醫(yī)藥代表中文評估有8-7socs3對骨質(zhì)疏松大鼠

SOCS3對骨質(zhì)疏松大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化的調(diào)[ ]目的探討細(xì)胞信號負(fù)調(diào)控因子3(C3)對骨質(zhì)疏松大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞BMCs)分化的調(diào)控及其在骨質(zhì)疏松中的應(yīng)用。方法建立骨質(zhì)疏松大鼠模型，對BMCs進(jìn)行分離和體外培養(yǎng)，采用SC3小發(fā)夾RAshRA)慢，BMCs。前后，以免疫組化、RTCR及Westemblo檢測細(xì)胞內(nèi)OC3、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄活化因子3TAT3)、βCatenin、過氧化物酶體增殖物激活受體γperoxisomepoleatoactvatedeceptoγ,Rγ及脂聯(lián)素RNA及蛋白的表達(dá)；以EIA檢測前后骨保護(hù)蛋白o(hù)steopotegerin，OP和核因子B受體活化因子配體eceptoractvatorofNF-Bligand，RANK蛋白的含量，比較RANK/OP比值。結(jié)果C3shRA慢后，CS3mRA的表達(dá)被顯著抑制，3的表達(dá)增強(qiáng)，Rγ表達(dá)下調(diào)，脂聯(lián)素水平降低，OPG含量增加，RANKL含量降低，RANK/OPG比值下降<0.05。結(jié)論3可以通過Wnt/βcatenin通路及OP/RANK系統(tǒng)調(diào)控BMCs的分化；下調(diào)C3表達(dá)可以阻斷ARγ對脂聯(lián)素的作用，使脂聯(lián)素水平降低，骨密度增加；抑制骨吸收，減少骨丟失，為骨質(zhì)疏松的發(fā)病機(jī)制提供新的理論依據(jù)，并為該病的治療提供新的靶點(diǎn)。[]細(xì)胞信號負(fù)調(diào)控因子3骨質(zhì)疏松骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄活化因子3過氧化物酶體增殖物激活受體γWntβcatenin通路；脂聯(lián)素；骨保護(hù)蛋白；核因子B受體活化因子配體egaonadmecaimon eeaonofoemarorvedesencylsmcllsinasihoso ]ObjectiveTostudytheregilationandmechanismondifferentiationofbonemarrow-derivedmesenchymalstemcells(BMSCs)inratswithosteoporosis.MethodsTheanimalmodelofporosiswasestablished.BMSCswereisolatedfromtheratsandculturedinvitro.AndtheywereinfectedbyusingSOCS3smallhairRNA(shRNA)lenti .RT-PCR,westernblottingandimmunohistochemistrywereemployedtodeterminetheexpressionofSOCS3,STAT3,β-Catenin,PPAR-γandadiponeetinbeforeandaftertransfection.ThusthelevelofthesetargetswerecheckedbyWestemblot.TheproteincontentofOPGandRANKLEweredetectedbyELISA. SOCS3shRNAlenticouldsignificantlyinhibitthemRNAexpressionofSOCS3.ThentheexpressionofSTAT3increased,andWnt/β-cateninsignalpathwaywasstimulatedtolowertheexpressionofPPAR-γandadiponeetin(P<0.05).Aftertransfection,contentofOPGincreasedandRANKLdecreased(P<0.05).AndthetatioofRANKL/OPGdecreased(P<0.05).ConclusionsSOCS3mayregulatethedifferentiationofBMSCsbyWnt/β-cateninsignalpathway.TransfectionofSOCS3canblocktheroleofPPAR-γonadiponectintodecreasethelevelofadiponeetinandincreasebonemineraldensity.ItmayinhibittheboneabsorbingtodecreasetheloseofbonebyRANKL/OPGsystemItprovidesanewtheoreticalbasisforthepathogenesisofosteoporosis,andanewtargetforthetreatmentofthedisease. t/β-cateninsignalpathway；adiponeetin;OPG;RANKL作用，大量顯示，干細(xì)胞功能與許多疾病的發(fā)生密切相關(guān)[1]。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bonemarrow-derivedmesenchymalstemcell的能力。生理狀態(tài)下，BMCs向成骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞分化，兩者之間保持著動態(tài)的平衡，當(dāng)BMCs向脂肪細(xì)胞分化的能力超過向成骨細(xì)胞分化時導(dǎo)致骨吸收和骨形成失衡，就會導(dǎo)致骨質(zhì)疏松癥等疾病的發(fā)生[2。細(xì)胞信號負(fù)調(diào)控因子3uppessosofcytoknesignaling,OC3)可調(diào)節(jié)多種細(xì)胞因子介導(dǎo)的信號通路，最終影響細(xì)胞的生長、增殖、凋亡等基本生物學(xué)行為，與細(xì)胞增殖和運(yùn)動等信號通路的異?；罨芮邢嚓P(guān)。多項(xiàng)研究表明，Wntβcatenin通路、過氧化物酶體增殖物激活受體γpeoxisomeproleatoactivatedecepto-γ,Rγ、脂聯(lián)素及骨保護(hù)蛋白(osteopotegerin，OP)/核因子B受體活化因子配體eceptoractvatorofNF-Blgand，RANKL系統(tǒng)與骨代謝及骨質(zhì)疏松密切相關(guān)，但OC3與它們及其骨質(zhì)疏松發(fā)病之間的關(guān)系尚未見，本研究通過建立骨質(zhì)疏松大鼠模型，對BMCs進(jìn)行分離和體外培養(yǎng)，探討OC3對BMCs分化的調(diào)控在骨質(zhì)疏松大鼠中的作用機(jī)制，為分子水平治療該病奠定了一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。材料與方實(shí)驗(yàn)動清潔級(SPF)雌性6月齡質(zhì)量(220±6.32)gSD大鼠40只，由大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心提供實(shí)驗(yàn)過程中對動物處置方法符合動物主要試DMEM培養(yǎng)液購自德國PAN-Biotech公司；胎牛、吲哚米沙星、異丁基甲基黃嘌呤購自Sigma公司；SOCS3鼠源性單克隆抗體購自Millipore公司；β-Catenin抗體購自SantaCruz公司；兔抗人總STAT3抗體購自Beyotime公司；PPAR-γ購自SAB公司；LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑購自invitrogenTM公司；PCR逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自TaKaRa大連寶生物公RNA提取采用Invitrogen公司的TRIzol；OPGRANKLELISA檢測試劑盒購自BiomedicaGroup，Windham，NH。實(shí)驗(yàn)方骨質(zhì)疏松大鼠動物模型的建立上述大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1酸100mgkg注射液進(jìn)行腹腔麻醉無菌條件下行雙側(cè)切除術(shù)：大鼠取仰臥位，取大鼠下腹部正中，沿腹臼線切開皮膚肌肉，打開腹腔找出雙側(cè)結(jié)扎其周圍相連血管及然后切除雙側(cè)縫合傷口以75的乙醇腹腔注射青霉素以預(yù)防感3[3]。BMSCs的分離和體外培養(yǎng)無菌條件下取出股骨，置入75%的乙醇中浸泡30s切除兩端骨骺，從一端切口向骨髓腔內(nèi)注入4mLPBS緩沖液，使骨髓從另一端被沖出。將沖出液，用滴管反復(fù)吹打，離心棄10%FBSL-DMEM培養(yǎng)液重懸細(xì)集骨髓細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度至1.0×108/L，接種在培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%CO2二氧化碳培養(yǎng)箱10~14d后棄培養(yǎng)PBS沖洗，加入胰蛋白酶(2.5g/L)消化，待細(xì)胞變圓后加入含的新鮮培養(yǎng)液終止消集細(xì)整細(xì)胞2×108/L接種SOCS3小發(fā)夾RNA(shRNA)慢BMSCsBMSCs懸加入已好的慢shRNA，于37℃、5%CO2培養(yǎng)24h，更換新檢測指標(biāo)shRA慢BMSCs24h后以TRzol提取細(xì)胞總RNA，RTCR檢測前后OC3、3、βCatenin、γ及脂聯(lián)素RNA的表達(dá)情況48h將BMCs單細(xì)胞懸液20BS沖洗后加入40g/mlI及100g/lRNA4℃避光孵育30mn后上流式儀，2瓊脂糖電泳檢測CR產(chǎn)物。cionImage4.03軟件分析CR產(chǎn)物灰度值Westenblot檢測前后各蛋白的表達(dá)情況，以βacn為內(nèi)參。OPG、RANKL蛋白的檢測前后于BMSCs懸液中加入新鮮稀釋的OPG、RANKL蛋白酶標(biāo)抗體ELISA檢測儀上450nm處測OD值，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出含量濃度。均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異結(jié)各的引物序列，見表1引物序列(5′→3′)

F:TCACCCACAGCAAGTTTCCR:GGATGCGTAGGTTCTTGGTC

F:AAGCTCATCTGGCTAGT

R:TTCAATCGGATGGTTCTT

F:ATCTGATTACACCAAAAGTR:

F:TCTACAATTGAGCTGCGTGTGR:GGTCAGGATCTTCATGAGGT

前后BMSCs中各蛋白mRNA的表達(dá)SOCS3素mRNA表達(dá)則明顯下降(P<0.01)，見圖β-β-脂聯(lián)Relatively86420轉(zhuǎn)染前轉(zhuǎn)染圖1前后BMSCs中各蛋白mRNA的表達(dá)情況，與前比較，SOCS3mRNA表達(dá)顯著降低(P<0.05)，STAT3及β-CateninmRNA表達(dá)顯著增強(qiáng)(P<0.05)，PPARγmRNA表達(dá)則明顯下降(P<0.01)前后BMSCs中各PCR定量結(jié)PCR定量結(jié)果顯示，與前比較，SOCS3表達(dá)顯著降低(P<0.05)，STAT3β-Catenin表達(dá)顯著增強(qiáng)(P<0.05)，PPARγ及脂聯(lián)素表達(dá)則明顯下降(P<0.01)，見表2BMSCsPCR定量結(jié)果前后注：vs前各組蛋白在BMSCs中的免疫SOCS3、STAT3及脂聯(lián)素主要表達(dá)于BMSCs細(xì)胞胞漿，β-catenin及PPARγ主要表達(dá)于細(xì)胞核，前，BMSCs細(xì)胞胞漿可見大量SOCS3及脂聯(lián)素陽性染色細(xì)胞，細(xì)胞核可見大量PPARγ陽性染色細(xì)胞；后SOCS3、脂聯(lián)素及PPARγ陽性顆粒均顯著減少(P<0.05)。與前相比，BMSCs細(xì)胞胞漿內(nèi)STAT3及β-Catenin陽性染色細(xì)胞顯著增強(qiáng)多(P<0.05)，見圖1-5 1免疫組化檢測SOCS3 2免疫組化檢測STAT3 3免疫組化檢測β-Catenin 4免疫組化檢測PPARγ 5前后BMSCs中的OPGRANKL含量及RANKL/OPG比前后BMSCs中OPGRANKL含量及RANKL/OPG比值顯著減少前后BMSCs中OPGRANKL含量及RANKL/OPG比值項(xiàng) 0.35±0 0.47±0 討研究表明，BMMSC的功能異常在骨質(zhì)疏松的發(fā)生中發(fā)揮了重BMSCs定向分化的研究一直是干細(xì)胞研究的熱點(diǎn)。大量體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)促進(jìn)脂肪細(xì)胞生成因子表達(dá)會抑制成骨細(xì)胞[2]γ(peoxisomepolieatoactvatedeceptorγ,Rγ)是一種核激素受體超成員是脂肪生成的主要調(diào)節(jié)因子是調(diào)節(jié)脂肪形成的細(xì)胞因子和信號途徑共同作用的最終環(huán)節(jié)[5]。PARγ激活后調(diào)控脂質(zhì)代謝的如脂蛋白酯酶(LL，Lipopoteinlipase)、脂肪酸合成酶(ASattyacidssynthase)表型，同時可抑制BMCs向成骨細(xì)胞分化，促進(jìn)其向脂肪細(xì)胞分化[6]多項(xiàng)顯示，WntβCatenin通路可能在BMCs自我更新和定向調(diào)控中具有重要作用，該通路可促使BMCs向成骨細(xì)胞分化，抑制其向脂肪細(xì)胞分化[7，同時激活Wnt通路可Rγ表達(dá)，抑制脂肪細(xì)胞生成，相反Rγ誘導(dǎo)可抑制該信號通路[8。SOCS3是信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄活化因子(Signaltransductionandactivatorsoftranscription,STAT)信號通路的負(fù)調(diào)控因子，我們推測如果下調(diào)SOCS3的水平，可以增強(qiáng)STAT3的表達(dá)，從而Wnt/β-catenin通路的傳導(dǎo)。慢可以高效期和裂期細(xì)胞,并且可以整合到宿主細(xì)胞的組來長期表達(dá)[9]，我們的實(shí)驗(yàn)通過采用已經(jīng)構(gòu)建的慢表達(dá)載體來抑制BMSCs中SOCS3的表達(dá)結(jié)果顯示，慢后SOCS3mRNA及蛋白的表達(dá)被顯著抑制提示該慢病毒可有效干擾BMSCsSOCS3(P<0.05)。另外，實(shí)驗(yàn)結(jié)果還顯示，與慢前比較，STAT3及β-cateninmRNA及蛋白的表達(dá)顯著增強(qiáng)(P<0.05)，證實(shí)了由于SOCS3STAT信號通路的負(fù)調(diào)控因子，SOCS3表達(dá)下降，STAT3表達(dá)則增強(qiáng)；又因STAT3Wnt/β-catenin通路，使β-catenin表達(dá)增強(qiáng)。與此同時，我們推測由于激活的Wnt通路了PPARγ的表達(dá)，因此PPARγ在慢后的mRNA及蛋白的表達(dá)水平則較前顯著降低(P<0.05)。Rγ不僅調(diào)控脂代謝過程中一些關(guān)鍵酶的表達(dá)，還調(diào)節(jié)脂肪細(xì)白質(zhì)的分泌，如瘦素leptin)、Nα、胰抵抗素esistin、脂聯(lián)素adiponeetn)等[10]子，是脂肪細(xì)胞分泌的一種內(nèi)源性生物活性多肽或蛋白質(zhì)，脂肪細(xì)胞可特異性地高表達(dá)脂聯(lián)素。最近發(fā)現(xiàn)，脂聯(lián)素可能是骨代謝的調(diào)前顯著降低(P<0.05)，推測由于后PPARγ表達(dá)水平下降，減平，增加骨密度，達(dá)到治療骨質(zhì)疏松的目的研究表明，骨保護(hù)蛋白o(hù)steoprotegein，OP)和核因子B受體活化因子配體(eceptoractvatorofNF-Blgand，RANKL)參與了成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞之間的動態(tài)平衡，且OP、RANKL之間的比例在破骨細(xì)胞的形成和功能及骨形成和骨吸收上起著重要的調(diào)節(jié)作用2]。在BMSCs向成骨細(xì)胞分化的過程中，RANKL/OPG的比值不斷化，該比值隨著成骨細(xì)胞的分化成熟而逐漸縮小，從而喪失促進(jìn)破骨細(xì)胞分化和激活的功能，使骨吸收和骨形成兩個過程緊密相連并達(dá)到平衡[13。Mille[14]，皮射外源性O(shè)P藥物可顯著降低絕經(jīng)后婦女的骨轉(zhuǎn)換標(biāo)志物水平，增加其骨密度。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，BMCs慢后，其OP含量顯著增加，RANK含量則顯著減少<0.05，同時RANKL/OPG比值顯著縮小(<0.05，骨吸到抑制，骨丟失也因之減少。另外，由于由此推測OC3還可能通過調(diào)控OPG/RANKL系統(tǒng)調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞與破骨細(xì)胞、骨形成及骨吸收之間的動態(tài)變化，從而調(diào)節(jié)骨代謝。綜上所述，C3可以通過Wntβcatenin通路調(diào)控BMCs的分化；下調(diào)C3表達(dá)可以阻斷ARγ對脂聯(lián)素的作用，使脂聯(lián)OC3還可能通過調(diào)控OPG/RANKL參考文RossiDJ，JamiesonCH，WeissmanIL.Stemscellsandthepathwaystoagingandcancer[J].Cell,2008,132(4):681-696MahajanA,StahlCH.Dihydroxy-cholecalciferolstimulatesadipocyticdifferentiationofporcinemesenchymalstemcells[J].JNutrBiLiLiang.TheEffectofmechanicalstimulationontheosteoblastfromosteoporoticrat.(cellular-molecularbasisresearch)SichuanUniversity,Chengdu:GraduateCollegeofSichuanUniversity,2004:28MuruganandanS，RomanAA，SinalCJ.Adipocyteonofbonemarrow-derivedmesenchymalstemcells:crosstalkwiththeosteoblastogenicprogram[J].CellMolLifeSci,2009,66(2):236-3RosenED,MacdougaldOA.Adipocytedifferentiationfromtheinsideout[J].NatRevMolCellBiol,2006,7(12):885-896TakadaI,KouzmenkoAP,KatoS.Molecularswitchingofosteoblastogenesisversusadipogenesis:Implicationsfortargetedtherapies[J].ExpertOpinTherTargets,2009,13(5):593-603ChenY,AlmanBA.Wntpathway,anessentialroleinboneregeneration[J].CellBiochem,2009,106(3):353-362[9]TakadaI,KouzmenkoAP,KatoS.WntandPPARg alinginosteoblastogenesisandadipogenesis[J].NatRevRheumatol,[8]PfeiferA,EigenbrodS,Al-KhadraS,etal.Lentivector-dRNAiefficientlysu