動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)和專用課件

第二章動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)和專用生物反應(yīng)器為什么?動物細胞培養(yǎng)對生產(chǎn)生物工程產(chǎn)品,特別是功能蛋白質(zhì)方面的優(yōu)勢:1)同源性,直接進行翻譯后加工,蛋白質(zhì)可直接折疊成正確的構(gòu)象2)有利于產(chǎn)品的分離純化市場需求:目前全世界蛋白治療藥物的迅速增長和市場需求已遠遠超過了現(xiàn)有生產(chǎn)能力。生產(chǎn)產(chǎn)品:動物細胞規(guī)?；a(chǎn)重組蛋白和抗體的工藝選擇可考慮使用當前較成熟的工業(yè)化支持技術(shù)平臺，以縮短產(chǎn)品工藝研發(fā)的時間，加快工業(yè)化進程。當前被FDA批準的生物技術(shù)產(chǎn)品以及公開發(fā)表的生產(chǎn)工藝占有主流優(yōu)勢的是攪拌式生物反應(yīng)器懸浮培養(yǎng)，工藝設(shè)計是流加或灌流培養(yǎng)。其大規(guī)模細胞培養(yǎng)生產(chǎn)所面臨的挑戰(zhàn)，是獲得最大生產(chǎn)力的同時注重維持產(chǎn)品的質(zhì)量；去除所有培養(yǎng)環(huán)境中外源因子的污染，更為精確有效的工藝控制手段，規(guī)?；囵B(yǎng)中氧氣的限定與溶解CO2濃度累積的控制等。一個特殊而前景無量的生物反應(yīng)器:動物乳泉生物反應(yīng)器一.貼壁培養(yǎng)概念:貼壁依賴性細胞在培養(yǎng)中要貼附于壁上才能迅速鋪展,開始有絲分裂并迅速進入對數(shù)生長期,這種培養(yǎng)方式就叫貼壁培養(yǎng).多數(shù)動物細胞的培養(yǎng)都采取這種方式.一.貼壁培養(yǎng)微載體培養(yǎng)的優(yōu)點:表面積/體積比大;微載體懸浮于培養(yǎng)基中,細胞生長環(huán)境均一,便于監(jiān)測和控制;培養(yǎng)基利用率高;采樣重演性好;收獲過程不復(fù)雜;放大較容易;勞動強度小,占用空間小.二.懸浮培養(yǎng)概念:是指細胞在培養(yǎng)器中自由懸浮生長的過程.主要用于非貼壁依賴性細胞培養(yǎng),如雜交瘤細胞等.是在微生物發(fā)酵的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的;可以借鑒微生物發(fā)酵的經(jīng)驗;由于動物細胞比較脆弱,所以在攪拌通氣等方式上必須比微生物培養(yǎng)更加溫和.第二節(jié)動物細胞培養(yǎng)的操作方式分為5種:分批式、流加式、半連續(xù)式、連續(xù)式、灌注式一、分批式操作：概念：是將細胞和培養(yǎng)液一次性裝入反應(yīng)器內(nèi)，進行培養(yǎng)，細胞不斷生長，產(chǎn)物也不斷形成，經(jīng)過一段時間后，將整個反應(yīng)系取出。培養(yǎng)過程：滯后期、對數(shù)生長期、減速期、穩(wěn)定期、衰退期優(yōu)點：操作簡便，容易掌握，是最常用的方式；缺點：不能使細胞自始至終處于最優(yōu)條件下。二、流加式操作：概念：先將一定量的培養(yǎng)液裝入反應(yīng)器，，在培養(yǎng)過程中隨著細胞對營養(yǎng)物質(zhì)的不斷消耗，新的營養(yǎng)成分不斷補充至反應(yīng)器內(nèi)，使細胞進一步代謝，到反應(yīng)終止時取出整個反應(yīng)系。特點：1）能夠調(diào)節(jié)培養(yǎng)環(huán)境中的營養(yǎng)物質(zhì)濃度；2）整個過程中反應(yīng)體積是變化的。三、半連續(xù)式操作（反復(fù)分批式、換液培養(yǎng)）：概念：在分批培養(yǎng)操作的基礎(chǔ)上，不全部取出反應(yīng)系，剩余部分重新補充新的營養(yǎng)成分，再按分批式操作方式進行培養(yǎng)，反應(yīng)器內(nèi)培養(yǎng)液的總體積保持不變。優(yōu)點：可反復(fù)收獲培養(yǎng)液，對培養(yǎng)基因工程動物細胞分泌有用產(chǎn)物或病毒培養(yǎng)過程比較實用。四、連續(xù)操作：概念：在培養(yǎng)過程中一方面新鮮培養(yǎng)液不斷加入反應(yīng)器內(nèi)，另一方面又將反應(yīng)液連續(xù)不斷地取出，使反應(yīng)條件處于一種恒定狀態(tài)。優(yōu)點：維持細胞一直處于優(yōu)化狀態(tài)下，促進細胞生長和產(chǎn)物的形成；對細胞生理和代謝規(guī)律的研究是一種重要的手段。五、灌注式操作培養(yǎng)：概念：細胞培養(yǎng)過程中一方面不斷加入新鮮培養(yǎng)基，另一方面又將反應(yīng)液連續(xù)不斷地取出，但細胞留在反應(yīng)器內(nèi)，使細胞處于一種不斷的營養(yǎng)狀態(tài)。優(yōu)點：可以把培養(yǎng)過程保持在穩(wěn)定的、廢代謝物低于抑制水平下的狀態(tài)。六大限制細胞生長的：1、培養(yǎng)基組成：血清是目前細胞培養(yǎng)基中不可缺少的成分，向細胞提供生長所需要的激素、轉(zhuǎn)移蛋白和其他營養(yǎng)成分，已成為細胞培養(yǎng)達到最優(yōu)化和降低成本的主要障礙。降低血清用量和采用無血清細胞培養(yǎng)基是目前研究的熱點。血清培養(yǎng)基的主要缺點及其原因：血清是培養(yǎng)基成本的主要部分；血清中含有細胞生長必須的微量組分，但這些組分的成分及其作用至今未清楚，因此無法取代；血清的存在是產(chǎn)物純化的主要障礙；血清是病毒污染及其他未知因素影響的主要來源，增加了細胞培養(yǎng)產(chǎn)品潛在的使用危險；血清同時也有生長抑制的作用；血清使用使實驗和生產(chǎn)過程標準化變得困難。2、培養(yǎng)條件優(yōu)化和控制的困難：動物細胞培養(yǎng)系統(tǒng)能達到的細胞密度較低的主要原因是培養(yǎng)條件和最優(yōu)化控制的困難，包括：細胞代謝產(chǎn)物的毒害：乳酸、氨等；營養(yǎng)物的耗竭接種的細胞最小密度；解決問題的方法是通過過程調(diào)控來實現(xiàn)：灌注系統(tǒng)、換液、流加等，其中灌注是最好的方法。同時采用合理的培養(yǎng)系統(tǒng)以增加表面積并提供最佳的物理化學(xué)環(huán)境。4、產(chǎn)物表達的控制問題：問題：細胞生長的最優(yōu)化條件并不一定是表達的產(chǎn)物的最優(yōu)化條件？問題的解決在于上游分子生物學(xué)的研究5、硬件和過程設(shè)計中的問題：細胞培養(yǎng)條件的控制（溫度、溶解氧、二氧化碳、pH、滲透壓），其中充分的氧傳遞是所有生物反應(yīng)器中的共同問題；而其他條件對動物細胞來說可以接受的范圍都比較窄。污染的排除；遏制潛在生物毒害物的擴散；足夠表面積的提供；培養(yǎng)過程中剪切力的控制（攪拌、通氣、收獲）6、產(chǎn)物收獲目前細胞培養(yǎng)產(chǎn)物的收率很低，不及總蛋白的1%，主要原因在于：血清蛋白質(zhì)的污染；細胞表達產(chǎn)物濃度低；產(chǎn)物在培養(yǎng)條件下不穩(wěn)定；解決方法：使用無血清培養(yǎng)基；開發(fā)在無血清培養(yǎng)基中穩(wěn)定蛋白質(zhì)產(chǎn)物的方法；開發(fā)篩選技術(shù)以得到產(chǎn)量高的細胞克??；開發(fā)產(chǎn)物分離技術(shù)：親和柱、中空纖維、微囊等一、生物反應(yīng)器的種類：懸浮培養(yǎng)用反應(yīng)器空氣提升式；攪拌槽；中空纖維管；陶質(zhì)矩形通道蜂窩狀生物反應(yīng)器貼壁培養(yǎng)用攪拌槽（微載體系統(tǒng)）中空纖維管陶質(zhì)矩形通道蜂窩狀生物反應(yīng)器包埋培養(yǎng)用流化床固定床氣升式細胞培養(yǎng)生物反應(yīng)器：優(yōu)點：產(chǎn)物的湍流溫和而均勻，剪切力相當小，對細胞損傷小，氧傳遞速率高；液體循環(huán)量大，細胞和營養(yǎng)分布均勻。一般產(chǎn)生泡沫不多。動物細胞反應(yīng)器的控制溶氧控制：針對動物培養(yǎng)的合適攪拌，加入少量溶氧量大的不相溶溶濟，改變通入氣體的氮氧比；pH控制：采用通入CO2/NaOH緩沖液系統(tǒng)來控制，可避免局部的極端pH出現(xiàn)；溫度和攪拌轉(zhuǎn)速的控制比較簡單復(fù)習(xí)試述動物細胞培養(yǎng)的重要性.試述動物細胞的特點及培養(yǎng)的對策.