幾種分子遺傳標記技術

幾種分子遺傳標記技術第1頁，共27頁，2023年，2月20日，星期三動物遺傳標記課程作業(yè)分子遺傳標記概述1主要分子標記技術4分子遺傳標記優(yōu)越性2分子遺傳標記分類3幾種分子標記的比較5第2頁，共27頁，2023年，2月20日，星期三

分子遺傳標記概述20世紀70年代以來，隨著分子生物學的發(fā)展，相繼建立了RFLP、RAPD、AFLP、SNP、SSCP等分子遺傳標記檢測技術。

分子遺傳標記（MolecularGeneticMarkers）是以個體遺傳物質內核苷酸序列變異為基礎的遺傳標記，是DNA水平遺傳多態(tài)性的直接的反映。動物遺傳標記課程作業(yè)第3頁，共27頁，2023年，2月20日，星期三多為共顯性在生物發(fā)育的不同階段，不同組織的DNA都可用于標記分析表現為中性，不影響目標性狀的表達基因組變異極其豐富，分子標記的數量幾乎是無限的檢測手段簡單快捷，易于實現自動化動物遺傳標記課程作業(yè)分子遺傳標記的優(yōu)越性第4頁，共27頁，2023年，2月20日，星期三

分子遺傳標記的分類動物遺傳標記課程作業(yè)Southern雜交為核心的分子標記，如RFLPDNA芯片技術為基礎分子標記，如SNPPCR技術為基礎的分子標記，如RAPDPCR與酶切技術結合的分子標記，如AFLP分子標記第5頁，共27頁，2023年，2月20日，星期三

主要的分子遺傳標記

原理：用限制性內切酶切割基因組DNA后，基因組DNA在檢測區(qū)域內發(fā)生了重排、插入、缺失或點突變，導致酶切位點發(fā)生改變，從而形成了大小不等、數量不同的酶切片段，當這些片段通過凝膠電泳時就形成不同的帶，用分子探針雜交并利用放射自顯影成像時，不同程度的RFLP譜帶表示其多態(tài)性。動物遺傳標記課程作業(yè)1、RFLP（RestrictionFragmentLengthPolymorphism）

限制性片段長度多態(tài)性第6頁，共27頁，2023年，2月20日，星期三動物遺傳標記課程作業(yè)第7頁，共27頁，2023年，2月20日，星期三RFLP的優(yōu)點樣品純度要求較高，樣品用量大；多態(tài)信息含量低；步驟繁瑣、工作量大、成本較高。動物遺傳標記課程作業(yè)較高的可靠性；標記數目是無限的；標記為共顯性；標記之間無干擾；不受年齡性別以及外界環(huán)境的影響。RFLP的缺點第8頁，共27頁，2023年，2月20日，星期三RFLP的應用分子水平上選擇目的性狀進行品種或品系遺傳純度的測定改良回交育種技術生物進化和分類疾病診斷方面的應用特別適應于構建遺傳連鎖圖動物遺傳標記課程作業(yè)第9頁，共27頁，2023年，2月20日，星期三2、AFLP

(Amplified

Restriction

Fragment

Polymorphism)

擴增片段長度多態(tài)性:原理：基因組DNA經兩種限制性內切酶酶切，形成分子量大小不等的隨機酶切片段，將特定的人工合成的短的雙鏈接頭連在這些片段的兩端，形成一個帶接頭的特異片段，用含有選擇性堿基的引物對摸板DNA進行擴增。擴增產物經放射性同位素標記、聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，然后根據凝膠上擴增產物的多態(tài)性來檢出多態(tài)性。動物遺傳標記課程作業(yè)第10頁，共27頁，2023年，2月20日，星期三動物遺傳標記課程作業(yè)第11頁，共27頁，2023年，2月20日，星期三AFLP的優(yōu)點動物遺傳標記課程作業(yè)多態(tài)性豐富且清晰可辨，一次AFLP分析可檢測到100~150個標記；被認為是指紋圖譜技術中多態(tài)性最豐富的一項技術；可靠性好，重復性高；DNA需要量少；引物在不同物種間是通用的；AFLP分析的擴增片段較短（30-700bp)，分辨率高。AFLP的缺點對DNA模板質量要求高，對其濃度變化不敏感；顯性標記，只能表明目的條帶的有無，不能區(qū)分純合子和雜合子；操作復雜，耗時，成本高。第12頁，共27頁，2023年，2月20日，星期三AFLP的應用

動物遺傳標記課程作業(yè)遺傳圖譜的構建；基因標記及定位；種及種下階元的分類鑒定；遺傳距離及雜種優(yōu)勢的利用；遺傳多樣性和系統進化的研究。第13頁，共27頁，2023年，2月20日，星期三3、SSCP（SingleStrandConformationPolymorphism)

單鏈構象多態(tài)性

單鏈構象多態(tài)性檢測是一種基于單鏈DNA構象差別來檢測點突變的方法。原理：單鏈DNA分子內的相互作用力使其呈現復雜的空間折疊構象，當有一個堿基發(fā)生改變時，其空間構象發(fā)生變化，這些空間構象存在差異的單鏈DNA分子在凝膠中受排阻大小不同。因此，通過電泳可以將構象上有差異的分子分離開，形成了單鏈構象多態(tài)性。動物遺傳標記課程作業(yè)第14頁，共27頁，2023年，2月20日，星期三動物遺傳標記課程作業(yè)第15頁，共27頁，2023年，2月20日，星期三動物遺傳標記課程作業(yè)

SSCP的優(yōu)點操作簡便，實驗步驟少，周期短；具有高的靈敏性，僅單個堿基差異亦可檢測出來，拓展了檢測范圍；能得到更多的圖譜信息，更詳細的分型結果。SSCP的缺點只能作為突變檢測方法，要確定突變的位置和類型，還需進一步測序；受外界影響較大，電泳條件要求較嚴格；易造成漏檢。第16頁，共27頁，2023年，2月20日，星期三SSCP的應用動物遺傳標記課程作業(yè)基因點突變的監(jiān)測大量樣本的篩選

cDNA的篩查檢測人類遺傳性疾病病毒的分型和分類保種和育種第17頁，共27頁，2023年，2月20日，星期三4、RAPD（RandomamplifiedpolymorphismDNA）

隨機擴增多態(tài)性DNA原理：以基因組DNA為模板，以單個人工合成的隨機多態(tài)核苷酸序列（通常為10個堿基對）為引物，在Taq酶作用下，進行PCR擴增。擴增產物經凝膠電泳分離、溴化乙錠染色后，在紫外透視儀上檢測多態(tài)性。擴增產物的多態(tài)性反映了基因組的多態(tài)性。動物遺傳標記課程作業(yè)第18頁，共27頁，2023年，2月20日，星期三動物遺傳標記課程作業(yè)第19頁，共27頁，2023年，2月20日，星期三RAPD的優(yōu)點引物可隨機合成和隨機選定，長度一般為9-10bp；不同生物基因組可以共用一套引物；退火溫度低，一般為36℃，允許適當的錯配；每個RAPD反應中，僅加單個引物，就可通過引物和模板DNA隨機配對實現擴增，擴增無特異性；RAPD分析所需的DNA樣品量極少。動物遺傳標記課程作業(yè)RAPD的缺點重復性差，易受到各種因素的影響；標記呈顯隱性遺傳。第20頁，共27頁，2023年，2月20日，星期三5、TRS（TandemRepeatedSequence)

串聯重復序列標記微衛(wèi)星DNA又稱簡單序列重復(SampleSequenceRepeats，SSR)，廣泛存在于真核生物基因組中，以1~6個堿基為核心序列，首尾相連組成的串聯重復序列。動物遺傳標記課程作業(yè)小衛(wèi)星（MinisatelliteDNA)微衛(wèi)星（MicrosatelliteDNA）第21頁，共27頁，2023年，2月20日，星期三動物遺傳標記課程作業(yè)原理：每個微衛(wèi)星兩側一般是相對保守的單拷貝序列，據此可設計專一引物，通過PCR技術擴增微衛(wèi)星片段，擴增產物經凝膠電泳分離后，不同個體間因核心序列的重復次數不同而產生DNA多態(tài)性。

單拷貝序列在單倍體基因組中只出現一次，但儲存了巨大的遺傳信息，可以編碼各種不同功能的蛋白質，因此對這些序列的研究有特別重要的意義。

第22頁，共27頁，2023年，2月20日，星期三動物遺傳標記課程作業(yè)第23頁，共27頁，2023年，2月20日，星期三動物遺傳標記課程作業(yè)數量多且均勻分布在基因組中；具有豐富的多態(tài)性；等顯性遺傳，因此檢測可以顯示純合子和雜合子；檢測容易、重復性較好、省時，適合于進行自動化分析。微衛(wèi)星DNA的優(yōu)點微衛(wèi)星DNA的缺點相對的物種專一性；開發(fā)困難，費用較高，耗時長；實際分析時一般每次只分析單個位點；不同引物退火溫度不同，需要探索。第24頁，共27頁，2023年，2月20日，星期三個體及親緣關系鑒定種群(品種、品系)內遺傳純度和彼此之間遺傳距離構建遺傳連鎖圖譜定位功能基因及QTL雜交優(yōu)勢預測群體遺傳結構分析及遺傳關系的分析在標記輔助選擇和標記輔助導入等方面的研究監(jiān)測育種和遺傳操作效應親子鑒定、胚胎移植、混合受精、親緣關系分析動物遺傳標記課程作業(yè)微衛(wèi)星DNA的應用第25頁，共27頁，2023年，2月20日，星期三6、SNP（SingleNucleotidePolymorphism)

單核苷酸多態(tài)性標記概念：SNP指染色體上某個位點單個核苷酸的變異，包括轉換、顛換、缺失或插入等。

特性：高密度；代表性；易實現自動化分析，標記為雙等位標記。動物遺傳標記課程作業(yè)第26頁，共27頁，2023年，2月20日，星期三SNP的應用人類基因單體型圖的繪制描述人類常見的遺傳多態(tài)性模式和染色體上具有