色體上。人TNF-α前體由233個氨基酸組成，含有76個氨基酸殘基的信號肽現(xiàn)在是12頁\一共有44頁\編輯于星期二TNF多態(tài)性現(xiàn)在是13頁\一共有44頁\編輯于星期二MHC定義：主要組織相容性復(fù)合體，是存在于脊椎動物某一染色體上編碼主要組織相容性抗原的一組緊密連鎖的基因群，與免疫應(yīng)答、免疫調(diào)節(jié)和移植排斥等有關(guān)。ⅰ類和ⅱ類分子是結(jié)構(gòu)相似的細胞膜表面糖蛋白，除作為移植抗原外，還與抗原遞呈及某些疾病相關(guān)。ⅲ類分子包括c2、c4、b因子和腫瘤壞死因子等多種可溶性蛋白質(zhì)，相互間差別很大，與ⅰ類和ⅱ類分子在結(jié)構(gòu)和功能上相關(guān)性很小現(xiàn)在是14頁\一共有44頁\編輯于星期二TNF基因具有多態(tài)性,這種多態(tài)性的標志是TNF及其受體基因內(nèi)的堿基變化,這種變化與一些自身免疫疾病TNF水平特征性增高有密切關(guān)系,尤其是與MHC連鎖的疾病相關(guān)現(xiàn)在是15頁\一共有44頁\編輯于星期二示例1（論文）腫瘤壞死因子基因多態(tài)性對子宮內(nèi)膜異位癥患者血清中TNF濃度的影響目的：研究內(nèi)異癥患者及非內(nèi)異癥婦女腫瘤壞死因子(tumornecrosisfactorsbeta)基因+252位點的多態(tài)性與兩組血清中TNF濃度的關(guān)系方法：PCR－RFLP檢測82例內(nèi)異癥患者(內(nèi)異癥組)和80例非內(nèi)異癥婦女(對照組)檢測兩組血清中TNFa和TNFb的含量結(jié)論：+252位點AA基因型血清中TNFb水平較GG基因型TNFb水平明顯升高現(xiàn)在是16頁\一共有44頁\編輯于星期二示例2腫瘤壞死因子基因多態(tài)性與膿毒癥易感性及預(yù)后間的關(guān)系目的:確定腫瘤壞死因子基因多態(tài)性與膿毒癥易感性及細胞因子產(chǎn)量間的相關(guān)性。方法:采用PCR-RFLP分析正常人群和膿毒癥患者腫瘤壞死因子(TNF)-α啟動子-308位點及TNF-β第一內(nèi)含子+252位點基因的單堿基突變多態(tài)性之間的異同。采用雙抗夾心酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)方法檢測膿毒癥患者血漿TNF-α和白細胞介素6(IL-6)的濃度。結(jié)果:45例膿毒癥患者的TNFB等位基因頻率為67.78%,高于正常對照組的53.33%(P<0.05),結(jié)論:TNF-β第一內(nèi)含子+252位點的等位基因TNFB2與膿毒癥的易感性和體內(nèi)TNF-α、IL-6濃度有關(guān)?，F(xiàn)在是17頁\一共有44頁\編輯于星期二RFLP現(xiàn)在是18頁\一共有44頁\編輯于星期二現(xiàn)在是19頁\一共有44頁\編輯于星期二TNF基因治療1984年起，歐美國家就開始把TNF的基因工程產(chǎn)品應(yīng)用到癌癥臨床治療中，并一度取得轟動的成果，然而最終由于毒副作用嚴重而被迫終止。九十年代末以來，隨著基礎(chǔ)研究的深入和基因工程技術(shù)的發(fā)展，科學(xué)家研制出一些高效、低毒的TNF變構(gòu)體，從而重新確立了TNF在抗腫瘤中的重要地位現(xiàn)在是20頁\一共有44頁\編輯于星期二切除信號肽后形成157個氨基酸的成熟型非糖基化的TNF-α。通過基因工程方法改造后的TNF-α具有更好的生物學(xué)活性和抗腫瘤效果?，F(xiàn)在是21頁\一共有44頁\編輯于星期二分泌蛋白的轉(zhuǎn)運過程

（1）信號肽被信號肽識別粒子（SRP）結(jié)合，SRP把核蛋白體帶至胞膜的胞漿面與對接蛋白結(jié)合，核蛋白體與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜結(jié)合。

（2）信號肽被信號肽酶切割掉，蛋白質(zhì)分泌到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔。

現(xiàn)在是22頁\一共有44頁\編輯于星期二1以TNF基因修飾的腫瘤細胞為瘤苗的主動免疫治療患者自體或同種腫瘤細胞在體外轉(zhuǎn)入TNF基因后,致瘤性消除,仍然保留有免疫原性,注入機體后,可激起機體產(chǎn)生免疫反應(yīng),且對相應(yīng)腫瘤起治療作用.現(xiàn)在是23頁\一共有44頁\編輯于星期二瘤苗相關(guān)報道所謂“瘤苗”，即由科研人員先制備惡性腫瘤治療所需的細胞因子cDNA，將其克隆到安全的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，并包裝成重組的缺陷型逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒，用以感染腫瘤細胞的疫苗。這種“瘤苗”經(jīng)60鈷輻射后，致瘤性消失，而細胞的免疫性則保留，并在一定時間內(nèi)還持續(xù)分泌細胞因子。陳詩書、錢關(guān)祥等潛心10年時間制備的“白介素-2基因工程化胃癌細胞瘤苗”,于2000年10月被SDA批準為可用于臨床試驗的生物制品一類新藥，同意進行8例小樣本臨床試驗。8例晚期癌癥患者經(jīng)過該“瘤苗”2個月的治療和1個月的療效觀察，證實病人接受“瘤苗”治療是安全的、可耐受的，而且病情穩(wěn)定?，F(xiàn)在是24頁\一共有44頁\編輯于星期二2供TNF基因的過繼免疫治療供TNF基因的過繼免疫治療是指利用對腫瘤有免疫力的供者淋巴細胞或患者自身的免疫細胞在體外轉(zhuǎn)入TNF基因活化后、增殖,再輸入患者體內(nèi),使TNF基因在患者體內(nèi)表達,發(fā)揮抗腫瘤作用.現(xiàn)在是25頁\一共有44頁\編輯于星期二3通過對TNF基因的表達調(diào)控,使TNF在腫瘤細胞中高效特異表達調(diào)控TNF基因在腫瘤細胞中特異性表達,可達到定向轉(zhuǎn)移的目的.進入腫瘤細胞中的TNF基因要受到啟動子、增強子等序列的調(diào)控,因此可通過改變或引入有關(guān)特異性序列來實現(xiàn)其定向轉(zhuǎn)移與表達.現(xiàn)在是26頁\一共有44頁\編輯于星期二4將TNF受體基因轉(zhuǎn)入腫瘤細胞,提高腫瘤細胞對TNF的敏感性TNF殺傷腫瘤細胞的主要機制就是TNF與腫瘤細胞表面的受體結(jié)合所形成的內(nèi)在化效應(yīng),對某些腫瘤治療效果不理想.原因是腫瘤細胞缺乏TNF受體,從而對TNF不敏感.故將TNF受體基因轉(zhuǎn)入腫瘤細胞,使不表達或低表達TNF受體的腫瘤細胞表達TNF受體,可提高TNF治療效果.現(xiàn)在是27頁\一共有44頁\編輯于星期二TRADD分子TNFreceptor1associatedviadeathdomain有死亡區(qū)的腫瘤壞死因子受體1相關(guān)蛋白抗原TRADDisanadaptorprotein.TheproteinencodedbythisgeneisadeathdomaincontainingadaptormoleculethatinteractswithTNFRSF1A/TNFR1andmediatesprogrammedcelldeathsignalingandNF-kappaBactivation.ThisproteinbindsadaptorproteinTRAF2,reducestherecruitmentofinhibitor-of-apoptosisproteins(IAPs)byTRAF2,andthussuppressesTRAF2mediatedapoptosis.ThisproteincanalsointeractwithreceptorTNFRSF6/FASandadaptorproteinFADD/MORT1,andisinvolvedintheFas-inducedcelldeathpathway.現(xiàn)在是28頁\一共有44頁\編輯于星期二Signaltransducingadaptorproteinproteinswhichareaccessorytomainproteinsinasignaltransductionpathway.Theseproteinstendtolackanyintrinsicenzymaticactivitythemselvesbutinsteadmediatespecificprotein–proteininteractionsthatdrivetheformationofproteincomplexes.現(xiàn)在是29頁\一共有44頁\編輯于星期二NF-κB的發(fā)現(xiàn)和命名NF-κB（nuclearfactor-kappaB）是1986年從B淋巴細胞的細胞核抽提物中找到的轉(zhuǎn)錄因子，它能與免疫球蛋白kappa輕鏈基因的增強子B序列GGGACTTTCC特異性結(jié)合，促進κ輕鏈基因表達，故而得名。現(xiàn)在是30頁\一共有44頁\編輯于星期二增強子存在于基因組中的對基因表達有調(diào)控作用的DNA調(diào)控元件。位置不定，結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子后，可增強基因表達。現(xiàn)在是31頁\一共有44頁\編輯于星期二KappaCHAINSWhenimmunoglobulinmoleculesareproducedbytheplasmacellsinthebonemarrow,theheavychains(G,A,M,D,orE)andthelightchains(kappaorlambda)areproducedseparately.Thekappaandlambdamoleculesareboundtotheheavychainsandintactimmunoglobulinsareassembled,thentransportedtothesurfaceoftheplasmacell.現(xiàn)在是32頁\一共有44頁\編輯于星期二REL家族它是真核細胞轉(zhuǎn)錄因子Rel家族成員之一，廣泛存在于各種哺乳動物細胞中。迄今為止，在哺乳動物細胞內(nèi)共發(fā)現(xiàn)5種NF-B/Rel家族成員，它們分別是RelA（即p65）、RelB、C-Rel、p50/NF-κB1（即p50/RelA）和p52/NF-κB2。這些成員均有一個約300個氨基酸的Rel同源結(jié)構(gòu)域（Relhomologydomain,RHD）。這個高度保守的結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)Rel蛋白形成同源或異源二聚體，該結(jié)構(gòu)域也是NF-κB與靶基因DNA序列的特異性結(jié)合區(qū)域。現(xiàn)在是33頁\一共有44頁\編輯于星期二細胞內(nèi)NF-κB的活化過程受到精細調(diào)控。通常情況下，在細胞質(zhì)中的NF-κB處于失活狀態(tài)，與抑制蛋白IκB（inhibitoryproteinofNF-κB）結(jié)合成三聚體復(fù)合物?，F(xiàn)在是34頁\一共有44頁\編輯于星期二信號傳遞過程1當(dāng)出現(xiàn)TNF-α信號、炎癥因子以及LPS、紫外線等外界刺激時，細胞因子與細胞膜表面的TNF受體結(jié)合后，TNF受體發(fā)生多聚化并與細胞質(zhì)中TRADD分子發(fā)生相互作用。現(xiàn)在是35頁\一共有44頁\編輯于星期二信號傳遞過程2TRADD招募TRAF（TNFR-associatedfactor）和激酶RIP（receptorinteractingprotein），由RIP將信號傳遞給IKK（IκBkinase）現(xiàn)在是36頁\一共有44頁\編輯于星期二信號傳遞過程3IKK由α、β和γ三個亞基組成，作為激酶的IKK能使IκB的α亞基的Ser32和Ser36殘基和β亞基的Ser19和Ser23殘基磷酸化。IκB隨即從p50/p65/IκB異源三聚體中解離出來，經(jīng)泛素化修飾后通過蛋白酶體降解?，F(xiàn)在是37頁\一共有44頁\編輯于星期二信號傳遞過程4受到IκB抑制的NF-κB得以暴露其核定位序列（nuclearlocalizationsignals,NLS），迅速從細胞質(zhì)進入細胞核內(nèi)，與核內(nèi)DNA上的特異序列相結(jié)合，從而啟動或增強相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄現(xiàn)在是38頁\一共