分子生物學(xué)分子克隆

分子生物學(xué)分子克隆第1頁，共86頁，2023年，2月20日，星期三分子克隆

分子克?。╩olecularcloning）是擴(kuò)增DNA片段的數(shù)量。一般程序是將需要擴(kuò)增的DNA片段連接到載體（vector）上，再將重組的載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞中，重組載體在宿主細(xì)胞中復(fù)制，目的DNA片段也同時得到擴(kuò)增。

第2頁，共86頁，2023年，2月20日，星期三大腸桿菌的一般性質(zhì)

大腸桿菌是需氧或兼性厭氧細(xì)菌，革蘭氏陰性，在瓊脂培養(yǎng)基上形成圓形、光滑的白色菌落。大腸桿菌中有一個4.2×106bp的環(huán)狀染色體DNA。除少數(shù)菌株外，大腸桿菌通常不致病。用于分子克隆的大腸桿菌必須具備一些特殊的性質(zhì)，除極少數(shù)例外，用于分子克隆的大腸桿菌都是由K-12菌株衍生而來的。為了消除受體大腸桿菌對外源DNA的限制作用，一般都是選用具有限制缺陷的突變體作為受體菌。

第3頁，共86頁，2023年，2月20日，星期三大腸桿菌的遺傳標(biāo)記

大腸桿菌的遺傳標(biāo)記一般采用三字母命名，如tet

r、tet

s、amp

r等，其中上標(biāo)r代表抗性（resistance），s代表敏感（sensitivity）。當(dāng)大腸桿菌中含有質(zhì)?；蚴删w時，記為E.coliK-12（pBR322）、E.coliK-12（λ）等。第4頁，共86頁，2023年，2月20日，星期三大腸桿菌培養(yǎng)基

液體培養(yǎng)基（LB液體培養(yǎng)基：1g蛋白胨，0.5g酵母粉，1gNaCl，加重蒸水100ml，用NaOH調(diào)pH至7.0，高壓滅菌。）、固體培養(yǎng)基（加瓊脂或瓊脂糖）。有些培養(yǎng)基需要加一些不耐高溫的成分，應(yīng)在培養(yǎng)基高壓滅菌后冷卻到一定溫度再加入，這些成分的母液可通過過濾除菌。第5頁，共86頁，2023年，2月20日，星期三在液體培養(yǎng)基中生長

用于轉(zhuǎn)化的大腸桿菌受體菌應(yīng)采用對數(shù)期的細(xì)菌；用于提取質(zhì)粒的應(yīng)采用飽和期的細(xì)菌。在經(jīng)預(yù)備實驗測出生長曲線后，通過測定培養(yǎng)液的O.D.600就可以知道液體培養(yǎng)基中的細(xì)菌處于什么期。第6頁，共86頁，2023年，2月20日，星期三在固體培養(yǎng)基上生長

劃線法或稀釋法可得到單菌落。上層瓊脂常用于噬菌斑的篩選。濃度較低的上層瓊脂與菌液混合后倒在下層瓊脂上面。倒置培養(yǎng)。

第7頁，共86頁，2023年，2月20日，星期三載體

載體主要有兩類：質(zhì)粒（plasmid）和噬菌體（bacteriophageorphage）。它們都經(jīng)過了人工的改造，使其能更好地滿足分子克隆工作的需要。它們在宿主細(xì)胞中都能夠復(fù)制，并且在帶有外源DNA片段時也不影響它們的復(fù)制，而單獨的外源DNA不能復(fù)制。

載體還必須帶有一些遺傳標(biāo)記，以供選擇。第8頁，共86頁，2023年，2月20日，星期三質(zhì)粒（plasmid）的一般性質(zhì)

質(zhì)粒是在細(xì)胞內(nèi)能自主復(fù)制的雙鏈共價閉合環(huán)的DNA分子，大小從1kb到200kb不等。大腸桿菌中的F因子就是一種質(zhì)粒。

在質(zhì)粒上插入一段外源DNA，只要不破壞復(fù)制起始點，外源DNA就可以和質(zhì)粒DNA一起復(fù)制。質(zhì)粒上往往帶有編碼某些酶的基因。當(dāng)外源DNA片段插入到某一遺傳標(biāo)記基因中，該基因就失去活性，若該基因能夠賦予細(xì)菌某種性狀，根據(jù)性狀的改變就能篩選出含有重組質(zhì)粒的菌落。

第9頁，共86頁，2023年，2月20日，星期三質(zhì)粒的遺傳標(biāo)記

質(zhì)粒攜帶的常見基因有β-內(nèi)酰胺酶基因，帶有這種質(zhì)粒的大腸桿菌能夠抗氨芐青霉素（amp

r）；氯霉素乙酰基轉(zhuǎn)移酶基因能夠抗氯霉素（cat

r）。其他一些遺傳標(biāo)記有l(wèi)acZ、tet

r、str

r等。第10頁，共86頁，2023年，2月20日，星期三質(zhì)粒的復(fù)制類型

一般來說，一個質(zhì)粒上只帶有一個復(fù)制子（replicon），目前使用的大多數(shù)質(zhì)粒載體都帶有一個來自pMB1質(zhì)粒的復(fù)制子。其他常用的復(fù)制子還有ColE1、p15A、pSC101等。質(zhì)粒在大腸桿菌中的復(fù)制有兩種類型：一種是松弛型控制復(fù)制（relaxedcontrolreplication），一種是嚴(yán)緊型控制復(fù)制（stringentcontrolreplication）。二者的區(qū)別是帶有的復(fù)制子不同，導(dǎo)致在一個細(xì)胞中質(zhì)粒的拷貝數(shù)不同。

第11頁，共86頁，2023年，2月20日，星期三質(zhì)粒的復(fù)制類型

在正常生長情況下，每個細(xì)菌細(xì)胞中可有15～20個拷貝的松弛型質(zhì)粒（帶有pMB1或ColE1復(fù)制子），而對于嚴(yán)緊型質(zhì)粒（如帶有pSC101復(fù)制子）來說，每個細(xì)胞中僅有1～5個拷貝。當(dāng)用氯霉素處理細(xì)菌時，氯霉素抑制了蛋白質(zhì)的合成，嚴(yán)緊型復(fù)制質(zhì)粒的拷貝數(shù)并不增加，而松弛型復(fù)制質(zhì)粒的拷貝數(shù)可增加到2000～3000個。第12頁，共86頁，2023年，2月20日，星期三嚴(yán)緊型控制復(fù)制

嚴(yán)緊型控制復(fù)制（stringentcontrolreplication）的質(zhì)粒的復(fù)制，取決于細(xì)菌細(xì)胞周期之初合成的不穩(wěn)定蛋白，因此與細(xì)菌染色體的復(fù)制同步，每個細(xì)菌細(xì)胞中只有1~5個質(zhì)粒拷貝。

pSC101復(fù)制子部分來源于R6-5質(zhì)粒的復(fù)制子，R6-5復(fù)制子編碼了一個必需的順式作用蛋白，該蛋白對復(fù)制起點具有正調(diào)節(jié)作用，而對自身基因repA基因（編碼該順式作用蛋白的基因）的轉(zhuǎn)錄則有負(fù)調(diào)節(jié)作用，所以帶有這種復(fù)制子的質(zhì)粒屬嚴(yán)緊型控制質(zhì)粒，蛋白質(zhì)合成抑制劑處理也不能增加它們的拷貝數(shù)。

第13頁，共86頁，2023年，2月20日，星期三松弛型控制復(fù)制

松弛型控制復(fù)制（relaxedcontrolreplication）的質(zhì)粒的復(fù)制，依靠宿主細(xì)胞提供的半衰期較長的酶來進(jìn)行，因此即使宿主的蛋白質(zhì)合成停止，質(zhì)粒的復(fù)制仍繼續(xù)進(jìn)行。當(dāng)在培養(yǎng)基中加入氯霉素時，抑制了宿主的蛋白質(zhì)合成和染色體復(fù)制，但質(zhì)粒仍在復(fù)制，最后可達(dá)到每個細(xì)胞內(nèi)含2000~3000個質(zhì)?？截悺＿@一性質(zhì)被利用來進(jìn)行分子克隆。第14頁，共86頁，2023年，2月20日，星期三質(zhì)粒的不相容性

帶有兩種不同復(fù)制子的質(zhì)?？梢苑€(wěn)定地共存于同一個細(xì)胞中，稱為質(zhì)粒的相容性。

帶有兩種相同復(fù)制子的質(zhì)粒不能穩(wěn)定地共存于同一個細(xì)胞中，稱為質(zhì)粒的不相容性。

根據(jù)質(zhì)粒的相容與否，可將質(zhì)粒分為各個不相容組。同一不相容組的兩種質(zhì)粒不能穩(wěn)定地共存于一個細(xì)胞中，不同不相容組的兩種質(zhì)?？梢苑€(wěn)定地共存于一個細(xì)胞中。

現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)了三十多個不相容組。第15頁，共86頁，2023年，2月20日，星期三質(zhì)粒不相容原理

當(dāng)兩個不相容質(zhì)粒被導(dǎo)入同一細(xì)胞時，它們在復(fù)制及隨后分配到子細(xì)胞的過程中彼此競爭。由于質(zhì)粒分子是從細(xì)胞內(nèi)的質(zhì)粒庫中隨機選取出來進(jìn)行復(fù)制的，所以兩種不同的質(zhì)粒在一個細(xì)胞中的拷貝數(shù)并不總能保持相等。最初在隨機過程中產(chǎn)生的微小差異，將很快導(dǎo)致兩種質(zhì)粒在拷貝數(shù)上更嚴(yán)重的失衡。在一些細(xì)胞中，一種質(zhì)粒處于優(yōu)勢，而在另一些細(xì)胞中，另一種質(zhì)粒處于優(yōu)勢。細(xì)菌繁殖幾代后，占少數(shù)的質(zhì)粒將會喪失殆盡，在原始細(xì)胞的后代中可含有兩種質(zhì)粒中的任意一種，但不會兼而有之。第16頁，共86頁，2023年，2月20日，星期三質(zhì)粒載體的選擇一種理想的質(zhì)粒載體應(yīng)具備下述條件：分子相對較小，3~10kb左右。這可使限制性內(nèi)切酶在質(zhì)粒載體上的作用位點減少。

在復(fù)制子以外的適當(dāng)位點，構(gòu)建幾個限制性內(nèi)切酶的單一位點，酶切位點最好位于易于檢測的表型基因上。

質(zhì)粒能賦予宿主細(xì)胞易于檢測的表型，重組質(zhì)粒能使表型發(fā)生變化。

若用于分子克隆，應(yīng)是松弛型控制質(zhì)粒。第17頁，共86頁，2023年，2月20日，星期三Lac操縱子調(diào)控模型第18頁，共86頁，2023年，2月20日，星期三α互補的原理

現(xiàn)在使用的許多載體都帶有一個大腸桿菌DNA的短區(qū)段，其中含有β－半乳糖苷酶基因（lacZ）的調(diào)控序列和頭146個氨基酸（α肽）的編碼信息。這個編碼區(qū)中插入了一個多克隆位點，它并不破壞閱讀框，但可使少數(shù)幾個氨基酸插入到β－半乳糖苷酶的氨基端，而不影響功能。第19頁，共86頁，2023年，2月20日，星期三α互補的原理

這種載體適用于可編碼β－半乳糖苷酶C端部分序列的宿主細(xì)胞。雖然宿主和質(zhì)粒編碼的片段各自都沒有酶活性，但這兩個肽段可以融為一體，形成具有酶學(xué)活性的β－半乳糖苷酶。這種互補叫做α互補。

β－半乳糖苷酶能將無色的x-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷）轉(zhuǎn)變成藍(lán)色的5-溴-4-氯靛藍(lán)，用這種方法可方便地檢測出該酶活性的存在。第20頁，共86頁，2023年，2月20日，星期三α互補的應(yīng)用

當(dāng)外源DNA插入到載體lacZ的多克隆位點上后，破壞了α肽，從而不能發(fā)生α互補，不能產(chǎn)生有活性的β－半乳糖苷酶。

當(dāng)培養(yǎng)基中存在IPTG（異丙基β-D-硫代半乳糖苷）和x-gal時，由攜帶了外源DNA的重組載體轉(zhuǎn)化的細(xì)胞長成白色菌落（或無色噬菌斑），而由沒有攜帶外源DNA的空白載體轉(zhuǎn)化的細(xì)胞長成藍(lán)色菌落（或藍(lán)色噬菌斑）。第21頁，共86頁，2023年，2月20日，星期三質(zhì)粒pBR322的圖譜

pBR322質(zhì)粒帶有pMB1復(fù)制子，屬松弛型控制質(zhì)粒，經(jīng)氯霉素處理宿主細(xì)胞后，每個細(xì)胞中可積累1000～3000個質(zhì)?？截?。第22頁，共86頁，2023年，2月20日，星期三重組pBR322質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌后的選擇方法

（假設(shè)外源DNA插入到ampr基因中）

4個菌落都是由質(zhì)粒轉(zhuǎn)化了的細(xì)菌形成的，2,3兩個菌落中的質(zhì)粒沒有攜帶外源DNA，1,4兩個菌落中的質(zhì)粒攜帶了外源DNA。第23頁，共86頁，2023年，2月20日，星期三pUC19質(zhì)粒

pUC19質(zhì)粒帶有來自pBR322的ampr和pMB1復(fù)制子，帶有l(wèi)acZ基因，在lacZ中含有一個來自單鏈?zhǔn)删wM13的多克隆位點（multiplecloningsite,MCS;orpolycloningsite）。pUC8和pUC9以及Puc18和pUC19是成對的質(zhì)粒，在一對pUC質(zhì)粒中多克隆位點的方向相反。第24頁，共86頁，2023年，2月20日，星期三多克隆位點

多種不同限制性內(nèi)切酶的單一切割位點密集排列的DNA位點，用于插入外源DNA片段。一般位于DNA載體的某一遺傳標(biāo)記基因內(nèi)，以便通過插入失活該基因來鑒別重組體。（multiplecloningsite,MCSorpolycloningsite）

第25頁，共86頁，2023年，2月20日，星期三pUC19質(zhì)粒圖譜第26頁，共86頁，2023年，2月20日，星期三重組pUC質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌后的選擇方法

（外源DNA插入到lacZ基因中）

6個菌落都是被pUC質(zhì)粒轉(zhuǎn)化了的細(xì)菌形成的，其中1,3,4號菌落中的質(zhì)粒沒有攜帶外源DNA，2,5,6號菌落中的質(zhì)粒攜帶了外源DNA。第27頁，共86頁，2023年，2月20日，星期三pUC質(zhì)?？截悢?shù)多的機理

RNAⅠ和RNAⅡ是以質(zhì)粒DNA同一區(qū)段相反的兩條鏈為模板合成的，RNAⅡ大，RNAⅠ小，RNAⅡ與質(zhì)粒的復(fù)制起點DNA結(jié)合，經(jīng)RNaseH切割后，可作為引物復(fù)制質(zhì)粒DNA。

pUC質(zhì)粒缺乏rop基因，使得其在一個宿主細(xì)胞中的拷貝數(shù)在不加氯霉素時可達(dá)500～700個。rop基因產(chǎn)生一個63個氨基酸的小蛋白，稱為Rop蛋白，它能增強RNAⅠ與RNAⅡ的結(jié)合，而RNAⅡ是質(zhì)粒復(fù)制的引物，所以rop的存在抑制質(zhì)粒的復(fù)制。第28頁，共86頁，2023年，2月20日，星期三pSP質(zhì)粒

pSP64和pSP65的多克隆位點方向相反，還帶有來自噬菌體的SP6啟動子，可轉(zhuǎn)錄插入片段的一條鏈。pSP70～pSP73以及所有的pGEM在多克隆位點的兩側(cè)有SP6和T7啟動子，可在體外加入SP6或T7RNA聚合酶分別轉(zhuǎn)錄插入片段的兩條鏈，以制備單鏈RNA探針、制備體外翻譯的mRNA模板、合成反義RNA等。

第29頁，共86頁，2023年，2月20日，星期三pSP64質(zhì)粒圖譜第30頁，共86頁，2023年，2月20日，星期三pGEM-3zf(+/－)質(zhì)粒圖譜+和--

在于f1復(fù)制起點的方向不同第31頁，共86頁，2023年，2月20日，星期三pGEM-3zf(+/－)質(zhì)粒多克隆位點序列圖第32頁，共86頁，2023年，2月20日，星期三穿梭質(zhì)粒

穿梭質(zhì)粒（shuttleplasmid）是一種雜合質(zhì)粒，它們既含有能在原核細(xì)胞中復(fù)制的復(fù)制起始區(qū)，又含有能在真核細(xì)胞中復(fù)制的復(fù)制起始區(qū)，所以它們可以在兩類細(xì)胞中擴(kuò)增。如將酵母的2μm環(huán)質(zhì)粒與pBR322融合在一起的pJDB219就是一種穿梭質(zhì)粒，用pJDB219克隆的基因可以先在E.coli中篩選鑒定（在酵母中操作重組DNA有一定困難），然后再轉(zhuǎn)入酵母中進(jìn)行表達(dá)。第33頁，共86頁，2023年，2月20日，星期三穿梭質(zhì)粒

由大腸桿菌質(zhì)粒載體和牛乳頭瘤病毒（bovinepapillomavirus，BPV）構(gòu)建成的pBPV-BV1是一種典型的動物細(xì)胞系統(tǒng)的穿梭質(zhì)粒載體，它既可以在大腸桿菌細(xì)胞中復(fù)制篩選，也可在動物細(xì)胞中復(fù)制表達(dá)，每個細(xì)胞平均有10～30個拷貝。第34頁，共86頁，2023年，2月20日，星期三λ噬菌體headsheath第35頁，共86頁，2023年，2月20日，星期三λ噬菌體（λphage）基因組的一般性質(zhì)λ噬菌體為雙鏈DNA細(xì)菌病毒，在噬菌體頭部時DNA為線性分子，大小48.5kb。線性分子的兩端有12個核苷酸長的5’突出粘性末端，稱為cos位點（cohesive-endsite），這兩個粘性末端富含CG，能互補，但不是回文結(jié)構(gòu)。通過兩端的粘性末端連接，線性分子可轉(zhuǎn)變成環(huán)狀分子。第36頁，共86頁，2023年，2月20日，星期三λ噬菌體（λphage）基因組的一般性質(zhì)3

DNA分子可分為3個區(qū)。左臂區(qū)含有編碼頭部和尾部結(jié)構(gòu)的蛋白基因，右臂區(qū)含有負(fù)責(zé)DNA復(fù)制、使宿主細(xì)胞裂解的基因，以及這些基因表達(dá)的調(diào)控序列。中央?yún)^(qū)的基因?qū)τ谛纬墒删w是不必需的，這一段可被外源DNA取代。第37頁，共86頁，2023年，2月20日，星期三λ噬菌體中央?yún)^(qū)的基因

中央?yún)^(qū)編碼的基因與保持噬菌斑形成能力無關(guān)，它們包括一些與重組有關(guān)的基因（例如redA和redB），使噬菌體整合到大腸桿菌染色體中去的int基因，以及把原噬菌體DNA片段從宿主染色體上刪除下來的xis基因。若用外源DNA片段取代這個區(qū)域的基因，不會影響噬菌體的形成。

第38頁，共86頁，2023年，2月20日，星期三λDNA的結(jié)構(gòu)線性分子環(huán)狀分子左臂

左臂

右臂右臂中央?yún)^(qū)中央?yún)^(qū)（40%）Cos位點第39頁，共86頁，2023年，2月20日，星期三λ噬菌體載體對大腸桿菌培養(yǎng)條件的要求

λ噬菌體侵染大腸桿菌時，首先吸附在細(xì)胞外膜的受體上，這些受體由大腸桿菌的lamB基因編碼，其正常功能是轉(zhuǎn)運麥芽糖進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。由于麥芽糖可誘導(dǎo)這些受體的合成，而葡萄糖抑制其合成，故用作λ噬菌體宿主的大腸桿菌應(yīng)在含麥芽糖的培養(yǎng)基上培養(yǎng)。第40頁，共86頁，2023年，2月20日，星期三圖6－6

λ噬菌體的生長途徑第41頁，共86頁，2023年，2月20日，星期三裂解生長途徑λ噬菌體與膜上的受體結(jié)合→環(huán)化→θ環(huán)復(fù)制產(chǎn)生子代環(huán)狀DNA→轉(zhuǎn)錄和翻譯出各種蛋白。子代環(huán)狀DNA→滾環(huán)復(fù)制產(chǎn)生線狀多聚體→包裝成子代噬菌體顆粒。

溶源性生長

子代環(huán)狀DNA→整合到大腸桿菌染色體上→隨染色體DNA復(fù)制而復(fù)制。第42頁，共86頁，2023年，2月20日，星期三λ噬菌體改建成載體的基礎(chǔ)λ噬菌體可在細(xì)菌細(xì)胞中大量繁殖。λ噬菌體的中央?yún)^(qū)對于自身繁殖是不必需的，可將外源DNA插入或取代中央?yún)^(qū)，外源DNA將隨著λ噬菌體DNA的擴(kuò)增而擴(kuò)增。λ噬菌體DNA改建成載體后，可以攜帶較大的外源DNA（最大容量可達(dá)22kb，質(zhì)粒載體最大只能攜帶15kb的外源DNA）。λ噬菌體載體轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)菌的效率比質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化細(xì)菌的效率高得多。第43頁，共86頁，2023年，2月20日，星期三對重組λ噬菌體大小的要求

宿主細(xì)胞內(nèi)的λ噬菌體DNA必須具有適當(dāng)?shù)拇笮。拍鼙话b到事先組裝好的、由蛋白質(zhì)組成的頭部（前頭）。野生型λ噬菌體DNA為48.5kb，被包裝的效率最高，并且形成的噬菌體顆粒感染力最強。實驗表明，當(dāng)構(gòu)建的λDNA分子的長度在野生型的78～105%范圍內(nèi)，仍可被包裝成具有感染力的噬菌體顆粒。如果構(gòu)建的λDNA小于野生型的78%或大于其的105%，就不能形成具有感染力的噬菌體顆粒。第44頁，共86頁，2023年，2月20日，星期三將λ噬菌體改建成載體的措施消除基因組必需區(qū)內(nèi)不必要的限制性內(nèi)切酶酶切位點。在可替代區(qū)構(gòu)建所需的酶切位點。可在外源DNA插入位點之前加入適當(dāng)?shù)膯幼?，以表達(dá)外源DNA。加入易檢測的表型基因（如lacZ）。重組λ噬菌體最好能夠包裝，以增加轉(zhuǎn)導(dǎo)率。（使用λ噬菌體載體時，培養(yǎng)基中必須加入麥芽糖）第45頁，共86頁，2023年，2月20日，星期三轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染和轉(zhuǎn)導(dǎo)轉(zhuǎn)化（transformation）：使質(zhì)粒DNA進(jìn)入宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)染（transfection）：使裸露的噬菌體DNA直接進(jìn)入宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)（transduction）：使用完整的噬菌體顆粒感染宿主細(xì)胞，噬菌體DNA在噬菌體蛋白及宿主細(xì)胞的受體蛋白協(xié)助下進(jìn)入宿主細(xì)胞第46頁，共86頁，2023年，2月20日，星期三插入型載體和取代型載體

在λ載體中，只有單個切點供外源DNA插入的叫插入型載體（insertionvectors）；那些具有成對的切點，且切點間的片段又可被除去并被外源DNA取代的載體叫取代型載體或替換型載體（replacementvectors）。第47頁，共86頁，2023年，2月20日，星期三λ載體的優(yōu)點經(jīng)改造的λ載體比質(zhì)粒載體的優(yōu)點在于：①可攜帶較大的外源DNA片段，其最大容量可達(dá)18～22kb，而質(zhì)粒載體的最大容量一般不超過15kb。②重組后的λDNA在體外包裝成噬菌體顆粒，與質(zhì)粒轉(zhuǎn)化細(xì)菌的效率相比，轉(zhuǎn)導(dǎo)具有更高的效率。③重組的噬菌體容易篩選和貯存。噬菌斑原位雜交比細(xì)菌菌落原位雜交靈敏。第48頁，共86頁，2023年，2月20日，星期三合適載體的選擇①取代型載體容量較大（最大23kb），適合于構(gòu)建基因文庫，插入型載體適用于克隆較小的外源DNA片段。②優(yōu)先考慮帶有插入失活基因標(biāo)記基因的載體，如lacZ。③選擇帶有適當(dāng)酶切位點（與外源DNA片段相應(yīng)）的載體。

在替換型載體中，沒有替換的載體（兩臂直接相連）不能形成有感染力的噬菌體顆粒，所以只要形成了噬菌斑的都是重組λDNA。第49頁，共86頁，2023年，2月20日，星期三插入型載體λgt10和λgt11圖譜第50頁，共86頁，2023年，2月20日，星期三λgt10的特點

λgt10為CⅠ陽性，在帶有h

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l

突變（高頻溶源化）的大腸桿菌中CⅠ基因能夠高效表達(dá)，CⅠ產(chǎn)物能抑制早期轉(zhuǎn)錄并阻斷晚期基因的表達(dá)，與CⅠ同時表達(dá)的int基因產(chǎn)物可識別宿主菌和噬菌體基因組中的att位點，并在該部位將二者結(jié)合，使噬菌體載體DNA整合到細(xì)菌染色體中，以極高的速率進(jìn)入溶源狀態(tài)（>99%）在培養(yǎng)基平板上形成渾濁的噬菌斑（因細(xì)菌生長緩慢造成）。第51頁，共86頁，2023年，2月20日，星期三λgt10的特點

在CⅠ基因中有一個EcoRⅠ位點，在此位點插入外源DNA后，破壞了CⅠ基因，合成活性阻遏物的功能遭到破壞，噬菌體DNA大量復(fù)制，進(jìn)入裂解周期，在培養(yǎng)基平板上形成清晰的噬菌斑。

在BNN102（C600h

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lA）宿主菌中篩選重組體，在C600（無h

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）宿主菌中增殖載體。第52頁，共86頁，2023年，2月20日，星期三λgt11的特點

λgt11DNA中有l(wèi)acZ基因，在lacZ基因中有EcoRⅠ位點，沒有插入外源DNA的載體所形成的噬菌斑呈藍(lán)色，插入了外源DNA的噬菌斑為無色。若外源DNA的讀碼框與lacZ的讀碼框相吻合，就可以表達(dá)出融合蛋白，這樣便于用抗體檢測。第53頁，共86頁，2023年，2月20日，星期三λZAP噬菌體載體結(jié)構(gòu)和其中的pBluescript噬菌粒第54頁，共86頁，2023年，2月20日，星期三λZAP載體的特點

λZAP載體是一個插入型λ噬菌體載體，在λ噬菌體的中間區(qū)用一個叫pBluescript的噬菌粒取代（pBluescript也是一種可以獨立使用的載體）。pBluescript載體是由pUC質(zhì)粒載體衍生而來，它含有一段來自M13或f1噬菌體（單鏈絲狀噬菌體）的復(fù)制起點和終點，故稱為噬菌粒（phagemid）。噬菌粒（phagemid）既有單鏈?zhǔn)删w的性質(zhì)，又有質(zhì)粒的性質(zhì)。第55頁，共86頁，2023年，2月20日，星期三λZAP載體的特點

pBluescript中含有l(wèi)acZ，lacZ中有多克隆位點，可插入外源DNA。多克隆位點兩側(cè)有T3和T7啟動子，利用這兩個啟動子可在體外分別以外源DNA的兩條鏈為模板轉(zhuǎn)錄出兩條鏈的RNA。λZAP載體感染大腸桿菌后能形成噬菌斑，可利用藍(lán)白噬菌斑篩選重組DNA。在輔助噬菌體M13（或f1）超感染下，輔助噬菌體基因Ⅱ表達(dá)的蛋白質(zhì)會識別f1的復(fù)制起點，并以滾環(huán)式沿pBluescript序列合成單鏈DNA，直到f1終點止，然后切割下來，兩端連接成單鏈環(huán)狀DNA，最終被M13（或f1）輔助噬菌體合成的蛋白質(zhì)包裝成單鏈?zhǔn)删w顆粒，排出細(xì)胞。第56頁，共86頁，2023年，2月20日，星期三λZAP載體的特點

被包裝成單鏈?zhǔn)删w顆粒的噬菌?？梢愿腥拘碌募?xì)胞，在新感染的細(xì)胞中以質(zhì)粒的形式擴(kuò)增和表達(dá)外源DNA。由于lacZ的作用，可用藍(lán)白噬菌斑和藍(lán)白菌落選擇重組子。多克隆位點的兩端有T7啟動子和T3啟動子，可以在體外加入相應(yīng)RNA聚合酶，轉(zhuǎn)錄出外源DNA的任意一條鏈。此載體可以攜帶10kb的外源DNA。第57頁，共86頁，2023年，2月20日，星期三粘粒（cosmid）載體的特點

粘粒載體長度為4～6kb，由質(zhì)粒的復(fù)制子（通常是ColE1）和λ噬菌體的粘性末端（cos）合在一起構(gòu)建而成，含有一個抗藥性標(biāo)記（通常是ampr）和若干個限制性內(nèi)切酶的單一切割位點，能容納35~45kb長的外源DNA片段。插入外源DNA后可被λ噬菌體的包裝蛋白包裝，然后轉(zhuǎn)導(dǎo)大腸桿菌。在宿主細(xì)胞中以質(zhì)粒的形式擴(kuò)增。第58頁，共86頁，2023年，2月20日，星期三圖6

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粘粒載體及其克隆步驟9第59頁，共86頁，2023年，2月20日，星期三粘粒（cosmid）載體的特點

通過轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)入宿主細(xì)胞后，cos位點連接成環(huán)狀，以質(zhì)粒的方式復(fù)制，但不能裂解宿主細(xì)胞。若給宿主細(xì)胞再感染λ噬菌體，或使溶源性宿主菌轉(zhuǎn)變成裂解生長，則裂解出的轉(zhuǎn)導(dǎo)性顆粒中一部分含有重組粘粒，其余部分含有λ噬菌體DNA。若感染的λ噬菌體是cos序列缺陷的，則裂解出的轉(zhuǎn)導(dǎo)性顆粒全部是重組粘粒。這些含有重組粘粒的轉(zhuǎn)導(dǎo)性顆粒既可以用于轉(zhuǎn)導(dǎo)其它細(xì)菌細(xì)胞，也可以用于保存。第60頁，共86頁，2023年，2月20日，星期三粘粒（cosmid）載體的特點

在載體中增殖的DNA片段越大，基因文庫中重組體的數(shù)目就越小，有利于減少工作量，還能克隆完整的真核基因（含有內(nèi)含子，很大）。粘粒載體適合于克隆大片段的DNA，小片段DNA插入后因不能形成有感染力的轉(zhuǎn)導(dǎo)性顆粒，反而不能克隆。粘粒載體容納外源DNA的范圍是47～33kb。第61頁，共86頁，2023年，2月20日，星期三單鏈絲狀噬菌體M13載體的特點基因組為單鏈環(huán)狀DNA（正鏈），全長6407個核苷酸。在宿主細(xì)胞中可轉(zhuǎn)變成雙鏈環(huán)狀DNA（雙鏈復(fù)制型）。在宿主細(xì)胞中可大量合成單鏈DNA（正鏈）。在雙鏈環(huán)狀DNA中插入外源DNA，可大量合成外源DNA的一條鏈（插在噬菌體正鏈DNA中的那一條），為DNA測序提供模板，或提供單鏈探針。第62頁，共86頁，2023年，2月20日，星期三圖6－10M13mp18載體圖譜第63頁，共86頁，2023年，2月20日，星期三M13單鏈?zhǔn)删w載體的構(gòu)建

在M13噬菌體的基因Ⅱ和基因Ⅳ之間有一個507bp的間隔，對M13進(jìn)行改造以使其成為載體主要是在這一位置進(jìn)行，在此位置插入標(biāo)記基因lacZ和多克隆位點，但不要影響復(fù)制起始區(qū)的功能，因為復(fù)制起始區(qū)也在這一位置。

M13噬菌體載體可以攜帶約30kb的外源DNA。第64頁，共86頁，2023年，2月20日，星期三M13噬菌體RFDNA的復(fù)制

當(dāng)M13噬菌體以吸附細(xì)胞壁上性纖毛的方式，感染雄性大腸桿菌（F+）后，在細(xì)菌胞內(nèi)酶的作用下合成負(fù)鏈DNA而成為雙鏈DNA，稱為復(fù)制型DNA（replicationformDNA，RFDNA）病毒基因以RFDNA負(fù)鏈為模板轉(zhuǎn)錄，當(dāng)基因Ⅱ產(chǎn)物在親代RFDNA的正鏈特定位點上產(chǎn)生一個切口時，病毒基因組的擴(kuò)增即開始。新合成的正鏈逐漸取代原有的正鏈。當(dāng)復(fù)制叉繞負(fù)鏈模板整整一周時，基因Ⅱ產(chǎn)物將被取代的正鏈切下，經(jīng)環(huán)化及合成負(fù)鏈后，又產(chǎn)生了一個RFDNA，依此繼續(xù)擴(kuò)增。第65頁，共86頁，2023年，2月20日，星期三M13噬菌體RFDNA的復(fù)制第66頁，共86頁，2023年，2月20日，星期三M13噬菌體正鏈DNA的復(fù)制

當(dāng)細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)RFDNA的拷貝數(shù)達(dá)到100~200個時，細(xì)胞內(nèi)也產(chǎn)生了足夠量的單鏈DNA結(jié)合蛋白（基因Ⅴ產(chǎn)物），這些蛋白有兩個作用，一是抑制基因ⅡmRNA的翻譯，二是與新合成的正鏈DNA結(jié)合，阻止它再轉(zhuǎn)變成RFDNA。此時RFDNA的數(shù)量保持不變，但單鏈正鏈DNA的合成不斷進(jìn)行。產(chǎn)生的子代單鏈DNA在溢出宿主細(xì)胞時被衣殼蛋白包被，衣殼蛋白是基因Ⅲ和基因Ⅷ的產(chǎn)物。第67頁，共86頁，2023年，2月20日，星期三感染M13噬菌體形成渾濁噬菌斑

感染M13噬菌體的細(xì)菌并不被裂解，可繼續(xù)生長，但感染了M13噬菌體的細(xì)菌的生長速率為正常生長速率的1/2。在瓊脂或瓊脂糖覆蓋層內(nèi)生長的未感染細(xì)菌生長較快，形成較為渾濁的背景，相對于這一背景，由生長緩慢的感染細(xì)菌形成一個不斷擴(kuò)大的環(huán)帶，最終形成肉眼可見的噬菌斑。每個感染細(xì)胞內(nèi)每一代可產(chǎn)生數(shù)百個病毒顆粒，因此，在培養(yǎng)基中將積聚大量的病毒顆粒。

第68頁，共86頁，2023年，2月20日，星期三DNA分子的連接粘性末端的連接可使用大腸桿菌DNA連接酶。DNA連接酶催化DNA連接反應(yīng)時要加ATP。平端的連接應(yīng)采用T4噬菌體DNA連接酶。平端連接相對于粘端連接是低效反應(yīng)，它要求4個條件：低濃度的ATP、高濃度的連接酶、高濃度的平端底物、沒有亞精胺類的多胺。加入適量的聚乙二醇（PEG）能促進(jìn)平端的連接。第69頁，共86頁，2023年，2月20日，星期三平端產(chǎn)生的方法①用適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切酶直接切出平端；②對5’突出粘性末端用Klenow片段或T4DNA

聚合酶補平；③對3’突出粘性末端用T4DNA聚合酶修平；④對3’突出或5’突出粘性末端用S1核酸酶切平。第70頁，共86頁，2023年，2月20日，星期三平端加連接子后連接平末端添加連接子（linker）后，用限制性內(nèi)切酶切出粘性末端后連接第71頁，共86頁，2023年，2月20日，星期三平端加適配器后連接平末端添加適配器（adaptor），產(chǎn)生粘性末端后連接第72頁，共86頁，2023年，2月20日，星期三平端的同聚物加尾連接第73頁，共86頁，2023年，2月20日，星期三相同粘性末端的連接切口切口第74頁，共86頁，2023年，2月20日，星期三不同粘性末端的連接（T4DNA聚合酶有3’→5’外切活性）補齊法切齊法第75頁，共86頁，2023年，2月20日，星期三

為了分子克隆，重組DNA應(yīng)導(dǎo)入易于培養(yǎng)繁殖的細(xì)胞，如大腸桿菌、酵母等。為了獲得轉(zhuǎn)基因物種，也可導(dǎo)入動物、植物或其它微生物細(xì)胞。對于不同的受體細(xì)胞，應(yīng)選用相應(yīng)的載體（能否復(fù)制、遺傳標(biāo)記、能否表達(dá)、插入失活等）。在一般情況下，受體細(xì)胞對于質(zhì)粒轉(zhuǎn)化和病毒DNA轉(zhuǎn)染是不敏感的。采用適當(dāng)?shù)奈锢砘蚧瘜W(xué)方法處理受體細(xì)胞，可以使其成為接受外源DNA的敏感態(tài)，這時的受體細(xì)胞稱為感受態(tài)細(xì)胞。

重組DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞第76頁，共86頁，2023年，2月20日，星期三CaCl2法（化學(xué)法）

低溫下用CaCl2處理，即可形成感受態(tài)細(xì)胞。加入重組質(zhì)粒，42℃保溫1.5分鐘即可使外源DNA進(jìn)入宿主細(xì)胞。第77頁，共86頁，2023年，2月20日，星期三高壓電穿孔法（物理法）

將受體細(xì)胞和重組DNA（或直接是外源DNA）混合后，加高壓電脈沖可導(dǎo)致轉(zhuǎn)