課件一-激光共聚焦掃描顯微鏡原理功能

激光掃描共聚焦顯微鏡

（LaserScanningConfocalMicroscope，LSCM）--基本原理及實(shí)例應(yīng)用李真2014-10-23研究生細(xì)胞生物學(xué)技術(shù)1.簡(jiǎn)述激光共聚焦顯微鏡的工作原理。

2.簡(jiǎn)述激光共焦顯微鏡與熒光顯微鏡的差別。它有哪些優(yōu)缺點(diǎn)？3.簡(jiǎn)述激光共聚焦顯微鏡的功能。

思考題它和熒光顯微鏡的關(guān)系？它和電子顯微鏡的關(guān)系？觀察的信號(hào)如何而來？激光掃描共聚焦顯微鏡

LaserScanningConfocalMicroscope,LSCM激光共聚焦顯微鏡的原理第一部分--以激光作為激發(fā)光源，采用光源針孔與檢測(cè)針孔共軛聚焦技術(shù)，對(duì)樣本進(jìn)行斷層掃描，以獲得高分辨率光學(xué)切片的熒光顯微鏡系統(tǒng)。激光掃描共聚焦顯微鏡

LaserScanningConfocalMicroscope,LSCM光源光學(xué)原理成像原理基于的平臺(tái)激光針孔的共軛聚焦技術(shù)斷層掃描熒光顯微鏡系統(tǒng)泛指將微小(分辨率0.2μM)不可見或難見物品之影像放大,而能被觀察的工具。目鏡光源聚焦旋鈕光闌和聚光器載物臺(tái)物鏡顯微鏡（Microscope）用于研究熒光或熒光標(biāo)記物質(zhì)的光學(xué)顯微鏡。熒光顯微鏡

FluorescenceMicroscope照相裝置分光鏡光源（汞燈）標(biāo)記了熒光的樣品基本原理紫外、藍(lán)、綠高壓汞燈被熒光探針染色的生物樣本激發(fā)被標(biāo)記結(jié)構(gòu)的熒光光學(xué)圖像光學(xué)成像濾鏡分光共聚焦顯微鏡成像物鏡標(biāo)本針孔（pinhole）焦平面普通顯微鏡成像熒光顯微鏡VS激光共聚焦顯微鏡

光學(xué)原理熒光顯微鏡光源針孔檢測(cè)針孔激光共聚焦掃描顯微鏡分光鏡光源檢測(cè)器標(biāo)本物鏡熒光顯微鏡系統(tǒng)樣品熒光顯微鏡VS激光共聚焦顯微鏡

成像原理激光共聚焦掃描系統(tǒng)斷層掃描技術(shù)，逐點(diǎn)逐行掃描成像CCD成像技術(shù)，一次性成像X光機(jī)CT機(jī)普通熒光顯微鏡激光共聚焦顯微鏡特點(diǎn)：側(cè)面有掃描器接口；裝有微量步進(jìn)馬達(dá)；裝有防振動(dòng)裝置；裝有光路轉(zhuǎn)換裝置；配高數(shù)值孔徑的物鏡。熒光顯微鏡VS激光共聚焦顯微鏡

顯微鏡系統(tǒng)特點(diǎn)：側(cè)面有掃描器接口；裝有微量步進(jìn)馬達(dá)；裝有防振動(dòng)裝置；裝有光路轉(zhuǎn)換裝置；配高數(shù)值孔徑的物鏡。熒光顯微鏡VS激光共聚焦顯微鏡

激發(fā)光源激光掃描共聚焦顯微鏡的優(yōu)缺點(diǎn)1957年，MarvinMinsky在他的專利中首次闡明了激光掃描共聚焦顯微鏡技術(shù)的基本工作原理1967年，Egger和Petran成功地應(yīng)用共聚焦顯微鏡產(chǎn)生了一個(gè)光學(xué)橫斷面1970年，Sheppard和Wilson推出第一臺(tái)單光束共聚焦激光掃描顯微鏡問世1985年，多個(gè)實(shí)驗(yàn)室的多篇報(bào)道顯示共聚焦顯微鏡可以消除焦點(diǎn)模糊，得到清晰的圖像，至此LSCM技術(shù)基本成熟1987年，BIO-RAD公司推出了第一臺(tái)商業(yè)化的共聚焦顯微鏡激光掃描共聚焦顯微鏡的發(fā)展目前常見的激光共聚焦顯微鏡激光共聚焦顯微鏡構(gòu)成掃描器系統(tǒng)熒光顯微鏡系統(tǒng)計(jì)算機(jī)圖像存儲(chǔ)與處理系統(tǒng)ZeissLSM-710ConfocalSystem激光光源ZeissLSM-510ConfocalSystem

ZeissLSM-710ConfocalSystem

激光共聚焦顯微鏡的功能第二部分激光共聚焦顯微鏡的功能ZOOM成像薄層光學(xué)切片熒光定量分析多維度成像多通道同時(shí)掃描……薄層光學(xué)切片激光共聚焦顯微鏡的功能使用共扼光路使非焦平面的光線被抑制，減少了成像的干擾。使用光色較純的激光，所以成像分辨率可達(dá)普通光學(xué)顯微鏡的1.4倍。牛肺上皮細(xì)胞

展現(xiàn)最清晰成像細(xì)節(jié)ByGeorgevonDassow,UniversityofOregon展現(xiàn)最清晰成像細(xì)節(jié)小鼠神經(jīng)元細(xì)胞

高清晰成像多通道同時(shí)掃描普通熒光顯微鏡每次只能觀測(cè)一種熒光，要觀測(cè)多種熒光標(biāo)記的樣品需要多次觀測(cè)，對(duì)樣品損傷大。激光共聚焦顯微鏡可以多激光多通道同時(shí)掃描，多通道同時(shí)探測(cè)。激光共聚焦顯微鏡的功能動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞三標(biāo)記玉米根莖多重?zé)晒鈽?biāo)記綠色：SYBR14染色，活精子紅色：PI染色，死精子綠色：活菌紅色：死菌牛精子藤黃微球菌擬南芥，ByHeitiPaves,CentreofExcellenceENVIRON,Estonia

斑馬魚神經(jīng)元系統(tǒng)，byAlbertPan，HarvardUniversity共聚焦絢麗圖像視網(wǎng)膜煙花，byJoshR.Sanes,HarvardUniversityZOOM成像激光共聚焦顯微鏡的功能在不變換鏡頭的情況下，對(duì)某幅圖片的局部放大，并進(jìn)行精細(xì)逐點(diǎn)掃描成像，獲得高分辨率圖像。共聚焦的優(yōu)勢(shì)ZOOM和高分辨率掃描的極限多維度掃描通過調(diào)節(jié)針孔的大小，控制樣品掃描層面的厚度，可逐層獲得高分辨率的光學(xué)橫斷面圖像。并可用計(jì)算機(jī)軟件后期合成去除非交信息的三維立體圖像。XYZ掃描XYT掃描激光共聚焦顯微鏡的功能大鼠卵細(xì)胞的細(xì)胞骨架胚胎的結(jié)構(gòu)單層面掃描

多層疊加切片分層疊加三維圖像重建三維圖像重建三維圖像重建—?jiǎng)討B(tài)觀測(cè)熒光定量分析激光共聚焦顯微鏡的功能使用能量穩(wěn)定的激光作為光源，且各種參數(shù)可調(diào)。熒光探針的特異性標(biāo)記：即熒光強(qiáng)度與特異性標(biāo)記蛋白的表達(dá)量成正相關(guān)。同一個(gè)光學(xué)條件下，應(yīng)用相同的熒光探針，通過比對(duì)各組樣品之間的熒光強(qiáng)度值，進(jìn)行定量分析。熒光定量分析隨機(jī)圈取細(xì)胞，可得到所圈細(xì)胞的相對(duì)熒光強(qiáng)度值熒光表達(dá)量測(cè)定利用熒光與透射光同時(shí)掃描，觀測(cè)相等面積內(nèi)不同組間熒光標(biāo)記蛋白表達(dá)的差異。細(xì)胞中特異性熒光標(biāo)記的蛋白在不同藥物環(huán)境和不同培養(yǎng)時(shí)間條件下的水平差異。激光共聚焦顯微鏡技術(shù)應(yīng)用第三部分如何獲得一幅好的圖片觀察的對(duì)象

熒光（Fluorescence）熒光：物質(zhì)吸收能量后所釋放出的冷發(fā)光現(xiàn)象

通常為吸收短波長(zhǎng)的能量后發(fā)散出長(zhǎng)波長(zhǎng)的光熒光光譜：激發(fā)光譜—通過測(cè)量熒光物質(zhì)的熒光發(fā)射強(qiáng)度隨激發(fā)波長(zhǎng)變化而獲得的光譜。發(fā)射光譜—熒光物質(zhì)的熒光發(fā)射強(qiáng)度隨放射波長(zhǎng)變化而獲得的光譜。488nm525nmFITC450nm490nm400450500550600650700750800EXCITATIONandEMISSIONSPECTRA激發(fā)光譜發(fā)射光譜

TexasRed

Cy5INTENSITY[arb.units]WAVELENGTH[nm]FITCRhodamine熒光物質(zhì)不同其光譜也不同自發(fā)熒光：指組織細(xì)胞不經(jīng)任何熒光染色便能夠激發(fā)熒光。免疫熒光：熒光抗體法產(chǎn)生熒光。觀察的對(duì)象

熒光（Fluorescence）外源導(dǎo)入熒光蛋白：利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)將熒光蛋白基因?qū)爰?xì)胞里，讓其表達(dá)融合蛋白而產(chǎn)生的熒光。組織和細(xì)胞中熒光的來源熒光染色：很多熒光染料與組織細(xì)胞作用，能夠在光的作用發(fā)出特征波長(zhǎng)的熒光，借以觀察組織細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)、化學(xué)組成和功能。綠色熒光蛋白

（Green-FluorescentProtein，GFP）由于長(zhǎng)波能量低,細(xì)胞忍受能力強(qiáng),適合活體檢測(cè)。熒光極其穩(wěn)定,在激發(fā)光照射下,GFP抗光漂白能力比熒光素強(qiáng)，適合長(zhǎng)時(shí)間觀察。分子量較小,易與目的基因形成融合蛋白且不影響自身的目的基因產(chǎn)物的空間構(gòu)象和功能。238個(gè)氨基酸組成。激發(fā)波長(zhǎng)479nm發(fā)射波長(zhǎng)508nm1962年，日本下村修（Shimomure）等首先從維多利亞水母中分離出了GFP。2008年，美國(guó)科學(xué)家錢永健、馬丁·沙爾菲和下村修三人因發(fā)現(xiàn)GFP而獲得諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。衍生物和突變體：BFP、CFP、GFP、RFP、YFP熒光探針與熒光標(biāo)記：采用一定的標(biāo)記物，使樣品中待測(cè)物質(zhì)具有特定的熒光特征，這種標(biāo)記物被稱為熒光探針。這種給樣品賦予特征熒光的操作稱作熒光標(biāo)記。熒光探針的選擇熒光探針的種類：①大分子探針②細(xì)胞器探針③核酸探針④金屬離子探針⑤細(xì)胞電位和細(xì)胞內(nèi)pH值探針⑥分子的特殊集團(tuán)結(jié)合探針……熒光探針的選擇選擇的依據(jù)：根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康拇_定需要檢定的指標(biāo)；確定可供選擇的熒光探針的范圍；考察熒光探針的特性是否符合熒光樣品的制備要求；考察熒光探針與所用共聚焦顯微鏡系統(tǒng)的匹配情況。標(biāo)記的熒光需要在不被其他因素的干擾下能被激光共聚焦顯微鏡系統(tǒng)檢測(cè)到熒光探針的選擇—多重?zé)晒鈽?biāo)記原則：盡量減小不同熒光物質(zhì)間激發(fā)/發(fā)射光譜的重疊。標(biāo)記要求熒光素選擇/組合核復(fù)染單標(biāo)

無特殊限制。

FITC,Cy2最佳；盡量不選擇Cy5,Cy5.5（紅外)與自發(fā)熒光沖突時(shí)，采用TexasRed

。PI/DAPI雙標(biāo)FITC/Cy2+TEXASREDFITC/Cy2+RHODAMINE/Cy3(必須順序掃描)DAPI(必須順序掃描)三標(biāo)FITC/Cy2+TEXASRED+Cy5.5FITC/Cy2

+RHODAMINE/Cy3+Cy5.5

(必須順序掃描)活細(xì)胞追蹤能被細(xì)胞主動(dòng)攝取、對(duì)細(xì)胞無毒性作用、能在活細(xì)胞內(nèi)長(zhǎng)時(shí)間存在、隨細(xì)胞分裂進(jìn)入子細(xì)胞()顯微注射；轉(zhuǎn)基因技術(shù)（GFP；GFP-ACTIN）1.作為亞細(xì)胞定位的標(biāo)記蛋白定位在哪里呢？核復(fù)染的作用2.作為整體結(jié)構(gòu)的標(biāo)記圖中共有多少個(gè)細(xì)胞？陽(yáng)性蛋白的表達(dá)效率是多少？熒光探針的選擇—多重?zé)晒鈽?biāo)記原則：盡量減小不同熒光物質(zhì)間激發(fā)/發(fā)射光譜的重疊。標(biāo)記要求熒光素選擇/組合核復(fù)染單標(biāo)

無特殊限制。

FITC,Cy2最佳；盡量不選擇Cy5,Cy5.5（紅外)與自發(fā)熒光沖突時(shí)，采用TexasRed

。PI/DAPI雙標(biāo)FITC/Cy2+TEXASREDFITC/Cy2+RHODAMINE/Cy3(必須順序掃描)DAPI(必須順序掃描)三標(biāo)FITC/Cy2+TEXASRED+Cy5.5FITC/Cy2

+RHODAMINE/Cy3+Cy5.5

(必須順序掃描)活細(xì)胞追蹤能被細(xì)胞主動(dòng)攝取、對(duì)細(xì)胞無毒性作用、能在活細(xì)胞內(nèi)長(zhǎng)時(shí)間存在、隨細(xì)胞分裂進(jìn)入子細(xì)胞()顯微注射；轉(zhuǎn)基因技術(shù)（GFP；GFP-ACTIN）樣品前處理組織切片：切片的厚度

4-50mm

①冰凍切片：優(yōu)點(diǎn)是易操作，熒光背景低；缺點(diǎn)是容易破壞組織結(jié)構(gòu)，不利于形態(tài)觀察。

②石蠟切片：優(yōu)點(diǎn)是樣品易保存，缺點(diǎn)是容易引入干擾熒光。細(xì)胞標(biāo)本：

①細(xì)胞種類和純度雜細(xì)胞的干擾會(huì)導(dǎo)致錯(cuò)誤實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

②細(xì)胞密度：如果進(jìn)行形態(tài)觀察、三維重建、定位熒光信號(hào)，細(xì)胞密度不低于20％；

如果是測(cè)定熒光強(qiáng)度，細(xì)胞約占視野面積的80％。

③承載細(xì)胞的器皿：petri皿（又稱小皿）：適用面最廣，可用于活的或固定的細(xì)胞樣品。蓋玻片：適用于固定的細(xì)胞。樣品制備的基本原則

樣品前處理---熒光標(biāo)記---上機(jī)觀察樣品制備的基本原則

樣品前處理---熒光標(biāo)記---上機(jī)觀察熒光標(biāo)記染料直接染色：生物樣品與熒光探針直接作用，使樣品具有熒光。免疫熒光：是將抗體標(biāo)記上熒光素與細(xì)胞或組織內(nèi)相應(yīng)的抗原結(jié)合后，通過觀察檢測(cè)特征的熒光，定性、定位及定量的檢測(cè)樣品中的抗體。表達(dá)熒光蛋白：跟蹤活組織或細(xì)胞內(nèi)基因表達(dá)及蛋白定位的標(biāo)記物。免疫熒光直接標(biāo)記：一抗上帶有熒光探針間接標(biāo)記：二抗上帶有熒光探針樣品制備的基本原則上機(jī)觀察前的注意事項(xiàng)：

盡快上機(jī)采集圖像，防止熒光泄漏、熒光淬滅及樣品干燥等導(dǎo)致的熒光變化。

封片：△防止樣本變形△防止熒光褪色△用于LSCM的蓋玻片厚度應(yīng)為0.17mm

在用激光共聚焦顯微鏡觀察前，先用普通熒光顯微鏡觀察有無信號(hào)。

樣品前處理---熒光標(biāo)記---上機(jī)觀察樣品的陰性對(duì)照：病變組與非病變組藥物處理的陰性對(duì)照：加藥組與未