內(nèi)生菌多樣性

其次章水稻真菌的分別1.樣品采集樣品采集后用保鮮袋包好，置于保溫盒中帶回，在采集后4h內(nèi)進(jìn)行處理。每個晶種隨機(jī)取樣10株，每株水稻分別剪成小段，隨機(jī)選取10個根、葉片剪斷進(jìn)行內(nèi)生真菌的分別。2培育基Q）水瓊脂（分別植物內(nèi)生真菌）瓊脂（廣東湛江產(chǎn)）12g,水1000mle（2）PDA培育基（主要用于分別培育植物內(nèi)生真菌馬鈴慧（去皮）200g葡萄糖10-20g蒸儲水1000ml固體培育基加入1.6-2.0%瓊脂。以上培育基用于分別時加50ug/ml氯霉素或50ug/ml硫酸鏈霉素十50ug/ml氨莘毒霉素全都細(xì)菌生長。2.1植物內(nèi)生真菌的分別表面消毒按Schulzetal,(1993)的方法進(jìn)行。將采集的水稻根、莖葉樣品在自來水下沖洗，除去表面附著的塵土與泥沙，晾干。樣品先在36%甲醛溶液中表面消毒Imin,無菌水沖洗3次。晾干后將樣品剪成1cm長片段，各處理均隨機(jī)選取100個片段平鋪于PDA(1.0%瓊脂評板上,加入氯霉素與鏈霉素各50ug/ml抑制細(xì)菌的生長,在26℃培育5—7do長出的真菌菌經(jīng)過幾次純化后保存于PDA斜面上。取最終一次清洗的無菌水涂布平板,26。＜：培育14d后無菌落長出以驗證消毒是否完全。2.2真菌的鑒定采納載波片培育法：向無菌栽玻片上滴加一滴PDA瓊脂或其他培育基(60℃),待培育基凝固后，在邊緣接入欲鑒定的真菌培育物，蓋上無菌蓋玻片，移入無菌培育皿中，用塑料袋密封，塑料袋內(nèi)放入含水紗布，以避開培育基干澡。長出菌絲后，在顯微鏡下觀看，依據(jù)《真菌鑒定手冊》(魏景超，1979)將真菌鑒定至屬2.3內(nèi)生真菌培育及代謝物提取分別到的內(nèi)生真菌斜面培育物經(jīng)活化后分別接種至100ml液體PDA培育基,27℃Jg床上以160rpm的轉(zhuǎn)速培育7-10d后，用紗布過濾分開菌絲體與發(fā)酵液，菌絲體用適量丙酮浸泡(沒過菌絲體)抽提菌絲體代謝物，將丙酮減壓蒸干后，用2.0ml甲醇溶解代謝物：發(fā)酵液用等體積乙酸乙酯萃取，取乙酸乙酯層使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀分別減壓蒸儲、濃縮干燥后，用2.0ml甲醇溶解代謝產(chǎn)物。水稻放線菌的分別1樣品的采集--與真菌一樣2培育基3水稻內(nèi)生放線菌的分別樣品表面消毒方法參考阮繼生等(1990)分別弗蘭克氏菌和CoombsJ.T.(2002)分別小麥根內(nèi)生放線菌采納的方法。將采集的水稻根、莖葉樣品在流水下沖洗，除去表面附著的塵土與泥沙，晾干。剪成小段一70%的乙醇溶液浸泡5min--0.87%NaCLO溶液(漂白粉)浸泡10min--10%無菌的NaHC03溶液浸泡10min,這樣能破壞樣品表面結(jié)構(gòu)并抑制內(nèi)生真菌的生長。取出晾干后將樣品剪成1cnl長的片段，各處理均隨機(jī)選取100個片段鋪于S培育基(1.0%瓊脂)的平板上,26.28℃條件下培育。長出的放線菌菌落經(jīng)過純化后保存于S斜面上。S培育基溶化倒平板時分別加入25ppm高鎰酸鉀和15Ppm奈咤酮酸以抑制真菌和其它細(xì)菌的生長。表面消毒效果檢查，參考宋子紅等(1999)的方法進(jìn)行。此外采納了Schulzetal.,(1993)的存活試驗方法觀看表面消毒效果。2放線菌的形態(tài)鑒定采納埋片培育法：將高氏一號合成培育基平板(內(nèi)生放線菌用)中間平行開兩道槽，將放線菌沿槽邊緣接種，將滅菌的載玻片沿與槽垂直方向貼在平板上，26。(：培育，一周后取下載玻片在顯微鏡下觀看，按《放線菌分類與鑒定》（閻遜初，1992）鑒定至屬，重要菌株通過16srDNA序列分析確定種類。3內(nèi)生放線菌的驗證及其在植物體內(nèi)的分布回接分別試驗：將分別到的內(nèi)生放線菌接種于YEME液體培育基中,27。（：振蕩培育三天，用此菌液接種水稻無菌組培苗的根部，培育10.14d后，參考曹抱負(fù)等（2003）方法,表面消毒后從幼苗的根、莖、葉中再次分別該內(nèi)生放線菌，以驗證其的確屬于水稻內(nèi)生菌。掃描電鏡觀看：以戊二醛固定剖開的水稻幼苗根、莖桿和葉片4h以上；PBS沖洗4次，每次20min;30%酒精、50%酒精、70%酒精、90%酒精依次15min;100%丙酮（加無水CaCI2）二次，每次15min,醋酸異戊酯（加無水CaCI2）二次，每次15mino前處理后采用掃描電鏡觀看被接種水稻植株中內(nèi)生菌的定植及分布狀況。水稻細(xì)菌的分別培育1樣品的采集采集水稻苗，用自來水清洗整個幼苗。取莖和葉晾干后將其剪成4一5cm長的小段放入滅菌燒杯中冼用75%乙醇浸泡5min，后加入0.2%升汞溶液（或酒精浸泡10min、升汞8min處理后的消毒滅菌效果最佳）置燒杯于磁力攪拌器上攪動消毒5min或8min,然后加入無菌水，磁力攪拌器攪動清洗,洗滌5次,每次5mine把處理好的材料放到己滅菌的研缽中，加入適量無菌水，充分研磨材料，使其成黏糊狀。而后取200uL上清液涂布于LB平板上,37P恒溫培育2-3d。表面消毒是否完全。取最終一次清洗的無菌水涂布平板以驗證消毒是否完全。依據(jù)水稻組織不同生長期，水稻根用0.2%的升汞消毒10min,12min理條件同上。挑取平板上長出的單菌落，經(jīng)純化后的內(nèi)生細(xì)菌用含25%甘油的LB液體培育基,一70度保存?zhèn)溆谩?菌種鑒定內(nèi)生菌種類鑒定鏡檢：菌種鑒定，用革蘭氏染色先觀看菌種形態(tài)，然后是芽泡染色（孔雀綠染色法）。鏡檢依據(jù)芽泡桿菌的菌落形態(tài)：圓形或