青蒿素的制備課件

青蒿素(Artemisinin)的研究2012-11-052011年，屠呦呦在美國(guó)紐約舉行的拉斯克獎(jiǎng)?lì)C獎(jiǎng)儀式上領(lǐng)獎(jiǎng)。黃花蒿ArtemisiaannuaL.青蒿素研究歷史青蒿素的結(jié)構(gòu)與抗瘧機(jī)理生物合成青蒿素?fù)?jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)2011年世界瘧疾報(bào)告數(shù)據(jù)，2010年全球106個(gè)瘧疾流行國(guó)家和地區(qū)共有2.16億瘧疾病例，死亡65.5萬(wàn)人，其中86％的受害者是5歲以下的兒童。2008年全球瘧疾流行分布圖20世紀(jì)60年代為了援外和戰(zhàn)備緊急任務(wù)的需要針對(duì)瘧疾防治的要求，國(guó)家科委、中國(guó)人民解放軍總后勤部于1967年5月23日召開(kāi)了瘧疾防治藥物研究工作協(xié)作會(huì)議組織全國(guó)有關(guān)衛(wèi)生、醫(yī)藥、科研、醫(yī)療、教學(xué)、生產(chǎn)的60多個(gè)單位的500多位研究開(kāi)展抗瘧新藥的研究(即523項(xiàng)目任務(wù))。幾種可能的抗瘧機(jī)制：青蒿素類(lèi)衍生物含有過(guò)氧化橋結(jié)構(gòu)，在Fe(Ⅱ)或者其他還原性物質(zhì)作用下產(chǎn)生一些活性中間體(包括自由基、Fe(IV)=O、親電中間體和活性氧等)．這些中間體通過(guò)過(guò)氧化膜脂質(zhì)、干擾線粒體的功能、烷基化、與瘧原蟲(chóng)的蛋白質(zhì)作用等途徑殺死瘧原蟲(chóng)．在硫酸亞鐵或鐵蛋白的催化下裂解產(chǎn)生自由基，攻擊瘧原蟲(chóng)細(xì)胞膜和胞內(nèi)膜結(jié)構(gòu)，或直接氧化破壞膜蛋白質(zhì)分子導(dǎo)致細(xì)胞死亡；當(dāng)青蒿素產(chǎn)生自由基后，在烷化底物存在時(shí)還能以共價(jià)鍵的方式與瘧原蟲(chóng)蛋白質(zhì)結(jié)合，使瘧蛋白烷基化青蒿素顯著抑制瘧原蟲(chóng)細(xì)胞內(nèi)的PfATP6酶活力(瘧原蟲(chóng)體內(nèi)唯一的SERCA型鈣離子調(diào)節(jié)酶)，干擾能量代謝。青蒿素還可能開(kāi)放白細(xì)胞膜上的離子通道，使細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度升高而激活卡配因，導(dǎo)致胱冬酶非依賴(lài)性細(xì)胞脹亡；青蒿素作用于瘧原蟲(chóng)和某些腫瘤細(xì)胞，能減少鉀離子內(nèi)向流動(dòng)，使細(xì)胞線粒體跨膜電位下降，導(dǎo)致促凋亡物質(zhì)釋放，激活胱冬酶導(dǎo)致細(xì)胞死亡；青蒿琥酯作用于HL-60早幼粒白血病細(xì)胞，抑制生存蛋白的基因表達(dá)。生物代謝：青蒿素的生物合成途徑屬于植物類(lèi)異戊二烯代謝途徑。近年來(lái)的研究表明，植物類(lèi)異戊二烯的生物合成至少存在兩條途徑，即細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的甲羥戊酸途徑(MVA途徑)和質(zhì)體內(nèi)的丙酮酸/磷酸甘油醛途徑。青蒿素等倍半萜類(lèi)的生物合成途徑屬于甲羥戊酸途徑。*甲羥戊酸途徑（Mevalonatepathway）是以乙酰輔酶A為原料合成異戊二烯焦磷酸(IPP)和二甲烯丙基焦磷酸(DAMPP)的一條合成代謝途徑，存在于所有高等真核生物和很多病毒中。該途徑的產(chǎn)物可以看作是活化的異戊二烯單位，是類(lèi)固醇、類(lèi)萜等生物分子的合成前體。生物合成青蒿素的研究1從乙酰輔酶A到法尼基焦磷酸(FPP)*為關(guān)鍵酶甲羥戊酸代謝反應(yīng)式*Towler和Weathers用兩種化學(xué)試劑分別抑制MVA途徑和MEP途徑，然后分析青蒿素含量的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，這兩個(gè)異戊烯焦磷酸(IPP)合成途徑被抑制后，青蒿素的含量都顯著降低。這表明，青蒿素生物合成所需的IPP前體有MVA途徑和MEP途徑共同提供，胞質(zhì)里面的IPP和質(zhì)體里面的IPP可以相互補(bǔ)償。從天然產(chǎn)物中萃取化學(xué)合成法生物法青蒿素的制備方法培育高產(chǎn)青蒿素的轉(zhuǎn)基因青蒿通過(guò)調(diào)節(jié)激素及發(fā)育基因表達(dá)促進(jìn)青蒿素合成在微生物(酵母)體內(nèi)合成青蒿素在異種植物(煙草)體內(nèi)合成青蒿素青蒿細(xì)胞的培養(yǎng)代謝工程：通過(guò)基因工程的方法，人為在DNA分子水平上，改變和控制細(xì)胞的代謝，使目的產(chǎn)物大量生成。即利用重組DNA技術(shù)，對(duì)生物細(xì)胞內(nèi)固有代謝途徑進(jìn)行定向改造，賦予細(xì)胞新的代謝途徑或增強(qiáng)已存在的代謝途徑，盡可能的提高目的代謝產(chǎn)物的代謝產(chǎn)率。酵母內(nèi)合成青蒿素與青蒿一樣，酵母是真核生物、存在糖酵解過(guò)程以及甲羥戊酸途徑，但是酵母的生長(zhǎng)代謝速率較青蒿要高出許多，而且其培養(yǎng)條件容易控制。所以相比青蒿，酵母體內(nèi)合成更高效、高產(chǎn)。1JayDKeasling.EngineeringamevalonatepathwayinEscherichiacoliforproductionofterpenoids.NatureBiotechnology,2003,21:796-8022JDKeasling.Productionoftheantimalarialdrugprecursorartemisinicacidinengineeredyeast.Nature,2006,

440:940-9433PCovello.MolecularcloningofanaldehydedehydrogenaseimplicatedinartemisininbiosynthesisinArtemisiaannua.Botany,2009,87:635–642PatrickCovelloNRCPlantBiotechnologyInstituteJayDKeaslingBerkeley,CA,USA*在表達(dá)了CYP71AV1和CPR的S.cerevisiae菌株EPY224中設(shè)計(jì)的青蒿酸生物合成路徑示意圖

摘自JDKeasling“抗瘧藥物前體青蒿酸在工程菌中的生產(chǎn)”，Nature,2006,

440:940-943得到青蒿中這種特異的細(xì)胞色素P450基因步驟如下：高度特異的簡(jiǎn)并引物青蒿毛狀體細(xì)胞的互補(bǔ)DNA庫(kù)＋PCR、凝膠電泳回收等幾個(gè)特定的p450片段一個(gè)青蒿P450基因片段與之對(duì)應(yīng)的mRNA完整P450cDNA（CYP71AV1）

RT-PCR

轉(zhuǎn)錄BLAST分析法將這些片段與向日葵和萵苣的ESTｓ比對(duì)，我們驚奇地發(fā)現(xiàn)有一個(gè)青蒿P450基因片段與來(lái)自以上兩種植物的未知功能ESTs序列非常相似