華大結題報告3蛋白3.4mrm模板

字體說 MRM目標蛋白工作流 MRM定量原 MRM信息分析流 標準信息分析流 MRM實驗方法的建 目標蛋白質的選 Transition的驗證與儀器優(yōu) MRM樣本定量分 MRM離子峰值整 重復性分 樣本校 目標蛋白質的定量結 文件...............................................................................................................................文件格式說 目標蛋白實驗方法的建 目標蛋白驗證及定量分 6 7參考文 1.1符號名 符號說 小四字 五號字 正小五字 目標蛋白工作流程MRM質譜多反應監(jiān)測(multiplereactionmonitoring,MRM)[1]是一種應用于目標蛋白組學定量的質譜技術，它基于蛋白質已知的信息或假定的信息有針對性地獲取數(shù)據(jù)進行質譜信號采Quadrupole Quadrupole QuadrupolePrecusor

Fragmention

Retention2.1MRM該圖顯MRM質譜技術的主要工作原MRM質譜模式中，第一級和三級(Q1，Q3)作為質量過濾器，選擇特定m/z的肽段母離子與子離子通過，第二級四極桿(Q2)Q1選擇的肽段母離子碰撞碎裂生成子離子。質譜transition即母/子離子對)實時監(jiān)控并檢測信號(Detector，就形成了一系列色譜峰圖，色譜峰圖以保留時間為橫坐標，子離子信號強度為(5個數(shù)量級)，這一優(yōu)勢使得MRM現(xiàn)在被越來越多應用在檢測復雜混合樣本中的低豐度蛋白、MRM不不合質量合酶SDS電試劑盒定還原烷基蛋白質提質量LC-MRMLC-MRM圖2.2MRM實驗流程該圖顯示了MRM目標蛋白質實驗的基本流程，第一步首先從樣品中提取蛋白，第二步對提取后的蛋白樣品進行還原烷基化的處理，打開二硫鍵以便后續(xù)充分酶解蛋白。第三步，用GE公司定量試劑盒(2Dquantkit)進行蛋白質的濃度測定。第四步，等體積進SDS電泳。蛋白定量合格則進行下面實驗步驟，不合格則重新提取蛋白。第五步，蛋白酶解消化。第六步，用樣本建MRM方法，方法成功則可對樣本進行LC-MRM質譜分析。 合合控圖2.3MRM信息分析流程該圖顯示MRM信息分析的基本流程，第一步，利用組或者蛋白質組的相的代表肽段。第三步預測可行的transitions。第四步對預測的transitions進行驗證，挑選，如果transition驗證整合結果形成MRM實驗方法列表，虛線所框為MRM方法建立的流程。第七步，對實驗下機質譜數(shù)據(jù)進標準信息分析流MRM不同于其它蛋白質組學研究方法，MRMtransition的信號來進可能會形成幾個至幾十個子離子。MRM只選擇部分有代表性的transitions進行信號監(jiān)測。因此在MRM實驗前需選擇合適的transition，這就是MRM實驗方法的建立。MRM實驗方號區(qū)分。建立最優(yōu)的transitionsMRM實驗成功的關鍵。實驗方法的建立我們主要使用的輔助軟件為proteinpilot(AppliedBiosystems)與Skyline[3](skyline425)。目標蛋白質的選白數(shù)據(jù)庫用來后續(xù)選擇unique肽段，此次項目的數(shù)據(jù)庫為IPI大鼠的蛋白數(shù)據(jù)庫。3.1目標蛋白IDProteinProteinProtein1 ;Rps1840Sribosomalprotein2-Uncharacterizedprotein3LOC68878460Sribosomalprotein4Fhl3Uncharacterized56-Uncharacterizedprotein7LOC314016Melanoma-associatedantigenMG508Rpl760Sribosomalprotein9Serine(Orcysteine)peptidaseinhibitor,cladeF,member1,isoformRplp060SacidicribosomalproteinRps1440SribosomalproteinPeroxiredoxin-fourandahalf sprotein1isoformFibrillin-Isoform1ofFibrinogenbetaHbb-b1Zerobeta-1Rpl1760SribosomalproteinSerpind1HeparincofactorRpl10lUncharacterized LOC497813;Rps740SribosomalproteinRps24Isoform1of40SribosomalproteinRps2540SribosomalproteinCarbonicanhydraseRpl1860SribosomalproteinRpl2460SribosomalproteinGuaninenucleotide-bindingproteinsubunitbeta-2-likeRps840SribosomalproteinRpl1560SribosomalproteinAquaporin-Ctnna1UncharacterizedCtnnd1UncharacterizedCarbonicanhydraseKeratin,typeIIcytoskeletalRasal1.UncharacterizedRpl7a60SribosomalproteinSecerninAspnUncharacterized Cyc1UncharacterizedIsoform2of-UncharacterizedRps1640SribosomalproteinKrt75keratin,typeIIcytoskeletal 40SribosomalproteinS4,XKng1Uncharacterized Sh3bgrUncharacterizedLOC362795Ig -2CchainCGdaUncharacterizedRps5UncharacterizedRtn2Uncharacterized keratin6A-Transition的選離子。在選擇肽段的transitionunique，在樣本背景中能唯m/z小于1250，y型子離子、肽段無轉錄后或化學修飾、無漏切位點等都是選擇最優(yōu)的肽段，每個肽段選擇4~6個transitions。 的驗證與儀器優(yōu)化于肽段的質譜偏、樣本背景的復雜性，蛋白過原因，預選擇的transitions也可能會出最優(yōu)的transition進行MRM實驗。TransitiontransitionMRM+EPI的質譜模式進行驗證，MRMtransitionEPI模式(EnhancedProductIonScan)。EPIMS/MS譜，用來鑒定驗證對應的肽段。MRM+EPItransition色譜峰進行驗證，肽段MS/MS鑒定的保留時間與transitionMRM色譜峰的保留時間進行匹配，就能去除可能存在的假陽性干擾峰[1]，如下圖所示為MRM+EPI模式驗證transition的示例。3.1Transition的驗證MRM+EPI模式對目標肽段AITGASLADIMAKtransition進行實驗驗證。由圖可以看，到目標肽段AITGASLADIMAK選擇的transition631.34/761.42MRM驗證時檢測到A(保留時間肽段IQAVLLPK，峰B的保留時間內鑒定到肽段AITGASLADIMAK，峰C時鑒定到肽段 ----

--------3.2是對肽段進行MS/MStransitionsMRM驗證的結protein，peptide分別表示目標蛋白及相應的肽段，MS/MSConf，MS/MSRT/min分別表示肽段鑒定的可信度與保留時間，空白表示沒有鑒定到，confidence20表示肽段可靠鑒定到。MRMRT/min表示肽transitionsMRM驗證中色譜但至少3transition有一致MRM色譜峰保留時間的可作為定量的候選肽段。肽transitions色譜峰保留時間不一致的不可用于MRM定量實驗，未列入表中。模式的質譜，選取使transition達到最好響應信號的CE，此CE值即為最優(yōu)CE值。此項目transition5CECE的過程，檢測在不同CE梯度下同一個transition信號強度。圖3.2為蛋白IPI 子離子的保留時間，縱坐標為離子信號強度。不同顏色表示在不同CE值條件下的保留時間-信號強度的關系。由圖可以看到，在藍色所示的梯度CE值下transition峰信號最好的CE值，故選藍色所示的CE值為transition661.86/940.55的實驗最優(yōu)CE參數(shù)。2unique肽段，每個肽段保留3個預測最優(yōu)的transitions。一般一個目標蛋白最終產生成6個transitions。經過驗證和優(yōu)化的transitionMRMtransition結果表。Protein Signature

MRMTransitions

IonESEITYF ESEITYF IA IGP 000VDS VDS3.3展示了目標蛋白最終方法transition列表。其中Protein為目標蛋白名稱，SignaturePeptide為CE(CollisionEnergy)為碰撞能量。FragmentIonType為選擇的子離子類型。Transition列表見輸出文件MRM離子峰值整MRM(wiff格式)MRM分析軟件MultiQuantAppliedtransition的色譜峰圖信息。圖3.3同一肽段的transitions色譜峰信息橫坐標為其保留時間(min)，縱坐標為離子強度。由圖可以看到，同一肽段的三個子離子y13+、y7+、y6+均有對應的色譜峰，并且保留時間一致。信息。下圖顯示的是transition色譜峰整合后的部分列表結果，整合后的離子峰值信息將進3.4MRMComponentMassSignal1542.31542.31542.3/1671.31671.31671.31 0838.51 838.51 559.31 508.31 508.31 508.31 624.81 624.81 624.81 597.9/1 597.91 597.91 452.81 452.81 452.81542.31542.31542.3/1671.31671.31671.31 0838.51 838.51 559.31 508.31 508.31 508.31 624.81 624.81 624.81 597.9/1 597.91 597.91 452.81 452.81 452.8要是通過分析比較transition離子峰面積及SignalNoise數(shù)據(jù)來定量分析。Used邏輯值表示同一肽段的transitions保留時間是否一致。果見輸出文件對峰值整合結果中的各肽段對應transitions的保留時間進行統(tǒng)計，結果如下表：3.5transition

1212341234▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲

▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲××××××××▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲▲表3.5是對8次測量中各肽段transitions保留時間的統(tǒng)計?！?表示屬同一肽段的所有transitions無一致的保留時間，不適合用于定量分析，僅作驗證數(shù)據(jù)，如IPI .GEEVTILAQK?！?表示同一肽段的所有transitions保留時間一致，滿足定量分析要求。重復性分析transition測量的一致性。這里重復性分析提供3.4transitions各次重復的平均峰面積與其CV關系。3.4transition峰面積&CVtransition在每個樣本四次重復中的峰面積平均，縱坐標為這四個樣本校Beta-galacOS=Escheri作為參考蛋白，用來校準由于進樣、儀器等誤差造成的實驗偏差。樣本校準前后各transition峰面積CV比3.5transitionCV比較sample1_raw，sample2_raw，sample3_raw為sample1，sample2，sample3未校準的原始數(shù)據(jù)sample1_nor，sample2_nor，sample3_nor為對應樣本校準后的數(shù)據(jù)?？v坐標表示樣transitions的峰面CV范圍。由圖對比可以看到，樣本校準后相比校準前，CV范圍有明顯下降，這說明加入內參蛋白起了很好的校準作用。目標蛋白質的定量結果3.62PeptidefoldProteinfoldBeta-galacOS=EscheriBeta-galacOS=Escheri 本示對應差異倍數(shù)。Proteinfoldchanges為最終蛋白水平上的差異，如圖紅色所示，為有顯著差異的蛋白，圖中綠色表示是蛋白差異顯著可靠，對應ratio為顯著差異的差異倍數(shù)，可作為衡量蛋白的顯著差異。 3.6上圖顯示在樣JMP，NL中的表達有顯著差異的目標蛋白及差異倍數(shù)。橫坐倍數(shù)，圖中虛線所示差異倍數(shù)為1，大于1表示此蛋白上調，小于1表示蛋白下調。文件Host:ID:Unix/Linux用戶：tar–zxvf*.tar.gzorgzip–d*.gz。Windows用戶：推薦使用winRAR進行。Mac用戶： :tar–zxvf*.tar.gz 文件格式說明目標蛋白實驗方法的建立5.1transition5.1*.transition.xlsSignatureMRMIon Ion 目標蛋白驗證及定量分析5.2*.integrated_peak.xls5.2*.integrated_peak.xls表 含Original Component Mass Retention Widthat 6CustomerService:cus TechnicalSupport: Comint 7Lange,V,Picotti,P.etal.Selectedreactionmonitoringfortativeproteomics:atutorial.MolSystBiol.(2008)4:222.Kettenbach,A. Rush,J