第十章基因組與比較基因組學(xué)

第十章基因組與比較基因組學(xué)第一頁，共五十二頁，2022年，8月28日目錄第一節(jié)

人類基因組計(jì)劃第二節(jié)DNA的鳥槍法序列分析技術(shù)第三節(jié)比較基因組學(xué)（Comparativegenomics）及功能基因組學(xué)研究第二頁，共五十二頁，2022年，8月28日20世紀(jì)人類科技發(fā)展史上的三大創(chuàng)舉1940年代第一顆原子彈爆炸；1960年代人類首次登上月球；1990年代提出并基本完成的人類基因組計(jì)劃（HumanGenomeProject，HGP）

3DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的發(fā)現(xiàn)者之一、美國(guó)國(guó)家衛(wèi)生研究院（NIH）人類基因組研究所第一任所長(zhǎng)J.D.Watson1990年在《Science》上撰文指出，與人類登月計(jì)劃相比，HGP的資金投入少，但它對(duì)人類生活的影響卻可能更深遠(yuǎn)。第三頁，共五十二頁，2022年，8月28日4

隨著這個(gè)計(jì)劃的完成，DNA分子中儲(chǔ)藏的有關(guān)人類生存和繁衍的全部遺傳信息將被破譯，它將不僅幫助我們理解人類如何作為健康人發(fā)揮正常生理功能，還將最終揭開基因在癌癥、早老性癡呆癥、精神分裂癥等嚴(yán)重危害人類健康的疾病中的作用。事實(shí)上，對(duì)人類自身更深入的了解是人類活動(dòng)最重要的組成部分，因?yàn)槿魏巫匀豢茖W(xué)研究，都沒有比人類盡快找出解決自身所面臨的人口膨脹、糧食短缺、環(huán)境污染、疾病危害、能源資源匱乏、生態(tài)平衡破壞、生物物種消亡等一系列難題更為重要、更為迫切。第四頁，共五十二頁，2022年，8月28日51860至1870年奧地利科學(xué)家孟德爾根據(jù)豌豆雜交實(shí)驗(yàn)提出遺傳因子概念，并總結(jié)出孟德爾遺傳定律。1909年丹麥植物學(xué)家和遺傳學(xué)家約翰遜首次提出“基因”這一名詞，用以表達(dá)孟德爾的遺傳因子概念。1944年3位美國(guó)科學(xué)家分離出細(xì)菌的DNA（脫氧核糖核酸），并發(fā)現(xiàn)DNA是攜帶生命遺傳物質(zhì)的分子。1953年美國(guó)人沃森（Watson）和英國(guó)人克里克（Crick）通過實(shí)驗(yàn)提出了DNA分子的雙螺旋模型。1969年科學(xué)家成功分離了第一個(gè)基因?；蚣盎蚪M研究大事記：第五頁，共五十二頁，2022年，8月28日61990年10月被譽(yù)為生命科學(xué)“阿波羅登月計(jì)劃”的國(guó)際人類基因組計(jì)劃啟動(dòng)。1998年一批科學(xué)家在美國(guó)羅克威爾（Rockville）組建塞萊拉遺傳公司，與國(guó)際人類基因組計(jì)劃展開競(jìng)爭(zhēng)。1998年12月一種小線蟲完整基因組序列的測(cè)定工作宣告完成，這是科學(xué)家第一次繪出多細(xì)胞動(dòng)物的基因組圖譜。1999年9月中國(guó)獲準(zhǔn)加入人類基因組計(jì)劃，負(fù)責(zé)測(cè)定人類基因組全部序列的1%。中國(guó)是繼美、英、日、德、法之后第6個(gè)國(guó)際人類基因組計(jì)劃參與過，也是參與這一計(jì)劃的唯一發(fā)展中國(guó)家。1999年12月1日國(guó)際人類基因組計(jì)劃聯(lián)合研究小組宣告，完整破譯出人體第22對(duì)染色體的遺傳密碼，這是人類首次成功地完成人體染色體完整基因序列的測(cè)定。

第六頁，共五十二頁，2022年，8月28日2000年4月6日美國(guó)塞萊拉公司宣布破譯出一名實(shí)驗(yàn)者的完整密碼，但遭到不少科學(xué)家的質(zhì)疑。2000年4月底中國(guó)科學(xué)家按照國(guó)際人類基因組計(jì)劃的部署，完成了1%人類基因組的工作框架圖。2000年5月8日德、日等國(guó)科學(xué)家宣布，已基本完成了人體第21對(duì)染色體的測(cè)序工作。2000年6月26日科學(xué)家公布人類基因組工作草圖，標(biāo)志著人類在解讀自身“生命之書”的路上邁出了重要一步。2000年12月14日美英等國(guó)科學(xué)家宣布繪出擬南芥基因組的完整圖譜。這是人類首次全部破譯出一種植物的基因序列。2001年2月12日中、美、日、德、法、英6國(guó)科學(xué)家和美國(guó)塞萊拉公司聯(lián)合公布人類基因組圖譜及初步分析結(jié)果?？茖W(xué)家首次公布人類基因組草圖“基本信息”。第七頁，共五十二頁，2022年，8月28日8第八頁，共五十二頁，2022年，8月28日第一節(jié)

人類基因組計(jì)劃9第九頁，共五十二頁，2022年，8月28日一、人類基因組計(jì)劃的科學(xué)意義二、遺傳圖的繪制三、物理圖（PhysicalMap）四、轉(zhuǎn)錄圖（ExpressionProfiling）五、人類基因組的序列圖（HumanGenomeSequence）第十頁，共五十二頁，2022年，8月28日11第十一頁，共五十二頁，2022年，8月28日基因控制著細(xì)胞中的蛋白質(zhì)合成，控制著生物的各種遺傳性狀?；蚪M是生物體內(nèi)遺傳信息的集合，是某個(gè)特定物種細(xì)胞內(nèi)全部DNA分子的總和。人體是一個(gè)多細(xì)胞體系，每個(gè)細(xì)胞中都包含46條兩兩配對(duì)的染色體，每23條染色體構(gòu)成一個(gè)染色體組。大約有30億對(duì)核苷酸，編碼了5-6萬個(gè)基因，人類基因組中攜帶了有關(guān)人類個(gè)體生長(zhǎng)發(fā)育、生老病死的全部遺傳信息。從整體上看，不同人類個(gè)體的基因是相同的，因此，我們說“人類只有一個(gè)基因組”，人生來是平等的。當(dāng)然，不同的人可能擁有不同的等位基因，這一點(diǎn)決定了人與人之間個(gè)體上的差異。第十二頁，共五十二頁，2022年，8月28日各種遺傳病的發(fā)生，都源于基因的突變。突變是基因在分子結(jié)構(gòu)上的改變，這種DNA分子結(jié)構(gòu)的改變會(huì)導(dǎo)致基因功能的異常，從而導(dǎo)致遺傳病。例如人類2號(hào)染色體長(zhǎng)臂某段DNA分子的改變，就會(huì)導(dǎo)致并指畸形的產(chǎn)生。至于一些復(fù)雜的疾病，如高血壓、冠心病、糖尿病、癌等，則可能涉及多個(gè)基因的突變。第十三頁，共五十二頁，2022年，8月28日一、人類基因組計(jì)劃的科學(xué)意義（1）確定人類基因組中約5萬個(gè)編碼基因的序列及其在基因組中的物理位置，研究基因的產(chǎn)物及其功能。

（2）了解轉(zhuǎn)錄和剪接調(diào)控元件的結(jié)構(gòu)與位置，從整個(gè)基因組結(jié)構(gòu)的宏觀水平上理解基因轉(zhuǎn)錄與轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)。

（3）從整體上了解染色體結(jié)構(gòu)，包括各種重復(fù)序列以及非轉(zhuǎn)錄“框架序列”的大小和組織，了解各種不同序列在形成染色體結(jié)構(gòu)、DNA復(fù)制、基因轉(zhuǎn)錄及表達(dá)調(diào)控中的影響與作用。

14第十四頁，共五十二頁，2022年，8月28日15（4）研究空間結(jié)構(gòu)對(duì)基因調(diào)節(jié)的作用。有些基因的表達(dá)調(diào)控序列與被調(diào)節(jié)基因從直線距離上看，似乎相距甚遠(yuǎn)，但若從整個(gè)染色體的空間結(jié)構(gòu)上看則恰恰處于最佳的調(diào)節(jié)位置，因此，有必要從三維空間的角度來研究真核基因的表達(dá)調(diào)控規(guī)律。（5）發(fā)現(xiàn)與DNA復(fù)制、重組等有關(guān)的序列。DNA的忠實(shí)復(fù)制保障了遺傳的穩(wěn)定性，正常的重組提供了變異與進(jìn)化的分子基礎(chǔ)。局部DNA的推遲復(fù)制、異常重組等現(xiàn)象則導(dǎo)致疾病或者胚胎不能正常發(fā)育，因此，了解與人類DNA正常復(fù)制和重組有關(guān)的序列及其變化，將對(duì)研究人類基因組的遺傳與進(jìn)化提供重要的結(jié)構(gòu)上的依據(jù)。

第十五頁，共五十二頁，2022年，8月28日（6）研究DNA突變、重排和染色體斷裂等，了解疾病的分子機(jī)制，包括遺傳性疾病、易感性疾病、放射性疾病甚至感染性疾病引發(fā)的分子病理學(xué)改變及其進(jìn)程，為這些疾病的診斷、預(yù)防和治療提供理論依據(jù)。（7）確定人類基因組中轉(zhuǎn)座子、逆轉(zhuǎn)座子和病毒殘余序列，研究其周圍序列的性質(zhì)。了解有關(guān)病毒基因組侵染人類基因組后的影響，可能指導(dǎo)人類有效地利用病毒載體進(jìn)行基因治療。

（8）研究染色體和個(gè)體之間的多態(tài)性。這些知識(shí)可被廣泛用于基因診斷、個(gè)體識(shí)別、親子鑒定、組織配型、發(fā)育進(jìn)化等許多醫(yī)療、司法和人類學(xué)的研究。此外，這些遺傳信息還有助于研究人類歷史進(jìn)程、人類在地球上的分布與遷移以及人類與其他物種之間的比較。第十六頁，共五十二頁，2022年，8月28日17

此外，工業(yè)基因組學(xué)、環(huán)境基因組學(xué)、藥物基因組學(xué)、疾病基因組學(xué)等分支學(xué)科也在不斷發(fā)展。人類基因組研究包括遺傳圖（GeneticMap）繪制、物理圖（PhysicalMap）構(gòu)建、測(cè)序、轉(zhuǎn)錄圖（ExpressionProfiling）繪制和人類基因組的序列圖及基因鑒定等方面的工作。通過多年來的發(fā)展，基因組學(xué)（genomics）作為一門專門學(xué)科，已應(yīng)運(yùn)而生。它涵蓋以下幾個(gè)方面：結(jié)構(gòu)基因組學(xué)，著重遺傳圖、物理圖、測(cè)序等研究功能基因組學(xué)，包括以轉(zhuǎn)錄圖為基礎(chǔ)的功能制圖（基因組表達(dá)圖）比較基因組學(xué)，包括對(duì)不同進(jìn)化階段生物基因組的比較研究，也包括不同人種、族群和群體基因組的比較研究第十七頁，共五十二頁，2022年，8月28日18遺傳圖也稱連鎖圖，是指基因或DNA標(biāo)志在染色體上的相對(duì)位置與遺傳距離，后者通常以基因或DNA片段在染色體交換過程中的分離頻率厘摩（cM）來表示。遺傳圖的繪制是人類基因組研究的第一步，即以染色體上某一點(diǎn)為遺傳標(biāo)記，以與之相伴遺傳的特征為對(duì)象，經(jīng)連鎖分析，將編碼該特征的基因定位于染色體特定位置。cM值越大，兩者之間距離越遠(yuǎn)。二、遺傳圖的繪制第十八頁，共五十二頁，2022年，8月28日通過遺傳圖分析，我們可以大致了解各個(gè)基因或DNA片段之間的相對(duì)距離與方向，了解哪個(gè)基因更靠近著絲粒，哪個(gè)更靠近端粒等。遺傳距離是通過遺傳連鎖分析獲得的，研究中所使用的DNA標(biāo)志越多，越密集，所得到的遺傳連鎖圖的分辨率就越高。經(jīng)典的遺傳標(biāo)記是可被電泳或免疫技術(shù)檢出的蛋白質(zhì)標(biāo)記，如紅細(xì)胞ABO血型位點(diǎn)標(biāo)記，白細(xì)胞HLA位點(diǎn)標(biāo)記等。例如，在ABO血型基因中，位于9號(hào)染色體長(zhǎng)臂3區(qū)4帶（9q34）的基因IA，決定抗原A的存在，表現(xiàn)A型血性狀。由于ABO血型的廣泛存在，所以可用它作遺傳標(biāo)記。第十九頁，共五十二頁，2022年，8月28日當(dāng)在某一家庭中，觀察到了指甲髕骨綜合征與A型血相伴遺傳時(shí)，科學(xué)家就認(rèn)為，這種病的致病基因NP與IA基因相連鎖，也位于9q34區(qū)段。進(jìn)一步的觀察發(fā)現(xiàn)，這個(gè)家庭的后代中，有1/10為A型血而無指甲髕骨綜合征，這表明基因IA和NP發(fā)生了交換，交換率（重組率）為1/10。這時(shí)就可說，基因IA和NP相距較近，連鎖圖上的距離為10厘摩（重組率1％即為1厘摩）。第二十頁，共五十二頁，2022年，8月28日21酵母遺傳分析中最常用的生物化學(xué)標(biāo)簽標(biāo)

簽表

現(xiàn)

型篩

選

方

法ADE2培養(yǎng)基中需加入腺苷酸只能在加入腺苷酸的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)CAN1對(duì)刀豆氨酸有抗性能在含有刀豆氨酸的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)CUP1對(duì)銅離子有抗性能在含有銅離子的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)CYH1對(duì)環(huán)己酰亞胺有抗性能在含有環(huán)己酰亞胺的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)LEU2培養(yǎng)基中需加入亮氨酸只能在加入亮氨酸的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)SUC2能進(jìn)行蔗糖發(fā)酵能在以蔗糖作為唯一碳源的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)URA3培養(yǎng)基中需加入尿嘧啶只能在加入尿嘧啶的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)第二十一頁，共五十二頁，2022年，8月28日22如果只用已知定位的少數(shù)幾個(gè)基因作遺傳標(biāo)記，由于遺傳標(biāo)記的數(shù)目太少，很難繪制完整的連鎖圖。DNA技術(shù)的建立為人類提供了大量新的遺傳標(biāo)記。第一代DNA遺傳標(biāo)記是RFLP（RestrictionFragmentLengthPolymorphism，限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性）。DNA序列上的微小變化，甚至1個(gè)核苷酸的變化，也能引起限制性內(nèi)切酶切點(diǎn)的丟失或產(chǎn)生，導(dǎo)致酶切片段長(zhǎng)度的變化。由于核苷酸序列的改變遍及整個(gè)基因組，特別是進(jìn)化中選擇壓力不是很大的非編碼序列之中，RFLP的出現(xiàn)頻率遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過了經(jīng)典的蛋白質(zhì)多態(tài)性。而且，只要選擇得當(dāng)，生物體內(nèi)出現(xiàn)共顯性RFLP及RAPD分子標(biāo)記的頻率較高。第二十二頁，共五十二頁，2022年，8月28日第二代DNA遺傳標(biāo)記利用了存在于人類基因組中的大量重復(fù)序列，包括重復(fù)單位長(zhǎng)度在15-65個(gè)核苷酸左右的小衛(wèi)星DNA（minisatelliteDNA），重復(fù)單位長(zhǎng)度在2-6個(gè)核苷酸之間的微衛(wèi)星DNA（microsatelliteDNA），后者又稱為簡(jiǎn)短串聯(lián)重復(fù)（STR、STRP或SSLP，shorttandemrepeatpolymorphism或者simplesequencelengthpolymorphism）。STRP有兩個(gè)最突出的優(yōu)點(diǎn)，即作為遺傳標(biāo)記的“多態(tài)性”與“高頻率”。STR的存在，為遺傳圖的繪制提供了大量可用的遺傳標(biāo)記。采用聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）技術(shù)，以STR兩側(cè)的基因作定點(diǎn)標(biāo)記的完整連鎖圖，已于1996年繪成，相鄰標(biāo)記間的平均距離僅0.7厘摩。23第二十三頁，共五十二頁，2022年，8月28日第三代DNA遺傳標(biāo)記，可能也是最好的遺傳標(biāo)記，是分散于基因組中的單個(gè)堿基的差異。這種差異包括單個(gè)堿基的缺失和插入，但更常見的是單個(gè)核苷酸的替換，即單核苷酸的多態(tài)性（SNP，singlenucleotidepolymorphism）。

第二十四頁，共五十二頁，2022年，8月28日

“遺傳圖”的建立為人類疾病相關(guān)基因的分離克隆奠定了基礎(chǔ)。擁有5000多個(gè)遺傳學(xué)位點(diǎn)，相當(dāng)于把整個(gè)人類基因組劃分為5000多個(gè)小區(qū)，并分別設(shè)置了“標(biāo)牌”。這些標(biāo)牌將在搜索功能基因的過程中發(fā)揮獨(dú)特的作用。把多態(tài)性的疾病基因位點(diǎn)（該位點(diǎn)至少包括“正常”及“致病”兩個(gè)等位基因）與上述遺傳標(biāo)記進(jìn)行分析比較時(shí)，如果在家系中證實(shí)該基因與某個(gè)標(biāo)記不連鎖（重組率為50%），表明該基因不在這一標(biāo)記附近；如果發(fā)現(xiàn)該基因與某個(gè)標(biāo)記有一定程度的“連鎖”（重組率小于50%但大于0），表明它可能位于這個(gè)標(biāo)記附近；如果該基因與某標(biāo)記間不發(fā)生重組（重組率等于0），我們就推測(cè)該標(biāo)記與所研究的疾病基因可能非常接近。25第二十五頁，共五十二頁，2022年，8月28日26遺傳圖所表現(xiàn)的，是通過連鎖分析確定的各基因間的相對(duì)位置；物理圖則表現(xiàn)染色體上每個(gè)DNA片段的實(shí)際順序。物理圖是指以已知核苷酸序列的DNA片段（序列標(biāo)簽位點(diǎn)，sequence-taggedsite，STS）為“路標(biāo)”，以堿基對(duì)（bp，kb，Mb）作為基本測(cè)量單位（圖距）的基因組圖。

三、物理圖（PhysicalMap）第二十六頁，共五十二頁，2022年，8月28日現(xiàn)在的測(cè)序技術(shù)還不能對(duì)整個(gè)DNA分子進(jìn)行序列測(cè)定，因此須先將它切成一個(gè)個(gè)大小不同的片段，然后將這些片段連起來，構(gòu)成連續(xù)的序列。切割的工具，是一類限制性內(nèi)切核酸酶，它能識(shí)別DNA中的特定序列，并在該位點(diǎn)對(duì)DNA鏈進(jìn)行切割。有一類稀有的限制性內(nèi)切核酸酶，由于DNA中這樣的序列比較少，所以用它可將DNA分子切割成約100萬堿基大小的大片斷。這樣的片段有利于排序，不過必須用脈沖場(chǎng)凝膠電泳法，才能將它們分開。第二十七頁，共五十二頁，2022年，8月28日28這些大片段在進(jìn)行DNA分子克隆時(shí)，也不能通過細(xì)菌質(zhì)?；蚴删w的運(yùn)載而在大腸桿菌中進(jìn)行克隆，因?yàn)樗鼈兲?，而必須用一種特殊的載體--酵母人工染色體（YAC），將片段導(dǎo)入酵母，在酵母細(xì)胞中克隆。YAC中的DNA大片段是靠序列標(biāo)記位標(biāo)（STS）來識(shí)別的。STS是一段200～500堿基對(duì)的已知序列，在染色體上有一定的位置，所以用STS作位標(biāo)可將不同YAC克隆排列成鄰接克隆群（contig）。

其他載體還有BAC（細(xì)菌人工染色體）、P1（噬菌體人工染色體）、粘粒（cosmid）、細(xì)菌質(zhì)粒等。現(xiàn)在，人類基因組24條染色體的YAC、BAC、P1鄰接克隆群均已建立，精度約100堿基對(duì)的物理圖也基本繪成，并已開始進(jìn)行大規(guī)模測(cè)序。第二十八頁，共五十二頁，2022年，8月28日29第二十九頁，共五十二頁，2022年，8月28日30生物的性狀，包括疾病，都由蛋白質(zhì)決定。所有蛋白質(zhì)都是由mRNA（信使核糖核酸）編碼的，而mRNA又由DNA轉(zhuǎn)錄而來。人類基因組中僅1％～5％的DNA是編碼序列（基因）；成人各種組織中又只有約10％的基因表達(dá)為蛋白質(zhì)。所以，建立轉(zhuǎn)錄圖，或從mRNA逆轉(zhuǎn)錄而來的cDNA圖，是分離、定位和克隆基因的關(guān)鍵。這里，表達(dá)序列位標(biāo)（EST）具有重要意義。四、轉(zhuǎn)錄圖（ExpressionProfiling）第三十頁，共五十二頁，2022年，8月28日EST是長(zhǎng)約100～300堿基對(duì)的cDNA片段，是表達(dá)基因的一部分。EST由于序列較短，很難定位，只有篩到較長(zhǎng)的基因片段（超過1000堿基對(duì)），才能用熒光原位雜交（FISH）法在染色體上定位。

EST可用工業(yè)化的程序生產(chǎn)，只要分離到某一發(fā)育階段某一組織的mRNA，就可用逆轉(zhuǎn)錄法，從mRNA合成相應(yīng)的cDNA片段，即EST。用它作探針，就可從基因組文庫(kù)中篩到全長(zhǎng)的基因序列。截止到1998年2月，已發(fā)現(xiàn)約92萬條EST，轉(zhuǎn)錄圖的制作有了良好的開端，但這已屬后基因組計(jì)劃的工作。第三十一頁，共五十二頁，2022年，8月28日32人類基因組的核苷酸序列圖其實(shí)是分子水平上最高層次的、最詳盡的物理圖。測(cè)定總長(zhǎng)約1米、由30億個(gè)核苷酸組成的全序列當(dāng)然是人類基因組計(jì)劃中最明確、最艱巨的任務(wù)（圖10-10）。因?yàn)槿祟愃鶕碛械幕蛭稽c(diǎn)都是相同的，不同種族、不同個(gè)體的基因差異（人類基因組的多樣性）以及“正?！迸c“疾病”基因的差異，只是同一位點(diǎn)上的等位基因的差異，所以，現(xiàn)在的人類基因組全序列來自一個(gè)“代表性人類個(gè)體”（其所有權(quán)在法律上不屬于任何供體）。

五、

人類基因組的序列圖

（HumanGenomeSequence）第三十二頁，共五十二頁，2022年，8月28日該序列在理論上代表了全人類的基因組信息，事實(shí)上也可被用于任何族群、任何個(gè)體的基因分析和診斷。人類基因組計(jì)劃所提供的這四張圖，特別是人類核酸序列圖，蘊(yùn)藏了決定我們生、老、病、死的所有遺傳信息，必將成為人類認(rèn)識(shí)自我、改造自我的用之不絕的知識(shí)源泉，為21世紀(jì)現(xiàn)代生物學(xué)和醫(yī)學(xué)的迅速發(fā)展奠定基礎(chǔ)。第三十三頁，共五十二頁，2022年，8月28日DNA的鳥槍法序列分析技術(shù)

第二節(jié)

34第三十四頁，共五十二頁，2022年，8月28日一、基因組DNA大片段文庫(kù)的構(gòu)建二、鳥槍法基因組序列分析技術(shù)及其改良第三十五頁，共五十二頁，2022年，8月28日一、基因組DNA大片段文庫(kù)的構(gòu)建以YAC克隆為基礎(chǔ)建立的鄰接克隆群，由于DNA片段太大，不適于測(cè)序，需另外幾種載體克隆的配合。BAC可運(yùn)載約30萬堿基對(duì)的片段，P1可運(yùn)載約10萬堿基對(duì)的片段，粘?？蛇\(yùn)載約4萬～5萬堿基對(duì)的片段，細(xì)菌質(zhì)粒則可運(yùn)載約1萬堿基對(duì)的DNA片段。這幾類載體的運(yùn)用，使YAC克隆的DNA大片段可先分解成相應(yīng)克隆的小片段，便于測(cè)序。第三十六頁，共五十二頁，2022年，8月28日一次測(cè)序一般只能測(cè)定1000堿基對(duì)，然后用已知序列的下游部分合成引物，進(jìn)行另一次測(cè)序，如此一步步地“步行”，逐步完成較大片段的測(cè)序。因此，需先用質(zhì)粒建立許多克隆，構(gòu)成質(zhì)粒文庫(kù)，再對(duì)這些質(zhì)?？寺∵M(jìn)行測(cè)序，然后用電腦搭配成鄰接克隆群。

由于自動(dòng)化和電腦的應(yīng)用，現(xiàn)在一天已可進(jìn)行10萬個(gè)測(cè)序反應(yīng)?，F(xiàn)已完成的1.8億堿基對(duì)的測(cè)序，約占人類基因組的5％～6％。華盛頓大學(xué)、貝勒醫(yī)學(xué)院等機(jī)構(gòu)，均已完成幾百萬到幾千萬堿基對(duì)的測(cè)序，錯(cuò)誤率僅萬分之一，測(cè)序速度和準(zhǔn)確性已大大提高。第三十七頁，共五十二頁，2022年，8月28日38第三十八頁，共五十二頁，2022年，8月28日二、鳥槍法基因組序列分析技術(shù)及其改良第一，建立高度隨機(jī)、插入片段大小為2kb左右的基因組文庫(kù)?？寺?shù)要達(dá)到一定數(shù)量，即經(jīng)末端測(cè)序的克隆片段的堿基總數(shù)應(yīng)達(dá)到基因組5倍以上。第二，高效、大規(guī)模的末端測(cè)序。對(duì)文庫(kù)中每一個(gè)克隆，進(jìn)行兩端測(cè)序，TIGR在完成流感嗜血桿菌的基因組時(shí)，使用了14臺(tái)測(cè)序儀，用三個(gè)月時(shí)間完成了必需的28,463個(gè)測(cè)序反應(yīng)，測(cè)序總長(zhǎng)度達(dá)6倍基因組。

全基因組鳥槍法測(cè)序的主要步驟是：第三十九頁，共五十二頁，2022年，8月28日第三，序列集合。TIGR發(fā)展了新的軟件，修改了序列集合規(guī)則以最大限度地排除錯(cuò)誤的連鎖匹配。第四，填補(bǔ)缺口。有兩種待填補(bǔ)的缺口，一是沒有相應(yīng)模板DNA的物理缺口，二是有模板DNA但未測(cè)序的序列缺口。他們建立了插入片段為15-20kb的λ文庫(kù)以備缺口填補(bǔ)。第四十頁，共五十二頁，2022年，8月28日41第四十一頁，共五十二頁，2022年，8月28日42

隨著所測(cè)基因組總量增大，所需測(cè)序的片段大量增加，各個(gè)片段重疊或一個(gè)連續(xù)體的概率是2n2-2高等真核生物（如人類）基因組中有大量重復(fù)序列，導(dǎo)致判斷失誤。鳥槍法測(cè)序的缺點(diǎn)第四十二頁，共五十二頁，2022年，8月28日43第四十三頁，共五十二頁，2022年，8月28日(1)Clonecontig法。首先用稀有內(nèi)切酶把待測(cè)基因組降解為數(shù)百kb以上的片段，再分別測(cè)序。(2)靶標(biāo)鳥槍法(diretedshotgun)。首先根據(jù)染色體上已知基因和標(biāo)記的位置來確定部分DNA片段的相對(duì)位置，再逐步縮小各片段之間的缺口。對(duì)鳥槍法的改進(jìn)第四十四頁，共五十二頁，2022年，8月28日45比較基因組學(xué)（Comparativegenomics）及功能基因組學(xué)研究第三節(jié)第四十五頁，共五十二頁，2022年，8月28日一、通過基因組數(shù)據(jù)進(jìn)行全局性分析二、通過基因組數(shù)據(jù)進(jìn)行比較基因組學(xué)研究三、功能基因組學(xué)研究第四十六頁，共五十二頁，2022年，8月28日基因組的序列主要可被分為三類：由于生物在進(jìn)化上是相互關(guān)聯(lián)的，對(duì)一種生物的研究可以為其它生物提供有價(jià)值的信息。（一）通過比較確知其生理功能的；（二）在數(shù)據(jù)庫(kù)中有相匹配的蛋白質(zhì)序列，但并不知道其功能的；（三）在現(xiàn)有數(shù)據(jù)庫(kù)中找不到任何相匹配的蛋白質(zhì)序列的新基因。第四十七頁，共五十二頁，2022年，8月28日48

比較基因組學(xué)的威力就在于它能根據(jù)對(duì)一種生物相關(guān)基因的認(rèn)識(shí)來理解、詮釋甚至克隆分離另一種生物的基因。遠(yuǎn)緣基因組間的比較為認(rèn)識(shí)生物學(xué)機(jī)制的普遍性，尋找研究復(fù)雜生理和病理過程所需的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ吞峁┝死碚撘罁?jù)，而