轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)原理及應(yīng)用

RNA測(cè)序技術(shù)原理及應(yīng)用現(xiàn)在是1頁\一共有53頁\編輯于星期日遺傳的中心法則基因組—轉(zhuǎn)錄組—表觀遺傳組—蛋白組層次現(xiàn)在是2頁\一共有53頁\編輯于星期日什么是轉(zhuǎn)錄組？All

transcripts

All

mRNAs現(xiàn)在是3頁\一共有53頁\編輯于星期日RNA是解讀基因組的關(guān)鍵RNAProteinPhenotypeGenotype

DNA現(xiàn)在是4頁\一共有53頁\編輯于星期日測(cè)序技術(shù)RNA-SeqSmallRNA測(cè)序降解組測(cè)序Non-codingRNA測(cè)序研究對(duì)象mRNASmallRNAmRNANon-codingRNA鑒定新分子OOOO表達(dá)譜研究OOOO基因結(jié)構(gòu)分析O/XXXOEST測(cè)序O/XXXX

篩選分子標(biāo)記

OOOX轉(zhuǎn)錄融合基因表達(dá)O/XXXXRNA測(cè)序技術(shù)現(xiàn)在是5頁\一共有53頁\編輯于星期日WorkflowofRNA-Seq樣品檢測(cè)文庫制備ClusterStationIlluminaSequencing生物信息分析現(xiàn)在是6頁\一共有53頁\編輯于星期日TotalRNA樣品檢測(cè)

Agilent2200檢測(cè)OD260/280:1.8~2.2RNA28S:18S≥1.0;RIN≥7

新型安捷倫2200TapeStation

系統(tǒng)是新一代測(cè)序（NGS）、生物微陣列芯片分析和qPCR工作流程以及蛋白質(zhì)純化和抗體生產(chǎn)過程中對(duì)生物樣品進(jìn)行質(zhì)量控制（QC）的理想解決方案。●

可擴(kuò)展的通量—16聯(lián)或96孔微量滴定板●

快速得到結(jié)果—平均每個(gè)樣品只需一分鐘便可獲得結(jié)果●

使用簡單—可直接使用的ScreenTape預(yù)制膠條簡化了工作流程●

樣品用量少—每次運(yùn)行僅需要不到2ul樣品現(xiàn)在是7頁\一共有53頁\編輯于星期日檢測(cè)報(bào)告-合格樣品棉鈴蟲/果蠅現(xiàn)在是8頁\一共有53頁\編輯于星期日檢測(cè)報(bào)告-不合格樣品現(xiàn)在是9頁\一共有53頁\編輯于星期日WorkflowofRNA-Seq樣品檢測(cè)文庫制備ClusterStationIlluminaSequencing生物信息分析現(xiàn)在是10頁\一共有53頁\編輯于星期日真核mRNA的純化mRNA的純化主要通過的磁珠與生物素吸附原理從而分離純化Oligo（dT）25磁珠純化原理主要是mRNA的3′的polyA與磁珠在bindingbuffer的作用下相結(jié)合。磁珠通過MPC（磁分離器）從溶液中分離出來。mRNA與磁珠結(jié)合后，再用Tris-HCL在加熱條件下解離洗脫到溶液中。鏈霉親合素包被磁珠+生物素標(biāo)記Oligo（dT）25+poly（A）現(xiàn)在是11頁\一共有53頁\編輯于星期日原核mRNA的純化AmbionMICROExpressKitLNA扣鎖型探針現(xiàn)在是12頁\一共有53頁\編輯于星期日mRNA反轉(zhuǎn)錄---fragment+RT純化過的mRNA樣品加入1μl的fragmentbuffer70℃作用1.5min。加入1μl的stopbuffer終止反應(yīng)。加入沉淀劑（NaAc糖原無水乙醇）沉淀產(chǎn)物。RTdscDNA現(xiàn)在是13頁\一共有53頁\編輯于星期日末端修復(fù)(防止自連）cDNA3′末端加AAdapter連接現(xiàn)在是14頁\一共有53頁\編輯于星期日第一天消化DNAmRNA的分離mRNA的打斷cDNA的合成↓↓第二天末端修復(fù)↓↓加接頭膠回收3’端加A第三天PCRPCR膠回收↓↓文庫制備↓↓文庫質(zhì)量檢測(cè)：Aligent2100：片段大小、純度、濃度qPCR：片段大小、濃度手工檢測(cè)：跑膠驗(yàn)證?，F(xiàn)在是15頁\一共有53頁\編輯于星期日WorkflowofRNA-Seq樣品檢測(cè)文庫制備ClusterStationIlluminaSequencing生物信息分析現(xiàn)在是16頁\一共有53頁\編輯于星期日ApplicationRNA-Seq(單端測(cè)序---Quantification)RNA-Seq

(雙端測(cè)序---Transcriptome)Expression-profiling√√AlternativeSplicing－√FusionGene－√SNPdetection－√HiSeq2500ApplicationsofRNA-Seq17現(xiàn)在是17頁\一共有53頁\編輯于星期日RNA-Seq(Transcriptome)現(xiàn)在是18頁\一共有53頁\編輯于星期日WorkflowofRNA-Seq(Transcriptome)生物信息學(xué)分析現(xiàn)在是19頁\一共有53頁\編輯于星期日RNA-Seq(Transcriptome)CharacterizethetranscriptomeinunparalleleddetailTechnique220RNA-Seq(Denovotranscriptomeassembly)RNA-Seq(Transcriptomeresequencing)現(xiàn)在是20頁\一共有53頁\編輯于星期日RNA-Seq(Denovotranscriptomeassembly)文庫構(gòu)建測(cè)序組裝現(xiàn)在是21頁\一共有53頁\編輯于星期日Denovoassembleatranscriptome組裝流程現(xiàn)在是22頁\一共有53頁\編輯于星期日數(shù)據(jù)產(chǎn)出統(tǒng)計(jì)及測(cè)序數(shù)據(jù)的成分和質(zhì)量評(píng)估組裝結(jié)果分析（Contig長度分布、Scaffold長度分布、Unigene長度分布）Unigene（transcript）功能注釋Unigene的GO分類Unigene代謝通路分析預(yù)測(cè)編碼蛋白框（CDS）Unigene表達(dá)差異分析（兩個(gè)或兩個(gè)以上樣品）Unigene在樣品間的差異GO分類（需兩個(gè)或兩個(gè)以上樣品）和Pathway富集性分析Denovoassemblytranscriptome信息分析主要內(nèi)容：現(xiàn)在是23頁\一共有53頁\編輯于星期日Denovoassemblytranscriptome信息分析流程現(xiàn)在是24頁\一共有53頁\編輯于星期日Unigenes的GO注釋現(xiàn)在是25頁\一共有53頁\編輯于星期日Pathway分析現(xiàn)在是26頁\一共有53頁\編輯于星期日RNA-Seq(Transcriptomeresequencing)cDNA文庫構(gòu)建測(cè)序比對(duì)到參考序列現(xiàn)在是27頁\一共有53頁\編輯于星期日Transcriptomeresequencing比對(duì)流程現(xiàn)在是28頁\一共有53頁\編輯于星期日比對(duì)統(tǒng)計(jì)基因表達(dá)注釋基因差異表達(dá)分析基因結(jié)構(gòu)優(yōu)化可變剪接分析預(yù)測(cè)新轉(zhuǎn)錄本cSNP分析Transcriptomeresequencing信息分析主要內(nèi)容現(xiàn)在是29頁\一共有53頁\編輯于星期日Transcriptomeresequencing信息分析流程現(xiàn)在是30頁\一共有53頁\編輯于星期日應(yīng)用---優(yōu)化轉(zhuǎn)錄組注釋信息基因結(jié)構(gòu)優(yōu)化可變剪接鑒定基因融合鑒定RNA水平SNP分析現(xiàn)在是31頁\一共有53頁\編輯于星期日GenomicintergenicregionReadsclusterPairedReadsdistribution優(yōu)化基因結(jié)構(gòu)

鑒定新的轉(zhuǎn)錄本Paired-End(PE)ReadsReads比對(duì)到參考序列基因間區(qū)域現(xiàn)在是32頁\一共有53頁\編輯于星期日鑒定可變剪接（AlternativeSplicing）exon1exon2exon3exon1exon2exon3exon1exon3commonreadsjunctionreadsmRNA現(xiàn)在是33頁\一共有53頁\編輯于星期日鑒定基因融合PairedReadsSingleReadsGeneAGeneB現(xiàn)在是34頁\一共有53頁\編輯于星期日分析RNA水平SNP轉(zhuǎn)錄組重測(cè)序比對(duì)軟件：SOAPDenovo轉(zhuǎn)錄組測(cè)序:組裝軟件：SoapDenovo比對(duì)軟件：SoapSNP現(xiàn)在是35頁\一共有53頁\編輯于星期日36轉(zhuǎn)錄組研究技術(shù)橫向比較TechnologyTilingArraycDNAorESTsequesingTranscriptomeSequencingPrincipleHybridizationSangersequencingNext-GensequencingResolutionFromseveralto100SinglebaseSinglebaseThroughputHighLowHighRelianceongenomicsequenceYesNoInsomecasesBackgroundnoiseHighLowLowApplicationSimutaneouslymaptranscribedregionsandgeneexpressionYesLimitedforexpressionYesDynamicrangetoquantifygeneexpressionlevelUptoafew-hundredfoldNotpractical>8,000-foldAbilitytodistinguishdifferentisoformsandallelicexpressionLimitedYesYes現(xiàn)在是36頁\一共有53頁\編輯于星期日轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的優(yōu)勢(shì)RNA測(cè)序與芯片檢測(cè)基因數(shù)比較RNA測(cè)序與芯片檢測(cè)基因的表達(dá)量分布Technique1現(xiàn)在是37頁\一共有53頁\編輯于星期日GenomeRes2010Case

實(shí)驗(yàn)材料收集：

葉片，花序,果實(shí),根時(shí)間點(diǎn)：0,4,8,12,16,20和24h將每個(gè)時(shí)間點(diǎn)采集的樣品均勻混合測(cè)序策略：

Illumina測(cè)序，1Gdata現(xiàn)在是38頁\一共有53頁\編輯于星期日1.Highlight2.Heat3.Cold4.Salt5.Drought抗逆相關(guān)可變剪接現(xiàn)在是39頁\一共有53頁\編輯于星期日外包膜蛋白16(AT2G28900)Intron-retentionControlLowTemperatureResistance低溫脅迫相關(guān)的AS低溫脅迫下這個(gè)內(nèi)含子和對(duì)照相比被保留了下來，揭示了可變剪接有重要功能?，F(xiàn)在是40頁\一共有53頁\編輯于星期日AS調(diào)節(jié)機(jī)制CCA1生物鐘相關(guān)基因，例如調(diào)節(jié)氣孔的開關(guān)等現(xiàn)在是41頁\一共有53頁\編輯于星期日RNA-Seq單端測(cè)序（Quantification）等同于數(shù)字表達(dá)譜(DGE)現(xiàn)在是42頁\一共有53頁\編輯于星期日WorkflowofRNA-Seq單端測(cè)序（Quantification）生物信息學(xué)分析現(xiàn)在是43頁\一共有53頁\編輯于星期日RNA-Seq單端測(cè)序（Quantification）生物信息分析內(nèi)容測(cè)序數(shù)據(jù)評(píng)估篩選差異表達(dá)基因表達(dá)模式聚類分析GO功能富集分析Pathway富集分析蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析現(xiàn)在是44頁\一共有53頁\編輯于星期日RNA-Seq單端測(cè)序（Quantification）信息分析流程現(xiàn)在是45頁\一共有53頁\編輯于星期日RNA-Seq與基因芯片優(yōu)缺點(diǎn)比較技術(shù)優(yōu)點(diǎn)缺點(diǎn)RNA-seq1）檢測(cè)基因數(shù)比基因芯片多25%2）定量準(zhǔn)，可重復(fù)性高（重復(fù)相關(guān)系數(shù)≥0.99）3）數(shù)字化信號(hào)，無背景噪音，無交叉雜交4）高、低豐度基因均可檢測(cè)5）不受研究物種限制，模式生物和非模式生物均可檢測(cè)6）數(shù)據(jù)可與時(shí)俱進(jìn)，即隨數(shù)據(jù)庫更新而更新7）具有較好的分析兼容性，數(shù)據(jù)格式與芯片相同，可與芯片的分析軟件兼容1）樣本要求量比基因芯片多2）數(shù)據(jù)量大，需要具備一定的生物信息分析基礎(chǔ)，才能更好的挖掘數(shù)據(jù)蘊(yùn)含的豐富信息基因芯片1）平臺(tái)應(yīng)用較早2）信息分析軟件較多3）有些平臺(tái)要求樣品量少1）檢測(cè)靈敏度較低、重復(fù)性差、檢測(cè)閾值較狹窄2）有背景噪音，假陽性率＞1%3）受物種限制，只能檢測(cè)部分模式生物4）受基因拷貝數(shù)限制，無法檢測(cè)出低豐度基因5）只能檢測(cè)已知轉(zhuǎn)錄本，無法檢測(cè)出新轉(zhuǎn)錄本6）受數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)所限，因探針依靠現(xiàn)有數(shù)據(jù)庫或比較舊的版本的數(shù)據(jù)庫來設(shè)計(jì)的，可能出現(xiàn)注釋不準(zhǔn)確的情況現(xiàn)在是46頁\一共有53頁\編輯于星期日casePlantPhysiology2010取樣：

選取在成熟季節(jié)開花后