高級(jí)食品生化專題二-第1章課件

生物大分子的分離提取與純化專題二一、物質(zhì)的性質(zhì)與提取物質(zhì)的性質(zhì)與提取方法的選擇要取得好的提取效果，最重要的是要針對(duì)生物材料和目的物的性質(zhì)，選擇合適的溶劑系統(tǒng)與提取條件。生物材料及目的物與有關(guān)的一些性狀，包括溶解性質(zhì)、相對(duì)分子質(zhì)量、等電點(diǎn)、存在方式、穩(wěn)定性、比重、粒度、粘度、目的物含量、主要雜質(zhì)種類及溶解性質(zhì)、有關(guān)酶類的特征等。其中最重要的是目的物與主要雜質(zhì)在溶解度方面的差異以及它們的穩(wěn)定性。第一章

在提取過(guò)程中盡量增加目的物的溶解度，盡可能降低雜質(zhì)的溶解度，同時(shí)充分重視生物材料及目的物再提取過(guò)程中的活性變化。對(duì)酶類的提取要防止輔酶的丟失和其他失活因素的干擾。對(duì)蛋白質(zhì)類要防止其高級(jí)結(jié)構(gòu)的破壞，即變性作用，應(yīng)避免高熱，強(qiáng)烈攪拌，產(chǎn)生大量泡沫，強(qiáng)酸、強(qiáng)堿及重金屬離子的作用。多肽類及核酸類需注意避免酶的降解作用。提取過(guò)程中，應(yīng)在低溫下進(jìn)行，并添加某些酶抑制劑。對(duì)脂類生化制品應(yīng)特別注意防止氧化作用，減少與空氣的接觸，如添加抗氧化劑、通氮?dú)饧氨芄獾取?/p>

1、生物大分子活性物質(zhì)的存在方式

生物活性物質(zhì)分為胞內(nèi)和胞外兩種存在部位胞外:消化酶淀粉酶、蛋白質(zhì)水解酶、糖化酶難于從消化道收集，只能由相應(yīng)的腺體提取分離。胞內(nèi):細(xì)胞質(zhì)RNA

細(xì)胞核真核生物DNA

線粒體電子傳遞系統(tǒng)物質(zhì)、糖類、脂肪酸氧化分解的酶類對(duì)于胞內(nèi)物質(zhì)的提取要先破碎細(xì)胞，對(duì)于膜上物質(zhì)則要選擇適當(dāng)?shù)娜軇┦蛊鋸哪ど先芙庀聛?lái)。2、生物大分子間的作用力作為生物大分子，其基本骨架中各原子與基團(tuán)間都是共價(jià)結(jié)合，整個(gè)分子的一級(jí)結(jié)構(gòu)比較穩(wěn)定，但分子間的連接主要是通過(guò)一些非共價(jià)鍵如氫鍵、鹽鍵、范德華力、堿基堆積力所維系，其鍵能較弱，它們與生物分子的生物功能關(guān)系十分密切，因此要采取不同方法使之解離，而不損傷其分子基本結(jié)構(gòu)，同時(shí)確?？臻g結(jié)構(gòu)不受破壞。故常常在十分溫和的條件下操作，以避免因強(qiáng)烈外界因素的作用而喪失其生物活性。三、生物大分子活性物質(zhì)的存在特點(diǎn)1、生物材料組成的復(fù)雜性

生物材料中的化學(xué)組成十分復(fù)雜，不同生物含有不同種類的活性物質(zhì)。同種生物在細(xì)胞與細(xì)胞之間、組織與組織之間，由于細(xì)胞類型、年齡、分化程度不同都會(huì)改變活性物質(zhì)的組成。

植物：葉綠素、胡蘿卜素、花色素類動(dòng)物：細(xì)胞色素、原卟啉、藻類：藻膽色素B、生物材料中的生化組成數(shù)量大、種類多

目的物與雜質(zhì)的理化性質(zhì)如溶解度、相對(duì)分子量、等電點(diǎn)都十分接近。在純化過(guò)程中生物材料中有效成分的生理活性處于不斷變化中，它們可能被材料中自身的代謝酶所破壞，或?yàn)槲⑸锘顒?dòng)所分解，還可能在制備過(guò)程中受到酸堿、鹽、重金屬離子、機(jī)械攪拌、溫度的作用改變其生理活性。四、生物大分子常規(guī)的提取方法選擇性提取包含著分離純化；沉淀分離包含著濃縮；從發(fā)酵液中分離胞外酶，則不用破碎細(xì)胞離心去菌體后，就可直接進(jìn)行分離純化。選擇性溶解和沉淀經(jīng)常交替使用，各種柱層析常放在純化的后階段結(jié)晶五、原料的選擇（1）生物的生長(zhǎng)期：如凝乳酶只能以哺乳期小牛、仔羊的第四胃為材料，成年牛、羊胃不適用。提取胸腺素應(yīng)選用幼年動(dòng)物胸腺為原料。（3）雜質(zhì)情況難于分離的雜質(zhì)會(huì)增加工藝的復(fù)雜性，嚴(yán)重影響回收率、質(zhì)量和經(jīng)濟(jì)效益。選材時(shí)，應(yīng)避免與目的物相似的雜質(zhì)對(duì)純化過(guò)程的干擾。如胰臟含磷酸單酯酶和磷酸二酯酶，兩者難于分開(kāi)，故不選用胰臟為原料制備磷酸單酯酶，而改用前列腺為原料。（4）來(lái)源應(yīng)選用來(lái)源豐富的材料，盡量不與其他產(chǎn)品爭(zhēng)原料，最好一物多用。如用胰臟可同時(shí)制備彈性蛋白酶、激肽釋放酶、胰島素和胰酶。

總之，提取是分離純化的前提，將經(jīng)過(guò)預(yù)處理或破碎的細(xì)胞或組織置于一定條件下或溶劑中，使被提取的生物大分子以溶解狀態(tài)充分的釋放出來(lái)，并盡可能保持原來(lái)的天然狀態(tài)，不丟失生物活性的過(guò)程。用冷溶劑從固體物質(zhì)提取的過(guò)程可稱為浸漬。用熱溶劑則可稱為浸提，也稱浸煮。

提取通常貫穿再分離純化過(guò)程中，包括生化物質(zhì)與細(xì)胞固體或其他相結(jié)合物質(zhì)由固相轉(zhuǎn)移到液相中，或從細(xì)胞內(nèi)的生理狀態(tài)轉(zhuǎn)入外界特定的溶液中。提取可分為兩類：一類是對(duì)固體的提取，也稱液－固提取，被處理的原料為固體；另一類是對(duì)液體的提取，也稱液－液提取（習(xí)慣上多稱為萃?。?，被處理的原料為液體。（一）分離純化原理生物大分子的分離制備技術(shù)大都根據(jù)混合物中的不同組分分配率的差別，把它們分配于可用機(jī)械方法分離的兩個(gè)或幾個(gè)物相中（如有機(jī)溶劑抽提、鹽析、結(jié)晶等）?；蛘邔⒒旌衔镏糜谀骋晃锵啵ù蠖鄶?shù)是液相）中，外加一定作用力，使多組分分配于不同區(qū)域，從而達(dá)到分離目的（如電泳、超離心、超濾等）。除了一些小分子如氨基酸、脂肪酸，某些維生素及固醇類外，幾乎所有生物大分子都不能融化，也不能蒸發(fā)，只限于分配在固相或液相中，并在兩相中相互交替進(jìn)行分離純化。在實(shí)際操作中，我們往往根據(jù)一些原理對(duì)生物大分子進(jìn)行分離純化。

根據(jù)分子形狀和大小不同進(jìn)行分離，如差速離心與超離心、膜分離（透析、電滲析）與超濾法、凝膠過(guò)濾法。根據(jù)分子電離性質(zhì)（帶電性）的差異進(jìn)行分離，如離子交換法、電泳法、等電聚焦法。根據(jù)分子極性大小及溶解度不同進(jìn)行分離，如溶劑提取法、逆流分配法、分配層析法、鹽析法、等電點(diǎn)沉淀法及以及溶劑分級(jí)沉淀法。根據(jù)物質(zhì)吸附性質(zhì)的不同進(jìn)行分離，如選擇性吸附與吸附層析法。根據(jù)配體特異性進(jìn)行分離，如親和層析法。

精制一個(gè)具體生物產(chǎn)品，常常需要根據(jù)它的各種理化性質(zhì)和生物學(xué)活性，采用以上各種分離方法進(jìn)行有機(jī)組合，才能達(dá)到預(yù)期目的。（二）分離純化初期使用方法的

選擇與使用程序分離純化初期使用方法的選擇與使用的程序：1．分離純化初期使用方法的選擇2．各種分離純化方法的使用程序3．分離后期的保護(hù)性措施（一）鹽析法

用添加中性鹽的方法來(lái)使某些蛋白質(zhì)（或酶）從稀溶液中沉淀出來(lái)，從而達(dá)到樣品濃縮的目的。最常用的中性鹽是硫酸銨，其次是硫酸鈉、氯化鈉、硫酸鎂、硫酸鉀等。（二）常壓蒸發(fā)法

蒸發(fā)是溶液表面的水或溶劑分子獲得的動(dòng)能超過(guò)溶液內(nèi)分子間的吸引力以后，脫離液面進(jìn)入空間的過(guò)程?？梢越柚舭l(fā)從溶液中除去水或溶劑使溶液濃縮。

在常壓下加熱使溶劑蒸發(fā)，最后溶液被濃縮稱為常壓蒸發(fā)。該方法操作簡(jiǎn)單，但僅適用于濃縮耐熱物質(zhì)及回收溶劑。裝液容器于接收器之間要安裝冷凝管使溶劑的蒸汽冷凝。裝液要求需用圓底蒸餾瓶，裝液量不宜超過(guò)蒸餾瓶的1/2容積，以免沸騰時(shí)溶液霧滴被蒸氣帶走或溶液沖出蒸餾瓶。加熱前需加少量玻璃珠或碎瓷片，使溶液不致過(guò)熱暴沸。暴沸易使液體沖出，或使蒸餾瓶壓力陡增二致破裂。

操作時(shí)，先接通冷卻水，避免直接加熱，要選用適當(dāng)?shù)臒嵩?。熱浴溫度較溶劑沸點(diǎn)高20～30℃，溫度過(guò)高使蒸發(fā)速度太快，蒸餾瓶?jī)?nèi)的蒸氣壓超過(guò)大氣壓以后易將瓶塞沖開(kāi)，逸出大量蒸氣，甚至使蒸餾瓶炸裂。普通減壓的加溫蒸發(fā)器常用圓底燒瓶，先將液體加入容器，接通冷卻水，再打開(kāi)真空泵。開(kāi)始時(shí)減壓要緩慢，加熱致一定溫度后，溶劑即大量蒸發(fā)。如氣泡過(guò)多，應(yīng)立即打開(kāi)閥門，降低真空度。八、生物大分子的結(jié)晶

結(jié)晶是使溶質(zhì)呈晶態(tài)從溶液中析出的過(guò)程。由于初析出的結(jié)晶多少會(huì)帶有一些雜質(zhì)，因此需要反復(fù)結(jié)晶才能得到較純的產(chǎn)品。從比較不純的結(jié)晶再通過(guò)結(jié)晶作用精制得到較純的結(jié)晶，這一過(guò)程叫做重結(jié)晶（或稱再結(jié)晶、復(fù)結(jié)晶）。

結(jié)晶是分離純化蛋白質(zhì)、酶等生化產(chǎn)品的一種有效手段。變性蛋白質(zhì)不能結(jié)晶，所以凡結(jié)晶狀態(tài)的蛋白質(zhì)都能保持天然狀態(tài)。晶體內(nèi)部有規(guī)律的結(jié)構(gòu)，決定了晶體的形成必是相同的離子或分子，才可能按一定距離周期性地定向排列而成，所以能形成晶體的物質(zhì)是比較純的。在生化制備中，許多小分子物質(zhì)如各種有機(jī)酸、單糖、核苷酸、維生素、輔酶等，由于其結(jié)構(gòu)比較簡(jiǎn)單，分離至一定純度后，絕大部分都可以定向聚合形成分子型或離子型的晶體。但有的生化產(chǎn)品，如核酸，由于分子高度不對(duì)稱，呈麻花形螺旋結(jié)構(gòu)，雖已達(dá)到很高的純度，也