第十四章 高效液相色譜法

第十四章高效液相色譜法第一頁(yè)，共七十四頁(yè)，2022年，8月28日學(xué)習(xí)大綱§14-1概述§14-2高效液相色譜儀§14-3液相色譜的固定相與流動(dòng)相§14-4高效液相色譜的方法§14-5色譜分離方法的選擇第十四章高效液相色譜法一、高效液相色譜法二、HPLC與經(jīng)典LC區(qū)別三、HPLC與GC區(qū)別四、HPLC的特點(diǎn)和應(yīng)用一、高壓輸液系統(tǒng)二、進(jìn)樣系統(tǒng)三、色譜柱四、檢測(cè)器一、液相色譜固定相二、液相色譜的流動(dòng)相一、分配色譜二、吸附色譜三、離子交換色譜四、離子色譜五、離子對(duì)色譜法六、尺寸排阻色譜法七、親合色譜第二頁(yè)，共七十四頁(yè)，2022年，8月28日§14-1概述高效液相色譜(HPLC)是以溶劑液體為流動(dòng)相的色譜方法。按照固定相不同可分為：液液分配色譜；吸附色譜(液固色譜)；離子交換色譜；尺寸排阻色譜(凝膠滲透色譜)。一、高效液相色譜法早期液相色譜是在直徑1~5cm,長(zhǎng)50~500cm的玻璃柱中進(jìn)行的。填充的固定相顆粒直徑多在150~200μm范圍內(nèi)。但流速低(<1mL/min)，分析時(shí)間長(zhǎng)；當(dāng)加壓增加流速時(shí)，盡管分析時(shí)間減少，但Hmin也相應(yīng)增加了，柱效下降了。最為有效地增加柱效的唯一方法是減小填充物的粒徑（3~10μm）！直到60年代，由于在高壓下操作的液壓設(shè)備、高效固定相以及高靈敏檢測(cè)器的出現(xiàn)及發(fā)展，才徹底解決了分析時(shí)間及柱效的問(wèn)題。高效液相色譜技術(shù)才真正得到廣泛應(yīng)用。首頁(yè)下一頁(yè)末頁(yè)退出第三頁(yè)，共七十四頁(yè)，2022年，8月28日H－dp關(guān)系圖首頁(yè)上一頁(yè)下一頁(yè)末頁(yè)退出第四頁(yè)，共七十四頁(yè)，2022年，8月28日經(jīng)典LCHPLC僅做為一種分離手段分離和分析柱內(nèi)徑1～3cm固定相粒徑>100μm且不均勻柱內(nèi)徑2～6mm固定相粒徑<10μm（球形，勻漿裝柱）常壓輸送流動(dòng)相高壓輸送流動(dòng)相柱效低（H↑，n↓）柱效高（H↓，n↑）無(wú)法在線檢測(cè)可以在線檢測(cè)分析周期長(zhǎng)分析時(shí)間大大縮短二、HPLC與經(jīng)典LC區(qū)別主要區(qū)別：固定相差別，輸液設(shè)備和檢測(cè)手段首頁(yè)上一頁(yè)下一頁(yè)末頁(yè)退出第五頁(yè)，共七十四頁(yè)，2022年，8月28日三、HPLC與GC區(qū)別相同：兼具分離和分析功能，均可以在線檢測(cè)差別：分析對(duì)象的差別和流動(dòng)相的差別1、分析對(duì)象GC：能氣化、熱穩(wěn)定性好、且沸點(diǎn)較低的樣品，高沸點(diǎn)、揮發(fā)性差、熱穩(wěn)定性差、離子型及高聚物的樣品不可檢測(cè)，占有機(jī)物的20%HPLC：溶解后能制成溶液的樣品，不受樣品揮發(fā)性和熱穩(wěn)定性限制，分子量大、難氣化、熱穩(wěn)定性差及高分子和離子型樣品均可檢測(cè)用途廣泛，占有機(jī)物的80%首頁(yè)上一頁(yè)下一頁(yè)末頁(yè)退出第六頁(yè)，共七十四頁(yè)，2022年，8月28日2、流動(dòng)相差別GC：流動(dòng)相為惰性氣體,組分與流動(dòng)相無(wú)親合作用力，只 與固定相作用。HPLC：流動(dòng)相為液體，與組分間有親合作用力，為提高柱 的選擇性、改善分離度增加了因素，對(duì)分離起很大 作用流動(dòng)相種類較多，選擇余地廣，流動(dòng)相極性和 pH值的選擇也對(duì)分離起到重要作用。選用不同比例 的兩種或兩種以上液體作為流動(dòng)相可以增大分離選 擇性。3、固定相差別液相色譜固定相類型多，作為分析時(shí)選擇余地大；而氣相色譜的固定相有限。4、操作條件差別GC：加溫操作HPLC：室溫；高壓（液體粘度大，峰展寬?。惠^低的溫度，一般有利于色譜分離條件的選擇。根據(jù)實(shí)際情況也可采用控溫方式，以提高分離速度。首頁(yè)上一頁(yè)下一頁(yè)末頁(yè)退出第七頁(yè)，共七十四頁(yè)，2022年，8月28日由于液體的擴(kuò)散性比氣體的小105倍，因此，溶質(zhì)在液相中的傳質(zhì)速率慢，柱外效應(yīng)就顯得特別重要；而在氣相色譜中，柱外區(qū)域擴(kuò)張可以忽略不計(jì)。液相色譜中制備樣品簡(jiǎn)單，回收樣品也比較容易，而且回收是定量的，適合于大量制備。但液相色譜尚缺乏通用的檢測(cè)器，儀器比較復(fù)雜，價(jià)格昂貴。在實(shí)際應(yīng)用中，這兩種色譜技術(shù)是互相補(bǔ)充的。第八頁(yè)，共七十四頁(yè)，2022年，8月28日四、HPLC的特點(diǎn)和應(yīng)用“三高”、“一快”、“一廣”高柱效——遠(yuǎn)高于一般LC高靈敏度高選擇性分析速度快應(yīng)用范圍廣（可分析80%有機(jī)化合物）首頁(yè)上一頁(yè)末頁(yè)退出第九頁(yè)，共七十四頁(yè)，2022年，8月28日分析應(yīng)用食品添加劑殘留“天然”化合物酸類化合物抗生素氨基酸抗氧化劑霉菌毒素酯類化合物防腐劑無(wú)機(jī)離子糖人工甜味劑農(nóng)藥維生素香料化合物無(wú)機(jī)離子色素首頁(yè)上一頁(yè)下一頁(yè)末頁(yè)退出第十頁(yè)，共七十四頁(yè)，2022年，8月28日HPLC儀器包括：1、高壓輸液裝置

2、進(jìn)樣系統(tǒng)3、分離系統(tǒng)4、檢測(cè)系統(tǒng)此外還配有梯度淋洗、自動(dòng)進(jìn)樣和數(shù)據(jù)處理裝置HPLC工作過(guò)程示意圖首頁(yè)上一頁(yè)下一頁(yè)末頁(yè)退出第十一頁(yè)，共七十四頁(yè)，2022年，8月28日首頁(yè)上一頁(yè)下一頁(yè)末頁(yè)退出分析前，選擇適當(dāng)?shù)纳V柱和流動(dòng)相，開(kāi)泵，沖洗柱子，待柱子達(dá)到平衡而且基線平直后，用微量注射器把樣品注入進(jìn)樣口，流動(dòng)相把試樣帶入色譜柱進(jìn)行分離，分離后的組分依次流入檢測(cè)器的流通池，最后和洗脫液一起排入流出物收集器。當(dāng)有樣品組分流過(guò)流通池時(shí)，檢測(cè)器把組分濃度轉(zhuǎn)變成電信號(hào)，經(jīng)過(guò)放大，用記錄器記錄下來(lái)就得到色譜圖。第十二頁(yè)，共七十四頁(yè)，2022年，8月28日一、高壓輸液系統(tǒng)（150～350×105Pa）

1、貯液器：1-2L的玻璃瓶，配有溶劑過(guò)濾器(Ni合金)，其孔徑約2μm，可防止顆粒物進(jìn)入泵內(nèi)。

2、脫氣：流動(dòng)相使用前必須進(jìn)行脫氣，以防止在洗脫過(guò)程中當(dāng)流動(dòng)相由色譜柱流至檢測(cè)器時(shí)，因壓力降低而產(chǎn)生氣泡。氣泡會(huì)增加基線的噪音，造成靈敏度下降，甚至無(wú)法分析。溶解的氧氣還會(huì)導(dǎo)致樣品中某些組份被氧化，柱中固定相發(fā)生降解而改變柱的分離性能。若用FLD，可能會(huì)造成熒光猝滅。常用的脫氣方法比較：

氦氣脫氣法：利用液體中氦氣的溶解度比空氣低，連續(xù)吹氦脫氣，效果較好，但成本高。加熱回流法：效果較好，但操作復(fù)雜，且有毒性揮發(fā)污染。抽真空脫氣法：易抽走有機(jī)相。超聲脫氣法：流動(dòng)相放在超聲波容器中，用超聲波振蕩10-15min，此法效果最差。在線真空脫氣法：真空脫機(jī)利用膜滲透技術(shù)，在線脫氣，智能控制，無(wú)需額外操作，成本低，脫氣效果明顯優(yōu)于以上幾種方法，并適用于多元溶劑體系。

首頁(yè)上一頁(yè)下一頁(yè)末頁(yè)退出第十三頁(yè)，共七十四頁(yè)，2022年，8月28日3、輸液泵：輸液泵是HPLC系統(tǒng)中最重要的部件之一。泵的性能好壞直接影響到整個(gè)系統(tǒng)的質(zhì)量和分析結(jié)果的可靠性。輸液泵應(yīng)具備如下性能：①流量穩(wěn)定，其RSD應(yīng)＜0.5%，這對(duì)定性定量的準(zhǔn)確性至關(guān)重要；②流量范圍寬，分析型應(yīng)在0.1~10ml/min范圍內(nèi)連續(xù)可調(diào)，制備型應(yīng)能達(dá)到100ml/min；③輸出壓力高，一般應(yīng)能達(dá)到150~300kg/cm2；④液缸容積?。虎菝芊庑阅芎?，耐腐蝕。恒壓泵：保持輸出壓力恒定，適于柱的勻漿填充。流量隨外界阻力變化而變化，保留時(shí)間的重現(xiàn)性差，如果系統(tǒng)阻力不發(fā)生變化，恒壓泵就能提供恒定的流量。

恒流泵：能給出恒定流量的泵，其流量與流動(dòng)相粘度和柱滲透無(wú)關(guān)。首頁(yè)上一頁(yè)下一頁(yè)末頁(yè)退出第十四頁(yè)，共七十四頁(yè)，2022年，8月28日4、梯度洗脫裝置：梯度洗脫是在一個(gè)分析周期內(nèi)程序控制流動(dòng)相的組成，如溶劑的極性、離子強(qiáng)度和pH值等，用于分析組分?jǐn)?shù)目多、性質(zhì)差異較大的復(fù)雜樣品。采用梯度洗脫可以縮短分析時(shí)間，提高分離度，改善峰形，提高檢測(cè)靈敏度，但是常常引起基線漂移和降低重現(xiàn)性。

外梯度：利用兩臺(tái)高壓輸液泵，將兩種不同極性的溶劑按一定的比例送入梯度混合室，混合后進(jìn)入色譜柱。內(nèi)梯度：一臺(tái)高壓泵,通過(guò)比例調(diào)節(jié)閥,將兩種或多種不同極性的溶劑按一定的比例抽入高壓泵中混合。首頁(yè)上一頁(yè)下一頁(yè)末頁(yè)退出第十五頁(yè)，共七十四頁(yè)，2022年，8月28日梯度洗脫類似GC中程序升溫，梯度洗脫的實(shí)質(zhì)是通過(guò)不斷地變化流動(dòng)相的強(qiáng)度，來(lái)調(diào)整混合樣品中各組分的k值，使所有譜帶都以最佳平均k值通過(guò)色譜柱。流動(dòng)相A洗脫時(shí)，若樣品中各成分容量因子Ｋ相差大，大的峰寬而低且分析時(shí)間長(zhǎng)。流動(dòng)相B溶解力強(qiáng)。洗脫時(shí)，各成分很快出來(lái)，則K(1.2)小的峰達(dá)不到分離。A→B若將A、B流動(dòng)相的組成隨時(shí)間改變，則即分離好，又縮短分析時(shí)間。首頁(yè)上一頁(yè)下一頁(yè)末頁(yè)退出第十六頁(yè)，共七十四頁(yè)，2022年，8月28日在進(jìn)行梯度洗脫時(shí)必須充分重視：①要注意溶劑的互溶性，不相混溶的溶劑不能用作梯度洗脫的流動(dòng)相。②梯度洗脫所用的溶劑純度要求更高，以保證良好的重現(xiàn)性。③混合溶劑的粘度常隨組成而變化，因而在梯度洗脫時(shí)常出現(xiàn)壓力的變化。④每次梯度洗脫之后必須對(duì)色譜柱進(jìn)行再生處理，使其恢復(fù)到初始狀態(tài)。需讓10~30倍柱容積的初始流動(dòng)相流經(jīng)色譜柱，使固定相與初始流動(dòng)相達(dá)到完全平衡。首頁(yè)上一頁(yè)下一頁(yè)末頁(yè)退出第十七頁(yè)，共七十四頁(yè)，2022年，8月28日二、進(jìn)樣系統(tǒng)進(jìn)樣系統(tǒng)包括進(jìn)樣口、注射器和進(jìn)樣閥等，它的作用是把分析試樣有效地送入色譜柱上進(jìn)行分離。

1、隔膜注射進(jìn)樣：使用微量注射器進(jìn)樣。裝置簡(jiǎn)單、死體積小。但進(jìn)樣量小且重現(xiàn)性差。2、高壓進(jìn)樣閥：目前最常用的為六通閥。由于進(jìn)樣量可由樣品管控制，因此進(jìn)樣準(zhǔn)確，重復(fù)性好。首頁(yè)上一頁(yè)下一頁(yè)末頁(yè)退出第十八頁(yè)，共七十四頁(yè)，2022年，8月28日進(jìn)樣系統(tǒng)高效液相色譜柱比氣相色譜柱短得多（約5～30cm），所以柱外展寬（又稱柱外效應(yīng)）較突出。柱外展寬是指色譜柱外的因素所引起的峰展寬，主要包括進(jìn)樣系統(tǒng)、連接管道及檢測(cè)器中存在死體積。柱外展寬可分柱前和柱后展寬。進(jìn)樣系統(tǒng)是引起柱前展寬的主要因素，因此高效液相色譜法中對(duì)進(jìn)樣技術(shù)要求較嚴(yán)。第十九頁(yè)，共七十四頁(yè)，2022年，8月28日三、色譜柱1、對(duì)色譜柱的要求：內(nèi)壁光滑的優(yōu)質(zhì)不銹鋼柱，柱接頭的死體積盡可能小。柱長(zhǎng)多為10~30cm，內(nèi)徑為4~5mm(尺寸排阻色譜柱常大于5mm，制備色譜柱內(nèi)徑更大)2、柱的填充：主要采用勻漿法。平衡密度法：使溶劑密度和填充顆粒密度相近，此時(shí)顆粒沉降速度趨于0。常用的勻漿試劑有四氯乙烯、四溴乙烷和二碘甲烷等；非平衡密度法：采用粘度較大的試劑，如CCl4，CH3OH,丙酮，二氧雜環(huán)已烷、THF等。填充方法：填充時(shí)，按上述方法制作勻漿液，用流動(dòng)相充滿色譜柱及其延長(zhǎng)管中，然后將勻漿液倒入勻漿填充器，在較高壓力下迅速將其注入色譜柱內(nèi)。要求填充速度快(防凝聚、沉降或結(jié)塊)、且無(wú)空氣進(jìn)入(影響填充均勻性)。首頁(yè)上一頁(yè)下一頁(yè)末頁(yè)退出第二十頁(yè)，共七十四頁(yè)，2022年，8月28日檢測(cè)器

檢測(cè)器是液相色譜儀的關(guān)鍵部件之一。對(duì)檢測(cè)器的要求是：靈敏度高，重復(fù)性好、線性范圍寬、死體積小以及對(duì)溫度和流量的變化不敏感等。在液相色譜中，有兩種類型的檢測(cè)器，一類是溶質(zhì)性檢測(cè)器，它僅對(duì)被分離組分的物理或物理化學(xué)特性有響應(yīng)。屬于此類檢測(cè)器的有紫外、熒光、電化學(xué)檢測(cè)器等；另一類是總體檢測(cè)器，它對(duì)試樣和洗脫液總的物理和化學(xué)性質(zhì)響應(yīng)。屬于此類檢測(cè)器有示差折光檢測(cè)器等。第二十一頁(yè)，共七十四頁(yè)，2022年，8月28日四、檢測(cè)器1、紫外檢測(cè)器其檢測(cè)原理和UV-Vis方法一樣。只是此時(shí)所采用的吸收池為微量吸收池，通常其光程為2-10mm,體積約為1~10μL。HPLC分析中，約有80%的物質(zhì)可以在254nm或280nm處產(chǎn)生紫外吸收。因此該類檢測(cè)器應(yīng)用很廣。在選擇測(cè)量波長(zhǎng)時(shí)注意：溶劑必須能讓所選擇的光透過(guò)，即所選波長(zhǎng)不能小于溶劑的最低使用波長(zhǎng)。首頁(yè)上一頁(yè)下一頁(yè)末頁(yè)退出第二十二頁(yè)，共七十四頁(yè)，2022年，8月28日二極管陣列（PDA）檢測(cè)器首頁(yè)上一頁(yè)下一頁(yè)末頁(yè)退出第二十三頁(yè)，共七十四頁(yè)，2022年，8月28日首頁(yè)上一頁(yè)下一頁(yè)末頁(yè)退出第二十四頁(yè)，共七十四頁(yè)，2022年，8月28日原理：利用兩束相同角度的光照射溶劑相和樣品+溶劑相，利用二者對(duì)光的折射率不同，其中一束光（通常是通過(guò)樣品+溶劑相）因?yàn)榘l(fā)生偏轉(zhuǎn)造成兩束光的強(qiáng)度差發(fā)生變化，將此差示信號(hào)放大并記錄，該信號(hào)代表樣品的濃度。2、熒光檢測(cè)器許多有機(jī)物具熒光活性，尤其是芳香族化合物具有很強(qiáng)的活性。熒光檢測(cè)器是一種選擇性很強(qiáng)的檢測(cè)器，其靈敏度比UV檢測(cè)器高2~3個(gè)數(shù)量級(jí)。3、示差折光檢測(cè)器為通用型檢測(cè)器，靈敏度為10-7g/mL。但對(duì)溫度變化敏感，且不適于梯度淋洗。首頁(yè)上一頁(yè)下一頁(yè)末頁(yè)退出第二十五頁(yè)，共七十四頁(yè)，2022年，8月28日4、安培檢測(cè)器由恒電位儀和一薄層反應(yīng)池（體積為1~5μL）組成。該檢測(cè)器是利用待測(cè)物流入反應(yīng)池時(shí)在工作電極表面發(fā)生氧化或還原反應(yīng)，兩電極間就有電流通過(guò)，此電流大小與待測(cè)物濃度成正比。采用安培檢測(cè)器時(shí)，流動(dòng)相必須含有電解質(zhì)，且呈化學(xué)惰性。它最適于與反相色譜匹配。但此檢測(cè)器只能檢測(cè)具有電活性的物質(zhì)。首頁(yè)上一頁(yè)下一頁(yè)末頁(yè)退出第二十六頁(yè)，共七十四頁(yè)，2022年，8月28日5、電導(dǎo)檢測(cè)器電導(dǎo)檢測(cè)器主要用于離子色譜的檢測(cè)。其原理是基于待測(cè)物在一些介質(zhì)中電離后所產(chǎn)生的電導(dǎo)（電阻的倒數(shù)）變化來(lái)測(cè)量電離物質(zhì)的含量。電導(dǎo)檢測(cè)器的主要部件是電導(dǎo)池。其響應(yīng)受溫度影響較大，因此需要將電導(dǎo)池置于恒溫箱中。另外，當(dāng)pH>7時(shí)，該檢測(cè)器不夠靈敏。6、其它檢測(cè)器MSIREvaporativelightscatteringdetector(光散射)極譜首頁(yè)上一頁(yè)下一頁(yè)末頁(yè)退出第二十七頁(yè)，共七十四頁(yè)，2022年，8月28日檢測(cè)器性能指標(biāo)（1）噪音和漂移：在儀器穩(wěn)定之后，記錄基線1小時(shí)，基線帶寬為噪音，基線在1小時(shí)內(nèi)的變化為漂移。它們反映檢測(cè)器電子元件的穩(wěn)定性，及其受溫度和電源變化的影響，如果有流動(dòng)相從色譜柱流入檢測(cè)器，那么它們還反映流速和溶劑的影響。噪音和漂移都會(huì)影響測(cè)定的準(zhǔn)確度，應(yīng)盡量減小。

（2）靈敏度(sensitivity)：表示一定量的樣品物質(zhì)通過(guò)檢測(cè)器時(shí)所給出的信號(hào)大小。對(duì)濃度型檢測(cè)器，它表示單位濃度的樣品所產(chǎn)生的電信號(hào)的大小，單位為mV·ml/g。對(duì)質(zhì)量型檢測(cè)器，它表示在單位時(shí)間內(nèi)通過(guò)檢測(cè)器的單位質(zhì)量的樣品所產(chǎn)生的電信號(hào)的大小，單位為mV·s/g。（3）檢測(cè)限(detectionlimit)：指恰好產(chǎn)生可辨別的信號(hào)時(shí)進(jìn)入檢測(cè)器的某組分的量。又稱為敏感度(detectability)。D＝3N/S，式中N為噪聲，S為靈敏度。通常是把一個(gè)已知量的標(biāo)準(zhǔn)溶液注入到檢測(cè)器中來(lái)測(cè)定其檢測(cè)限的大小。檢測(cè)限是檢測(cè)器的一個(gè)主要性能指標(biāo)，其數(shù)值越小，檢測(cè)器性能越好。首頁(yè)上一頁(yè)下一頁(yè)末頁(yè)退出第二十八頁(yè)，共七十四頁(yè)，2022年，8月28日（4）線性范圍(linearrange)：指檢測(cè)器的響應(yīng)信號(hào)與組分量成直線關(guān)系的范圍，即在固定靈敏度下，最大與最小進(jìn)樣量（濃度型檢測(cè)器為組分在流動(dòng)相中的濃度）之比。線性范圍一般可通過(guò)實(shí)驗(yàn)確定。我們希望檢測(cè)器的線性范圍盡可能大些，能同時(shí)測(cè)定主成分和痕量成分。（5）池體積：除制備色譜外，大多數(shù)HPLC檢測(cè)器的池體積都小于10µl。在使用細(xì)管徑柱時(shí)，池體積應(yīng)減少到1~2µl甚至更低，不然檢測(cè)系統(tǒng)帶來(lái)的峰擴(kuò)張問(wèn)題就會(huì)很嚴(yán)重。而且這時(shí)池體、檢測(cè)器與色譜柱的連接、接頭等都要精心設(shè)計(jì)，否則會(huì)嚴(yán)重影響柱效和靈敏度。首頁(yè)上一頁(yè)末頁(yè)退出第二十九頁(yè)，共七十四頁(yè)，2022年，8月28日§14-3液相色譜的固定相與流動(dòng)相一、液相色譜固定相stationaryphasesofLC1、液-液分配及離子對(duì)分離固定相（1）全多孔型擔(dān)體由氧化硅、氧化鋁、硅藻土等制成的多孔球體；早期采用100μm的大顆粒，表面涂漬固定液，性能不佳已不多見(jiàn)；現(xiàn)采用10μm以下的小顆粒，化學(xué)鍵合制備柱填料；（2）表面多孔型擔(dān)體（薄殼型微珠擔(dān)體）

30～40μm的玻璃微球，表面附著一層厚度為1～2μm的多孔硅膠。表面積小，柱容量底；首頁(yè)下一頁(yè)末頁(yè)退出第三十頁(yè)，共七十四頁(yè)，2022年，8月28日（3）化學(xué)鍵合固定相化學(xué)鍵合固定相:目前應(yīng)用最廣、性能最佳的固定相；a.硅氧碳鍵型：≡Si—O—Cb.硅氧硅碳鍵型：≡Si—O—Si—C穩(wěn)定，耐水、耐光、耐有機(jī)溶劑，應(yīng)用最廣；c.硅碳鍵型：≡Si—Cd.硅氮鍵型：≡Si—N首頁(yè)上一頁(yè)下一頁(yè)末頁(yè)退出第三十一頁(yè)，共七十四頁(yè)，2022年，8月28日化學(xué)鍵合固定相的特點(diǎn)（1）傳質(zhì)快，表面無(wú)深凹陷，比一般液體固定相傳質(zhì)快；（2）壽命長(zhǎng)，化學(xué)鍵合，無(wú)固定液流失，耐流動(dòng)相沖擊；耐水、耐光、耐有機(jī)溶劑，穩(wěn)定；（3）選擇性好，可鍵合不同官能團(tuán)，提高選擇性；（4）有利于梯度洗脫；（5）存在著雙重分離機(jī)制（鍵合基團(tuán)的覆蓋率決定分離機(jī)理）高覆蓋率：分配為主；低覆蓋率：吸附為主；首頁(yè)上一頁(yè)下一頁(yè)末頁(yè)退出第三十二頁(yè)，共七十四頁(yè)，2022年，8月28日2、離子交換色譜分離固定相結(jié)構(gòu)類別：（1）薄殼型離子交換樹(shù)脂

薄殼玻璃珠為擔(dān)體，表面涂約1%的離子交換樹(shù)脂；（2）離子交換鍵合固定相

薄殼鍵合型；微粒硅膠鍵合型（鍵合離子交換基團(tuán)）樹(shù)脂類別：（1）陽(yáng)離子交換樹(shù)脂（強(qiáng)酸性、弱酸性）（2）陰離子交換樹(shù)脂（強(qiáng)堿性、弱堿性）首頁(yè)上一頁(yè)下一頁(yè)末頁(yè)退出第三十三頁(yè)，共七十四頁(yè)，2022年，8月28日3、空間排阻分離固定相（1）軟質(zhì)凝膠

葡聚糖凝膠、瓊脂凝膠等。多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)；水為流動(dòng)相。適用于常壓排阻分離。（2）半硬質(zhì)凝膠

苯乙烯-二乙烯基苯交聯(lián)共聚物，有機(jī)凝膠；非極性有機(jī)溶劑為流動(dòng)相，不能用丙酮、乙醇等極性溶劑。（3）硬質(zhì)凝膠

多孔硅膠、多孔玻珠等；化學(xué)穩(wěn)定性、熱穩(wěn)定性好、機(jī)械強(qiáng)度大，流動(dòng)相性質(zhì)影響小，可在較高流速下使用?？煽乜讖讲Ａ⑶?，具有恒定孔徑和窄粒度分布。4、液-固吸附分離固定相種類：硅膠、氧化鋁、分子篩、聚酰胺等；結(jié)構(gòu)類型：全多孔型和薄殼型；粒度：5～10μm；首頁(yè)上一頁(yè)下一頁(yè)末頁(yè)退出第三十四頁(yè)，共七十四頁(yè)，2022年，8月28日二、液相色譜的流動(dòng)相mobilephasesofLC1、流動(dòng)相特性（1）液相色譜的流動(dòng)相又稱為：淋洗液，洗脫劑。流動(dòng)相組成改變，極性改變，可顯著改變組分分離狀況；（2）親水性固定液常采用疏水性流動(dòng)相，即流動(dòng)相的極性小于固定相的極性，稱為正相液液色譜法，極性柱也稱正相柱。（3）若流動(dòng)相的極性大于固定液的極性，則稱為反相液液色譜，非極性柱也稱為反相柱。組分在兩種類型分離柱上的出峰順序相反。2、流動(dòng)相類別按流動(dòng)相組成分：?jiǎn)谓M分和多組分；按極性分：極性、弱極性、非極性；按使用方式分：固定組成淋洗和梯度淋洗。常用溶劑：己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、乙醇、乙腈、水。采用二元或多元組合溶劑作為流動(dòng)相可以靈活調(diào)節(jié)流動(dòng)相的極性或增加選擇性，以改進(jìn)分離或調(diào)整出峰時(shí)間。首頁(yè)上一頁(yè)下一頁(yè)末頁(yè)退出第三十五頁(yè)，共七十四頁(yè)，2022年，8月28日3、流動(dòng)相選擇在選擇溶劑時(shí)，溶劑的極性是選擇的重要依據(jù)。

采用正相液-液分配分離時(shí)：首先選擇中等極性溶劑，若組分的保留時(shí)間太短，降低溶劑極性，反之增加。也可在低極性溶劑中，逐漸增加其中的極性溶劑，使保留時(shí)間縮短。常用溶劑的極性順序：

水(最大)>甲酰胺>乙腈>甲醇>乙醇>丙醇>丙酮>二氧六環(huán)>四氫呋喃>甲乙酮>正丁醇>乙酸乙酯>乙醚>異丙醚>二氯甲烷>氯仿>溴乙烷>苯>四氯化碳>二硫化碳>環(huán)己烷>己烷>煤油(最小)首頁(yè)上一頁(yè)下一頁(yè)末頁(yè)退出第三十六頁(yè)，共七十四頁(yè)，2022年，8月28日4、選擇流動(dòng)相時(shí)應(yīng)注意的幾個(gè)問(wèn)題（1）高效液相色譜靈敏度高，盡量使用高純度試劑作流動(dòng)相，防止微量雜質(zhì)長(zhǎng)期累積損壞色譜柱和使檢測(cè)器噪聲增加。不純的溶劑還會(huì)引起基線不穩(wěn)，或產(chǎn)生“偽峰”。（2）化學(xué)穩(wěn)定性好，避免流動(dòng)相與固定相發(fā)生作用而使柱效下降或損壞柱子。如使固定液溶解流失；酸性溶劑破壞氧化鋁固定相等。（3）溶劑對(duì)于待測(cè)樣品，必須具有合適的極性和良好的選擇性，防止產(chǎn)生沉淀并在柱中沉積。（4）溶劑與檢測(cè)器匹配。對(duì)于紫外吸收檢測(cè)器，應(yīng)注意選用檢測(cè)器波長(zhǎng)比溶劑的紫外截止波長(zhǎng)要長(zhǎng)。所謂溶劑的紫外截止波長(zhǎng)指當(dāng)小于截止波長(zhǎng)的輻射通過(guò)溶劑時(shí)，溶劑對(duì)此輻射產(chǎn)生強(qiáng)烈吸收，它嚴(yán)重干擾組分的吸收測(cè)量。對(duì)于折光率檢測(cè)器，要求選擇與組分折光率有較大差別的溶劑作流動(dòng)相，以達(dá)到最高靈敏度。（5）低粘度（粘度適中）

若使用高粘度溶劑，勢(shì)必增高壓力，不利于分離。常用的低粘度溶劑有丙酮、甲醇和乙腈等；但粘度過(guò)低的溶劑也不宜采用，例如戊烷和乙醚等，它們?nèi)菀自谏V柱或檢測(cè)器內(nèi)形成氣泡，影響分離。首頁(yè)上一頁(yè)末頁(yè)退出第三十七頁(yè)，共七十四頁(yè)，2022年，8月28日§14-4高效液相色譜的方法

按分離原理可將HPLC分為分配色譜、吸附色譜、離子交換色譜、尺寸排阻色譜和親和色譜等。一、分配色譜1、原理：根據(jù)各待測(cè)物在互不相溶的兩溶液中的溶解度不同，因而具有不同的分配系數(shù)。在色譜柱中，隨著流動(dòng)相的移動(dòng)，這種分配平衡需進(jìn)行多次，造成各待測(cè)物的遷移速率不同，從而實(shí)現(xiàn)分離的過(guò)程。2、流動(dòng)相:HPLC分析中，為防止固定相的流失，流動(dòng)相與固定液應(yīng)盡量不互溶，或者說(shuō)二者的極性相差越大越好。因此，根據(jù)流動(dòng)相與固定相極性的差別程度，可將液液色譜分為正相分配色譜（流動(dòng)相極性小于固定相極性，極性小的先流出，適于極性組分分離）和反相分配色譜（流動(dòng)相極性大于固定相極性，極性大的先流出，適于非極性組分分離）。首頁(yè)下一頁(yè)末頁(yè)退出第三十八頁(yè)，共七十四頁(yè)，2022年，8月28日液液色譜固定相由載體和固定液組成。常用的載體有下列幾類：（1）表面多孔型載體（薄殼型微珠載體），由直徑為30~40m的實(shí)心玻璃球和厚度約為1~2m的多孔性外層所組成。（2）全多孔型載體，由硅膠、硅藻土等材料制成，直徑30~50m的多孔型顆粒。（3）全多孔型微粒載體，由nm級(jí)的硅膠微粒堆積而成，又稱堆積硅珠。這種載體粒度為5~10m。由于顆粒小，所以柱效高，是目前使用最廣泛的一種載體。第三十九頁(yè)，共七十四頁(yè)，2022年，8月28日由于液相色譜中，流動(dòng)相參與選擇作用，流動(dòng)相極性的微小變化，都會(huì)使組分的保留值出現(xiàn)較大的差異。因此，液相色譜中，只需幾種不同極性的固定液即可因此常用的只有幾種，按極性由高到低為：β,β’-氧二丙腈、聚乙二醇、三甲撐二醇、十八烷、角鯊?fù)椤８鶕?jù)涂漬方法的不同，可將固定相分為機(jī)械涂漬型和化學(xué)鍵合型，后者應(yīng)用更為廣泛。

3、固定液（1）機(jī)械涂漬固定相：

將固定液通過(guò)機(jī)械混合的方法涂漬到表面多孔型(0.5-1.5%涂布量)或全多孔型載體(5-10%涂布量)上形成的液液色譜固定相。該種固定相最大的不足是固定液易流失、分離穩(wěn)定性及重現(xiàn)性差，不適合梯度淋洗。

為減少固定液的流失，通常在柱前加一根很短的前置柱，該柱涂有與分析柱相同但有更高含量的固定液，使流動(dòng)相進(jìn)入分析柱之前，預(yù)先被固定液飽和。這種色譜方法適合于分離芳烴、稠環(huán)芳烴及烷烴等化合物首頁(yè)上一頁(yè)下一頁(yè)末頁(yè)退出第四十頁(yè)，共七十四頁(yè)，2022年，8月28日（2）化學(xué)鍵合固定相Si-O-R：對(duì)熱不穩(wěn)定、遇水、乙醇等強(qiáng)極性會(huì)水解，使酯鏈斷裂，因此只適于以不含水或醇的流動(dòng)相。Si-R(或Si-N)：不水解，熱穩(wěn)定性比硅酸脂好。但所用的格氏反應(yīng)不方便。使用水溶液作流動(dòng)相時(shí)，其pH應(yīng)在4-8之間。Si-O-Si-R：不水解，熱穩(wěn)定性好，在pH2-8范圍內(nèi)對(duì)水穩(wěn)定。首頁(yè)上一頁(yè)下一頁(yè)末頁(yè)退出第四十一頁(yè)，共七十四頁(yè)，2022年，8月28日液—固色譜法

固定相是固體吸附劑。吸附劑是一些多孔的固體顆粒物質(zhì)，存在一些分散的具有表面活性的吸附中心。根據(jù)各組分在固定相上的吸附能力的差異進(jìn)行分離。吸附劑吸附試樣的能力，主要取決于吸附劑的比表面積和理化性質(zhì)，試樣的組成和結(jié)構(gòu)以及洗脫液的性質(zhì)等。組分與吸附劑的性質(zhì)相似時(shí)；當(dāng)組分分子結(jié)構(gòu)與吸附劑表面活性中心的剛性幾何結(jié)構(gòu)相適應(yīng)時(shí)，易于吸附，呈現(xiàn)高的保留值。吸附色譜成為分離幾何異構(gòu)體的有效手段；不同的官能團(tuán)具有不同的吸附能，因此，吸附色譜可按族分離化合物。吸附色譜對(duì)同系物沒(méi)有選擇性（即對(duì)分子量的選擇性?。?，不能用該法分離分子量不同的化合物。第四十二頁(yè)，共七十四頁(yè)，2022年，8月28日液—固色譜法固定相采用的固體吸附劑按其性質(zhì)可分為極性和非極性兩種類型。極性吸附劑包括硅膠、氧化鋁、氧化鎂、硅酸鎂、分子篩及聚酰胺等。非極性吸附劑最常見(jiàn)的是活性炭。極性吸附劑可進(jìn)一步分為酸性吸附劑和堿性吸附劑。酸性吸附劑包括硅膠和硅酸鎂等，堿性吸附劑有氧化鋁、氧化鎂和聚酰胺等。酸性吸附劑適于分離堿，如脂肪胺和芳香胺。堿性吸附劑則適于分離酸性溶質(zhì)，如酚、羧和吡咯衍生物等。各種吸附劑中，最常用的吸附劑是硅膠，其次是氧化鋁。第四十三頁(yè)，共七十四頁(yè)，2022年，8月28日液—固色譜法流動(dòng)相必須符合下列要求：（1）能溶解樣品，但不能與樣品發(fā)生反應(yīng)。（2）與固定相不互溶，也不發(fā)生不可逆反應(yīng)。（3）粘度要盡可能小，這樣才能有較高的滲透性和柱效。（4）應(yīng)與所用檢測(cè)器相匹配。例如利用紫外檢測(cè)器時(shí)，溶劑要不吸收紫外光。（5）容易精制、純化、毒性小，不易著火、價(jià)格盡量便宜等。在液-固色譜中，選擇流動(dòng)相的基本原則是極性大的試樣用極性較強(qiáng)的流動(dòng)相，極性小的則用低極性流動(dòng)相。為了獲得合適的溶劑極性，常采用兩種、三種或更多種不同極性的溶劑混合起來(lái)使用，如果樣品組分的分配比k值范圍很廣則使用梯度洗脫。第四十四頁(yè)，共七十四頁(yè)，2022年，8月28日化學(xué)鍵合相色譜法化學(xué)鍵合固定相一般都采用硅膠（薄殼型或全多孔微粒型）為基體。在鍵合反應(yīng)之前，要對(duì)硅膠進(jìn)行酸洗、中和、干燥活化等處理，然后再使硅膠表面上的硅羥基與各種有機(jī)物或有機(jī)硅化合物起反應(yīng)，制備化學(xué)鍵合固定相。鍵合相可分為四種鍵型：（1）硅酸酯型（=Si-O-C=）鍵合相將醇與硅膠表面的羥基進(jìn)行酯化反應(yīng)，在硅膠表面形成（=Si-O-C=）鍵合相。反應(yīng)生成單分子層鍵合相。一般用極性小的溶劑洗脫，分離極性化合物。（2）硅氮型（=Si-N=）鍵合相如果用SOCl2將硅膠表面的羥基先轉(zhuǎn)化成鹵素（氯化），再與各種有機(jī)胺反應(yīng)，可以得到各種不同極性基因的鍵合相。可用非極性或強(qiáng)極性的溶劑作為流動(dòng)相。（3）硅碳型（=Si-C=）鍵合相將硅膠表面氯化后，使Si-Cl鍵轉(zhuǎn)化為Si-C鍵。在這類固定相中，有機(jī)基團(tuán)直接鍵合在硅膠表面上。（4）硅氧烷型（=Si-O-Si-C=）鍵合相將硅膠與有機(jī)氯硅烷或烷氧基硅烷反應(yīng)制備。這類鍵合相具有相當(dāng)?shù)哪蜔嵝院突瘜W(xué)穩(wěn)定性，是目前應(yīng)用最為廣泛的鍵合相。第四十五頁(yè)，共七十四頁(yè)，2022年，8月28日化學(xué)鍵合相色譜法正相鍵合色譜法將固定液的官能團(tuán)鍵合在載體的表面，而構(gòu)成化學(xué)鍵合相。以化學(xué)鍵合相為固定相的色譜法稱為化學(xué)鍵合相色譜法，簡(jiǎn)稱鍵合相色譜法（BPC）。該法主要用于分離異構(gòu)體，極性不同的化合物，特別是用來(lái)分離不同類型的化合物。（1）分離機(jī)制：

分配過(guò)程：組分在兩相間進(jìn)行分配，極性強(qiáng)的組分分配系數(shù)大

吸附過(guò)程：溶質(zhì)分子與固定相之間定向作用力（誘導(dǎo)力、或氫鍵作用力）（2）固定相：極性大的氰基或氨基鍵合相（3）流動(dòng)相：極性小（同LSC）底劑+有機(jī)極性調(diào)節(jié)劑例：正己烷+氯仿-甲醇，氯仿-乙醇首頁(yè)上一頁(yè)下一頁(yè)末頁(yè)退出第四十六頁(yè)，共七十四頁(yè)，2022年，8月28日（4）流動(dòng)相極性與k的關(guān)系：流動(dòng)相極性↑，洗脫能力↑，組分tR↓，k↓（5）出柱順序：結(jié)構(gòu)相近組分，極性小的組分先出柱，極性大的組分后出柱。（6）適用：氰基鍵合相與硅膠的柱選擇性相似（極性稍小）分離物質(zhì)也相似。氨基鍵合相與硅膠性質(zhì)差別大，堿性，分析極性大物質(zhì)、糖類等。首頁(yè)上一頁(yè)下一頁(yè)末頁(yè)退出第四十七頁(yè)，共七十四頁(yè)，2022年，8月28日反相鍵合相色譜（1）分離機(jī)制：疏溶劑理論

把非極性的烷基鍵合相，看作是在硅膠表面上覆蓋了一層鍵合的十八烷基的“分子毛”，這種“分子毛”有強(qiáng)的疏水特性。當(dāng)用水與有機(jī)溶劑所組成的極性溶劑為流動(dòng)相來(lái)分離有機(jī)化合物時(shí)：一方面非極性組分分子或組分分子的非極性部分，由于疏溶劑的作用，將會(huì)從水中被“擠”出來(lái)，與固定相上的疏水烷基之間產(chǎn)生締合作用。另一方面，被分離物的極性部分受到極性流動(dòng)相的作用，使它離開(kāi)固定相，減少保留值，此即解締過(guò)程。這兩種作用力之差，決定了分子在色譜中的保留行為。（2）固定相：極性小的烷基鍵合相

C8柱，C18柱（ODS柱）（3）流動(dòng)相：極性大的甲醇-水或乙腈-水流動(dòng)相極性>固定相極性

底劑+有機(jī)調(diào)節(jié)劑（極性調(diào)節(jié)劑）

例：水+甲醇，乙腈，THF首頁(yè)上一頁(yè)下一頁(yè)末頁(yè)退出第四十八頁(yè)，共七十四頁(yè)，2022年，8月28日正相和反相鍵合色譜法正相鍵合色譜中，隨流動(dòng)相極性增加，組分分配比k增加。在HPLC分析中，有時(shí)要在流動(dòng)相中加入適量的鹽(碳酸銨、四烷基銨鹽)或酸，其目的都是為了防止峰形拖尾。加入鹽類是為了減少待測(cè)物與鍵合相表面的殘留硅醇基作用；加入酸是抑制酸類待測(cè)物的離解，使其以游離酸在柱內(nèi)分離。首頁(yè)上一頁(yè)下一頁(yè)末頁(yè)退出第四十九頁(yè)，共七十四頁(yè)，2022年，8月28日正、反相色譜中極性和保留時(shí)間的關(guān)系首頁(yè)上一頁(yè)下一頁(yè)末頁(yè)退出第五十頁(yè)，共七十四頁(yè)，2022年，8月28日可見(jiàn)：反相鍵合色譜中，鍵合相碳鏈越長(zhǎng)（極性越小），分離效果越好。首頁(yè)上一頁(yè)下一頁(yè)末頁(yè)退出第五十一頁(yè)，共七十四頁(yè)，2022年，8月28日首頁(yè)上一頁(yè)下一頁(yè)末頁(yè)退出第五十二頁(yè)，共七十四頁(yè)，2022年，8月28日

第五十三頁(yè)，共七十四頁(yè)，2022年，8月28日化學(xué)鍵合色譜具有下列優(yōu)點(diǎn)：（1）適用于分離幾乎所有類型的化合物。一方面通過(guò)控制化學(xué)鍵合反應(yīng)，可以把不同的有機(jī)基團(tuán)鍵合到硅膠表面上，從而大大提高了分離的選擇性；另一方面可以通過(guò)改變流動(dòng)相的組成合乎種類來(lái)有效地分離非極性、極性和離子型化合物。（2）由于鍵合到載體上的基團(tuán)不易被剪切而流失，這不僅解決了由于固定液流失所帶來(lái)的困擾，還特別適合于梯度洗脫，為復(fù)雜體系的分離創(chuàng)造了條件。（3）鍵合固定相對(duì)不太強(qiáng)的酸及各種極性的溶劑都有很好的化學(xué)穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性。（4）固定相柱效高，使用壽命長(zhǎng)，分析重現(xiàn)性好。第五十四頁(yè)，共七十四頁(yè)，2022年，8月28日離子交換色譜此法是利用離子交換原理和液相色譜技術(shù)相結(jié)合，測(cè)定各類陰、陽(yáng)離子的分離分析方法。它既適于無(wú)機(jī)離子，也適于有機(jī)物分離，如蛋白質(zhì)、氨基酸、核酸等。1、原理：利用不同待測(cè)離子對(duì)固定相的親和能力（或離子交換能力）的差別來(lái)實(shí)現(xiàn)分離的。待測(cè)離子與離子交換樹(shù)脂固定相上帶電荷基團(tuán)或游離的離子發(fā)生可逆交換反應(yīng)：對(duì)陽(yáng)離子，滯留時(shí)間從大到小的順序?yàn)椋篎e3+,Ba2+,Pb2+,Sr2+,Ca2+,Ni2+,Cd2+,Cu2+,Co2+,Zn2+,Mg2+,UO22+,Tl+,Ag+,Cs+,Rb+,K+,NH4+,Na+,H+,Li+

對(duì)陰離子，滯留時(shí)間從大到小的順序?yàn)椋簷幟仕岣?SO42-,C2O42-,I-,HSO4-,NO3-,CrO42-,Br-,SCN-,Cl-,HCOO-,CH3COO-,OH-,F-

首頁(yè)上一頁(yè)下一頁(yè)末頁(yè)退出第五十五頁(yè)，共七十四頁(yè)，2022年，8月28日一般形式：R一A＋B＝R－B＋A達(dá)平衡時(shí)，以濃度表示的平衡常數(shù)（離子交換反應(yīng)的選擇系數(shù)）：式中[A]r，[B]r分別代表樹(shù)脂相中洗脫劑離子（A）和試樣離子（B）的濃度，[A]、[B]則代表它們?cè)谌芤褐械臐舛取B/A越大，說(shuō)明B離子交換能力越大，越易保留而難于洗脫。一般說(shuō)來(lái)，B離子電荷越大，水合離子半徑越小，KB/A值就越大。第五十六頁(yè)，共七十四頁(yè)，2022年，8月28日2、固定相按離子交換劑類型分四種：按固定相制作方法可分為：多孔型離子交換樹(shù)脂(包括微孔型和大孔型)；表面多孔型(包括薄膜型）離子交換樹(shù)脂；離子交換鍵合型。首頁(yè)上一頁(yè)下一頁(yè)末頁(yè)退出第五十七頁(yè)，共七十四頁(yè)，2022年，8月28日（1）多孔型聚苯乙烯+二乙烯苯交聯(lián)，分微孔型和大孔型。交換基團(tuán)多——交換容量大，穩(wěn)定。但易溶脹，傳質(zhì)慢、柱效低、分析速度慢。（2）表面多孔型薄膜型=惰性核+樹(shù)脂薄層(1-2μm)多孔型=惰性核+硅膠微球+樹(shù)脂薄層克服了多孔型離子交換樹(shù)脂的不足，但交換容量低，柱子易超負(fù)荷。首頁(yè)上一頁(yè)下一頁(yè)末頁(yè)退出第五十八頁(yè)，共七十四頁(yè)，2022年，8月28日（3）離子交換鍵合相

利用化學(xué)反應(yīng)將離子交換基團(tuán)鍵合到惰性載體表面。載體可以是薄殼玻珠，也可以是多孔硅膠微粒。使用后者為載體，可得到性能穩(wěn)定、耐壓、高柱效的柱子。

3、流動(dòng)相

離子交換色譜流動(dòng)相為鹽類緩沖溶液(有一定pH和離子強(qiáng)度)，通過(guò)改變pH、緩沖劑類型、離子強(qiáng)度、加入有機(jī)試劑和配位劑等條件來(lái)控制分配比k，改變交換劑的選擇性，進(jìn)而影響樣品待測(cè)物的分離。

pH值：影響酸或堿的離解平衡，控制組分離子形式所占的分?jǐn)?shù)。當(dāng)組分以分子形式存在時(shí)，則不被保留；離子分?jǐn)?shù)越高，保留值越大。常用的有檸檬酸鹽、磷酸鹽、甲酸鹽、乙酸鹽和氨水等。要視不同情況而定。例如，分離有機(jī)酸和有機(jī)堿時(shí)，這些酸堿的離解程度可通過(guò)改變流動(dòng)相的pH值來(lái)控制。增大pH值會(huì)使酸的電離度增加，使堿的電離度減少；降低pH值，其結(jié)果相反。但無(wú)論屬于哪種情況，只要電離度增大，就會(huì)使樣品的保留增大。

首頁(yè)上一頁(yè)下一頁(yè)末頁(yè)退出第五十九頁(yè)，共七十四頁(yè)，2022年，8月28日無(wú)論在強(qiáng)的還是弱的陰離子交換柱上，蛋白質(zhì)均顯示不同pH值影響結(jié)果，因此決定了它的保留選擇性、分離度和回收率等因素。首頁(yè)上一頁(yè)下一頁(yè)末頁(yè)退出第六十頁(yè)，共七十四頁(yè)，2022年，8月28日首頁(yè)上一頁(yè)下一頁(yè)末頁(yè)退出第六十一頁(yè)，共七十四頁(yè)，2022年，8月28日離子強(qiáng)度I：對(duì)保留值的影響比pH更大。組分保留值受流動(dòng)相中鹽類總濃度控制。增加外加陰或陽(yáng)離子將增加它們對(duì)-R+或-R-的競(jìng)爭(zhēng)能力，使組分保留值減小。通過(guò)加入不同種類的鹽，可影響柱的選擇性，因?yàn)椴煌镔|(zhì)對(duì)交換劑的親和能力不同。有機(jī)溶劑：外加有機(jī)溶劑通常減小組分的保留值。其極性越小，保留值越小。常用的有機(jī)溶劑有甲醇、乙醇、乙腈和二氧雜環(huán)已烷等。配離子L：當(dāng)大量L和組分X隨流動(dòng)相進(jìn)入柱后，發(fā)生配位劑交換：RM-L+X??RM-X+L。該法用于分離各種氨基酸或堿類。首頁(yè)上一頁(yè)下一頁(yè)末頁(yè)退出第六十二頁(yè)，共七十四頁(yè)，2022年，8月28日四、離子色譜離子色譜(IC)是70年代發(fā)展的新方法。其分離原理與離子交換色譜原理一樣，只是流出的各種離子用電導(dǎo)檢測(cè)器檢測(cè)。但由于流動(dòng)相都是強(qiáng)電解質(zhì)，其電導(dǎo)率比待測(cè)離子約高2個(gè)數(shù)量級(jí)，這種強(qiáng)背景電導(dǎo)會(huì)完全掩蓋待測(cè)離子信號(hào)。為解決此問(wèn)題，1975年Small提出，在離子交換柱之后，再串結(jié)一根抑制柱。該柱裝填與分離柱電荷完全相反的離子交換樹(shù)脂。通過(guò)分離柱后的樣品再經(jīng)過(guò)抑制柱，使具有高背景電導(dǎo)的流動(dòng)相轉(zhuǎn)變?yōu)榈捅尘半妼?dǎo)的流動(dòng)相，從而可用電導(dǎo)檢測(cè)器檢測(cè)各種離子的含量。例如：分析陽(yáng)離子時(shí)，以無(wú)機(jī)酸為流動(dòng)相，抑制柱為高容量的強(qiáng)堿性陰離子交換樹(shù)脂，則發(fā)生下列反應(yīng)：R+—OH+HCl(流動(dòng)相)——R+—Cl-+H2OR+—OH+MCl(待測(cè)物)——R+—Cl+M+OH-可見(jiàn)，不僅大量酸轉(zhuǎn)化為低電導(dǎo)的水，而且待測(cè)離子轉(zhuǎn)化為具有更大淌度的堿。首頁(yè)上一頁(yè)下一頁(yè)末頁(yè)退出第六十三頁(yè)，共七十四頁(yè)，2022年，8月28日由反應(yīng)可見(jiàn)：經(jīng)抑制柱后，一方面將大量酸轉(zhuǎn)變?yōu)殡妼?dǎo)很小的水，消除了流動(dòng)相本底電導(dǎo)的影響。同時(shí)，又將樣品陽(yáng)離子M+轉(zhuǎn)變成相應(yīng)的堿，由于OH-離子的淌度為Cl-離子的2．6倍，提高了所測(cè)陽(yáng)離子電導(dǎo)的檢測(cè)靈敏度。對(duì)于陰離子樣品也有相似的作用機(jī)理。在分離柱后加一個(gè)抑制柱的離子色譜亦稱為抑制型離子色譜或稱雙柱離子色譜。由于抑制柱要定期再生，而且譜帶在通過(guò)抑制柱后會(huì)加寬，降低了分離度。后來(lái)，F(xiàn)rits等人提出采用抑制柱的離子色譜體系，而采用了電導(dǎo)率極低的溶液，例如1×10-4～5×10-4mol·dm-3苯甲酸鹽或鄰苯二甲酸鹽的稀溶液作流動(dòng)相，稱為非抑制型離子色譜或單柱離子色譜。第六十四頁(yè)，共七十四頁(yè)，2022年，8月28日優(yōu)點(diǎn)：（1）分析速度快可在數(shù)分鐘內(nèi)完成一個(gè)試樣的分析；（2）分離能力高在適宜的條件下，可使常見(jiàn)的各種陰離子混合物分離；例：使用雙柱法，在十幾分鐘內(nèi)，可使七種陰離子完全分離。（3）分離混合陰離子的最有效方法（4）耐腐蝕，儀器流路采用全塑件，玻璃柱首頁(yè)上一頁(yè)下一頁(yè)末頁(yè)退出第六十五頁(yè)，共七十四頁(yè)，2022年，8月28日該法的不足之處在于：抑制柱要定期再生、譜峰在經(jīng)過(guò)抑制柱后會(huì)展寬，降低分