注射用鹽酸萬古霉素效價含量檢測方法建立

注射用鹽酸萬古霉素效價含量檢測方法建立注射用鹽酸萬古霉素近年來在臨床上運用逐漸增多，根據(jù)2020版《中國藥典》采用抗生素微生物檢定法二劑量管碟法進行了含量的方法學驗證，并以此建立了注射用鹽酸萬古霉素的效價含量檢測方法。1實驗部分1.1主要儀器與試劑多功能微生物自動測量分析儀:ZY-300IV型,北京先驅威鋒技術開發(fā)公司；恒溫培養(yǎng)箱:上海躍進醫(yī)療器械廠；分析天平:XS205DU型,分度值0.00001g,Mettler公司；脈動真空滅菌器:山東新華醫(yī)療器械股份有限公司；定量培養(yǎng)皿:直徑90mm；牛津杯,陶瓦蓋等；磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀:分析純；萬古霉素標準品：批號130360-212103，中檢院；抗生素檢定培養(yǎng)基8號：酵母浸出粉1.0g，硫酸銨1.0g，葡萄糖

5.0g，瓊脂17.0g，磷酸二氫鉀

8.0g

，磷酸氫二鉀2.0g，pH值6.5-6.6

25℃，取本品34.0g，加熱溶解于1L蒸餾水，分裝，115℃滅菌30分鐘；檢定菌：枯草芽孢桿菌〔CMCC(B)63501〕，中檢院。1.2實驗方法（1）緩沖液、菌液、雙碟制備稱取磷酸氫二鉀2g與磷酸二氫鉀8g，加純化水使成1000ml，濾過，115℃滅菌30分鐘，制得pH6.0的磷酸鹽緩沖液。取枯草芽孢桿菌〔CMCC(B)63501〕的營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物，接種于盛有營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，在35～37℃培養(yǎng)7天，用革蘭氏染色法涂片鏡檢，應有芽孢85%以上。用滅菌水將芽孢洗下，在65℃加熱30分鐘，冰箱儲存?zhèn)溆?。取直徑約90mm,高16～17mm的平底雙碟,分別注入20mL加熱融化的抗生素檢定培養(yǎng)基8,使在碟底內均勻攤布,放置水平臺上使其凝固,作為底層;另取培養(yǎng)基8加熱融化后,放冷水浴保溫至60℃,加入枯草芽孢桿菌菌懸液適量(高濃度抑菌圈直徑應控制在18～22mm之間)搖勻,在每一雙碟中分別加入5mL,使在底層上均勻攤布,作為菌層。然后放置水平臺上冷卻后,在每一雙碟中以等距離均勻放置牛津杯4個,用陶瓦圓蓋覆蓋,備用。（2）專屬性試驗根據(jù)注射用鹽酸萬古霉素處方比例，精密稱取空白輔料，置于容量瓶中，加滅菌水定容，搖勻。精密稱取萬古霉素標準品于容量瓶中，加滅菌水定容，使之成為1000單位/ml的標準液。加入pH6.0的磷酸鹽緩沖液稀釋定容，得到最終濃度為10單位/ml和5單位/ml的溶液，搖勻，依法測定。空白輔料應無抑菌圈生成。

A:空白輔料

B:鹽酸萬古霉素（3）線性試驗精密稱取萬古霉素標準品加滅菌水定容，使之成為1000單位/ml的標準液。加入pH6.0的磷酸鹽緩沖液稀釋定容，得到100單位/ml的溶液。再加入pH6.0的磷酸鹽緩沖液定容，搖勻，配制成一系列濃度溶液，劑間濃度比為1:0.8，以6.4u/ml濃度點為中心濃度。取已備好的雙碟40只，分為8組，每組5只，采用三劑量法，在雙碟菌層培養(yǎng)基表面，放置6枚鋼管，每碟內間隔的3枚鋼管內分別滴滿C1～C8的各濃度溶液，另3枚鋼管內均滴滿標準品中心濃度溶液（C0），經(jīng)培養(yǎng)14～16小時后，逐一測量每個抑菌圈直徑。分別求出每組3個碟中心濃度C0所致抑菌圈直徑平均值y0及C1～C8所致抑菌圈直徑平均值yk（CK＝C1～C8），計算yk～y0的差數(shù)（fk），以fk值為橫坐標，以相應的濃度對數(shù)值為縱坐標，繪制標準曲線，并得出回歸直線方程與相關系。（4）準確度試驗精密稱取萬古霉素標準品加滅菌水定容，使之成為1000單位/ml的標準液。加入pH6.0的磷酸鹽緩沖液稀釋定容，得到分別為10單位/ml和5單位/ml的溶液。按注射用鹽酸萬古霉素處方的成分和比例，設計3個不同濃度，每個濃度分別制備3份供試品溶液進行測定。注射用鹽酸萬古霉素80%標示量的供試品，注射用鹽酸萬古霉素100%標示量的供試品，注射用鹽酸萬古霉素120%標示量的供試品。表1準確度檢測結果：標示量（%）回收率（%）80%100.98100.91100.08100%100.1899.3898.52120%101.6599.2199.95（5）精密度試驗標準品溶液、供試品溶液：精密標準品、供試品置于容量瓶中，加滅菌水定容，使之成為1000單位/ml的溶液。加入pH6.0的磷酸鹽緩沖液稀釋定容，得到為10單位/ml和5單位/ml的溶液。兩名不同的化驗員不同日期用至少6份的測定結果進行評價。表2精密度檢測結果：人員1人員21110.6%110.3%2110.0%108.4%3109.3%109.1%4109.1%109.5%5109.8%108.4%6109.6%108.2%均值109.7%109.0%RSD(%)0.490.752結論通過上述方法學驗證，建立了注射用鹽酸萬古霉素的含量檢測方法。精密稱取適量注射用鹽酸萬古霉素（約相當于100000單位）置于100ml容量瓶中，加滅菌水定容，使之成為1000單位/ml的溶液。取1000單位/ml的溶液，加入pH6.0的磷酸鹽緩沖液稀釋定容，得到最終濃度為10單位/ml和5單位/ml的溶液，高低濃度的劑距為2:1。照抗生素微生物