第十五章重組技術(shù)的基本原理

第十五章重組技術(shù)的基本原理演示文稿當前1頁，總共42頁。（優(yōu)選）第十五章重組技術(shù)的基本原理當前2頁，總共42頁。一、重要的工具酶及其作用特點一般把DNA分子切割、DNA片段末端修飾和DNA片段連接等所用的酶稱為工具酶。（一）限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶（Restrictionendonuclease）：是一類以環(huán)狀或線形雙鏈DNA為底物，能識別DNA中的特定核苷酸序列，并在合適反應條件下，使每條的一個磷酸二酯鍵斷開，產(chǎn)生３'-OH和5'-P基團DNA片段的內(nèi)脫氧核酸酶(endodeoxyribonuclease)。當前3頁，總共42頁。當前4頁，總共42頁。（二）DNA連接酶DNA連接酶（ligase）：能夠催化兩個DNA片段末端之間的-P基團和-OH基團形成磷酸二酯鍵的酶。當前5頁，總共42頁。（三）DNA聚合酶當前6頁，總共42頁。當前7頁，總共42頁。（四）逆轉(zhuǎn)錄酶當前8頁，總共42頁。（五）RNA聚合酶當前9頁，總共42頁。當前10頁，總共42頁。二、目的基因的載體類型及其功能載體（vector）:能夠攜帶外源基因進入受體細胞的DNA分子?；蚩寺≥d體必備條件：（1）受體細胞本來就有的或受體細胞可以接受的；（2）具有能使外源DNA片段插入的多克隆位點（MCS，multiplecloningsite）；（3）能進行自我復制，具有復制原點（ORI，origin）；（4）具有選擇標記，承載外源DNA片段的載體進入細胞后，以便篩選克隆子。當前11頁，總共42頁。（一）質(zhì)粒及其功能當前12頁，總共42頁。當前13頁，總共42頁。（二）噬菌體及其功能當前14頁，總共42頁。（三）考斯質(zhì)粒當前15頁，總共42頁。（四）動物病毒的載體作用當前16頁，總共42頁。

（五）植物寄生菌作為目的DNA的載體

Ti質(zhì)粒（Tiplasmid）：是一種細菌質(zhì)粒，存在于土壤農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens）（革蘭氏陰菌）細胞中，可誘導植物產(chǎn)生瘤細胞(Tumor-inducing,Ti)，冠癭瘤（growngalltumors)。

當前17頁，總共42頁。誘導植物產(chǎn)生瘤細胞當前18頁，總共42頁。第二節(jié)DNA重組的基本技術(shù)步驟1、目的基因的制備2、目的基因與載體的重組3、重組體導入宿主細胞進行擴增4、克隆基因的鑒定當前19頁，總共42頁。當前20頁，總共42頁。ForeignDNAtobeinsertedPlansmidvectorJoiningRecombinantDNAmolecule

Introductionintohostcellsbytransformationofviralinfection

HostchromatemeSlectionforcellscoteiningarecombinantDNAmoleculeCloning+當前21頁，總共42頁。一、目的基因的制備方法

基因工程的主要目的是通過優(yōu)良性狀相關基因的重組，獲得具有高度應用價值的新物種。

為此，必須從現(xiàn)有生物群體中，根據(jù)需要分離用于克隆的此類基因，這樣的基因通常稱為目的基因。當前22頁，總共42頁。（一）建立DNA文庫某種生物基因組全部遺傳信息的一系列DNA片段，通過克隆載體貯存在一種受體菌的群體之中，這種包含某生物基因組全部DNA片段受體菌群體（一套克?。┓Q為這種生物的基因組文庫。當前23頁，總共42頁?；蚪M文庫建立順序當前24頁，總共42頁?；蛭膸旌蚦DNA文庫的建立組織可克隆之DNA載體DNAcDNAmRNA部分或完全酶解DNADNA長度分級甲基化，雙鏈接頭DNADNA與載體連接引入大腸桿菌鑒定文庫的滴度和特性擴增后供長期儲存篩選出所需要的克隆當前25頁，總共42頁。（三）人工合成DNA片段當前26頁，總共42頁。（四）聚合酶鏈式反應（PCR）擴增DNA

1PCR的原理：1985年Mullis發(fā)明PCR（

polymerasechainreaction）快速擴增DNA的方法。該法模仿體內(nèi)DNA的復制過程，首先使DNA變性，兩條鏈解開，然后使引物模板退火，二者堿基配對，DNA聚合酶隨即以4種dNTP為底物，在引物的引導下合成與模板互補的DNA新鏈。重復此過程，DNA以指數(shù)方式擴增。擴增的公式為:Y=(1+X)n

式中y一產(chǎn)量;X--擴增效率;n一循環(huán)次數(shù)。當前27頁，總共42頁。PCR技術(shù)原理示意圖靶序列變性和引物復姓循環(huán)1循環(huán)2循環(huán)3變性和引物復姓鏈延伸Tag酶鏈延伸當前28頁，總共42頁。二、目的DNA和載體的體外連接目的基因?qū)胧荏w細胞之前，一般須先把含目的基因的DNA片段組入合適的克隆載體。當前29頁，總共42頁。三、將重組的DNA復合物導入受體細胞基因克隆的受體細胞：是能攝取外源DNA(基因)并使其穩(wěn)定維持的細胞。目前用作基因克隆受體的原核生物主要是大腸桿菌，藍藻和農(nóng)桿菌等也被廣泛應用。感受態(tài)細胞:指處于能攝取外界DNA分子的生理狀態(tài)的細胞。當前30頁，總共42頁。

（一）重組DNA分子轉(zhuǎn)化

大腸桿菌是用得最廣泛的基因克隆受體。轉(zhuǎn)化（transformation）：攜帶目的基因的外源DNA分子通過與膜結(jié)合進入受體細胞，并在其中穩(wěn)定維持和表達的過程。以質(zhì)粒為載體。

當前31頁，總共42頁。轉(zhuǎn)化當前32頁，總共42頁。（二）噬菌體重組體的轉(zhuǎn)染

轉(zhuǎn)染：通過噬菌體(病毒)顆粒感染，把DNA導入被感染的受體細胞的過程。含目的基因的DNA與噬菌體（病毒）載體的重組DNA分子導入受體細胞，必須進行體外包裝。當前33頁，總共42頁。四、重組克隆的篩選方法（一）利用載體的特殊標記進行篩選當前34頁，總共42頁。當前35頁，總共42頁。（二）對菌落原位雜交法鑒定克隆先制備含目的基因的DNA片段的探針，隨后采用斑點雜交或DNA印跡(southernblotting)等方法進行鑒定。（1）斑點雜交法提取待鑒定的克隆子的總DNA，直接固定在分子雜交的膜上，用含目的基因DNA片段的探針與其雜交，若出現(xiàn)明顯的雜交信號，可認為是真的克隆子。當前36頁，總共42頁。（2）southern雜交法斑點雜交、菌落雜交和噬菌斑雜交只能說明克隆子中含目的基因，但不能顯示目的基因定位在受體細胞內(nèi)的染色體基因組上還是其他基因組上。而southern雜交（DNA印跡）則可對它進行定位。

當前37頁，總共42頁。（三）免疫學方法鑒定克隆蛋白質(zhì)印跡（westernblotting）法：提取克隆子總蛋白質(zhì)，經(jīng)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳按分子大小分開后，轉(zhuǎn)移到供雜交用的膜上，隨后與放射性同位素或非放射性標記物標記的特異性抗體結(jié)合，通過抗原抗體反應，在雜交膜上顯示出明顯的雜交信號，表明受體細胞中存在目的基因表達產(chǎn)物。當前38頁，總共42頁。第三節(jié)DNA重組技術(shù)的應用前景當前39頁，總共42頁。基因工程應用大腸桿菌生產(chǎn)人類生長激素當前40頁，總共42頁。二、植物基因