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PAGEPAGE1試論微生物蛋白酶中文摘要:目前低溫蛋白酶的研究己經(jīng)引起世界各國學者們的關(guān)注。隨著對低溫蛋白酶研究的深入,將會有更多行業(yè)應用低溫蛋白酶。蛋白酶已廣泛應用在皮革、毛皮、絲綢、醫(yī)藥、食品、釀造等方面。皮革工業(yè)的脫毛和軟化已大量利用蛋白酶,既節(jié)省時間,又改善勞動衛(wèi)生條件。關(guān)鍵詞:低溫蛋白酶、測定、提取、純化、應用前景目錄一、中文摘要、關(guān)鍵詞…………………2二、目錄…………………3三、論文正文……………4(1)第一章蛋白酶的提取方法……4(2)第二章蛋白酶的純化方法……5(3)第三章低溫中溫高溫蛋白酶以及其作用……6(4)第四章蛋白酶的檢測方法…………………8(5)第五章低溫蛋白酶的應用前景,存在的問題………………9四、參考文獻……………10蛋白酶是水解蛋白質(zhì)肽鍵的一類酶的總稱。按其水解多肽的方式,可以將其分為內(nèi)肽酶和外肽酶兩類。內(nèi)肽酶將蛋白質(zhì)分子內(nèi)部切斷,形成分子量較小的月示和胨。外肽酶從蛋白質(zhì)分子的游離氨基或羧基的末端逐個將肽鍵水解,而游離出氨基酸,前者為氨基肽酶后者為羧基肽酶。按其活性中心和最適pH值,又可將蛋白酶分為絲氨酸蛋白酶、巰基蛋白酶、金屬蛋白酶和天冬氨酸蛋白酶。按其反應的最適pH值,分為酸性蛋白酶、中性蛋白酶和堿性蛋白酶。工業(yè)生產(chǎn)上應用的蛋白酶,主要是內(nèi)肽酶。蛋白酶廣泛存在于動物內(nèi)臟、植物莖葉、果實和微生物中。微生物蛋白酶,主要由霉菌、細菌,其次由酵母、放線菌生產(chǎn)。催化蛋白質(zhì)水解的酶類。種類很多,重要的有胃蛋白酶、胰蛋白酶、組織蛋白酶、木瓜蛋白酶和枯草桿菌蛋白酶等。蛋白酶對所作用的反應底物有嚴格的選擇性,一種蛋白酶僅能作用于蛋白質(zhì)分子中一定的肽鍵,如胰蛋白酶催化水解堿性氨基酸所形成的肽鍵。蛋白酶分布廣,主要存在于人和動物消化道中,在植物和微生物中含量豐富。由于動植物資源有限,工業(yè)上生產(chǎn)蛋白酶制劑主要利用枯草桿菌、棲土曲霉等微生物發(fā)酵制備。第一章蛋白酶的提取方法目前國內(nèi)對蛋白酶的分離技術(shù)主要是應用有機溶劑提取法、鹽析法、或底物親和法進行粗分離后,得到混合的胃酶(包括胃蛋白酶A、B、C、D),但應用到生產(chǎn)中的只有有機溶劑提取法和鹽析法。國外則對此研究較早,主要集中在20世紀六七十年代,經(jīng)鹽析得到了商業(yè)結(jié)晶胃蛋白酶。1.1有機溶劑沉淀法有機溶劑法可用于胃蛋白酶的初步提取濃縮,通常使用的有機溶劑有乙醇和丙酮。此種方法是利用生化物質(zhì)在不同濃度的有機溶劑中溶解度的差異而實現(xiàn)分離的[1.2鹽析法蛋白質(zhì)在水溶液中的溶解度是由蛋白質(zhì)周圍親水基團與水形成水化膜的程度,以及蛋白質(zhì)分子帶有電荷的情況決定的。當用中性鹽加入蛋白質(zhì)溶液,中性鹽對水分子的親和力大于蛋白質(zhì),于是蛋白質(zhì)分子周圍的水化膜層減弱乃至消失。同時,中性鹽加入蛋白質(zhì)溶液后,由于離子強度發(fā)生改變,蛋白質(zhì)表面電荷被大量中和,更加導致蛋白溶解度降低,使蛋白質(zhì)分子之間聚集而沉淀[41.3底物親和法底物親合法是利用酶(胃蛋白酶)與其底物(酪蛋白)的親和性,從胃黏膜中提取得到胃蛋白酶。使底物和酶在pH25的乳酸緩沖液中充分結(jié)合,然后調(diào)pH至40(底物的等電點)沉淀底物和酶的結(jié)合物,隨后讓沉淀物再溶解于乳酸緩沖液中,添加低濃度的SDS將底物和酶分離,得到酶-SDS復合物,再進一步分離純化。陳躬端(2001)成功的應用此法對蛇胃蛋白酶進行了實驗室分離,得率大約為30%。與傳統(tǒng)的分離方法比較,此法具有簡單高效的優(yōu)點,為后續(xù)的純化工藝避免了昂貴的活化試劑和配基的使用,同時具有較高的特異性第二章蛋白酶的純化方法[1.1凝膠過濾凝膠過濾主要是利用凝膠的多孔性,當樣品溶液通過凝膠柱時相對分子質(zhì)量較大的物質(zhì)由于直徑大于凝膠網(wǎng)孔,而只是沿著凝膠顆粒的孔隙隨著溶劑首先流出層析柱[1.2離子交換層析離子交換法一直以來都是酶生產(chǎn)所常用的方法。它是一項利用溶液中各種帶電粒子與離子交換劑之間結(jié)合力的差異進行物質(zhì)分離的操作技術(shù)。具有簡便、高效、成本低,且可自動化連續(xù)操作的優(yōu)點1.3雙重層析配合法為了獲得高活力的胃蛋白酶,還常將兩種層析方法配合使用。張繼平(2004)對暗紋東方鲀胃蛋白酶的純化時,采用CM-Cellulose柱純化(25cm!30cm),洗脫液為005mol/LpH50檸檬酸緩沖液,010mol/LNaCl直線梯度洗脫,流速為025mL/min,部分收集,每管收集約4mL,合并活力峰,再經(jīng)SephadexG-75(25cm!60cm)層析柱,獲得胃蛋白酶比活為713mol/(min?mg)[7]。基于以上對胃蛋白酶的分離純化技術(shù)的比較分析可以看出,長期以來分離提取技術(shù)一直沒有取得較大的突破,用有機溶劑、鹽析等技術(shù)得到的天然胃蛋白酶產(chǎn)品,純度、生物活性愈將不能滿足醫(yī)藥品和工業(yè)日益增長的需要。隨著分離科學技術(shù)的不斷發(fā)展,采用新型分離技術(shù)分離胃蛋白酶已勢在必行。因此,筆者認為以下幾種技術(shù)是胃蛋白酶分離純化的方向。1.3.1有機溶劑與鹽析共沉淀有機溶劑和鹽析法都是分離純化胃蛋白酶的傳統(tǒng)方法,有其各自的特點。如果將有機溶劑和鹽析配合使用,不僅可以降低鹽的用量,而且可以不同程度的消除各自分離純化所帶來的問題,得到的胃蛋白酶純度和活性也會有所增加。此法在實驗室的研究中已見報道,但在工業(yè)生產(chǎn)中,有機溶劑與鹽的用量還有待進一步優(yōu)化。1.3.2膜分離技術(shù)分離膜是一種特殊的、具有選擇性透過功能的薄層物質(zhì),能利用分子大小實現(xiàn)分離,從而起到濃縮和分離純化的作用[12]。由于其可在維持原生物體系環(huán)境的條件下實現(xiàn)分離,并可高效地濃縮、富集產(chǎn)物,有效地去除雜質(zhì),加之操作簡單,結(jié)構(gòu)緊湊、能耗低,過程簡化,無一次污染,也將成為胃蛋白酶分離純化工藝的研究方向。1.3.3等電點沉淀與底物親和法胃蛋白酶具有極低的等電點(如豬胃蛋白pH10),但胃蛋白酶的分離純化技術(shù)中等電點沉淀法未見報道,如果此方法可實現(xiàn),那將大大縮短分離純化的時間。底物親和法是分離純化胃蛋白酶的新亮點,但其工藝條件還不成熟,尤其是在分離底物和酶的復合物時,SDS的添加量有待研究。第三章低溫中溫高溫蛋白酶以及其作用低溫蛋白酶主要存在于低溫微生物中,而低溫微生物廣泛分布于極地、冰川、永久凍土和深海等寒冷環(huán)境,其冷適應能力是多種機理共同作用的結(jié)果,包括酶的低溫催化活性、低溫下膜流動性的保持、冷休克蛋白、抗凍蛋白以及抗凍保護劑等。低溫微生物主要應用于催化低溫發(fā)酵、表達熱不穩(wěn)定蛋白質(zhì)、生產(chǎn)抗凍保護劑和冬季治理污水等領(lǐng)域。早期對低溫適應機理的研究多集中在嗜冷酶的分離和特點研究,但僅通過酶學研究低溫微生物的機理有局限性,細胞膜在低溫下流動性的保持以及低溫下的新陳代謝也是低溫適應性機理中非常重要的部分。胞內(nèi)物,包括脅迫蛋白、抗凍蛋白、小分子化合物等的研究,也證明了微生物的耐冷性更趨向于全細胞的適應,而不是單純某類分子的特性改變。嗜冷酶在低溫下具有較高的催化效率kcat/K,從結(jié)構(gòu)方面講,嗜冷酶的低溫下活性主要得益于其分子組成特點引起的空間高柔韌性結(jié)構(gòu)(flexibility),或者說是由其熱不穩(wěn)定性引起酶分子的高柔韌性結(jié)構(gòu)使酶具有較高的底物結(jié)合能力從而降低Km,但高柔韌性結(jié)構(gòu)同樣也引起酶的耐熱性降低。嗜冷、嗜溫和嗜熱微生物中的谷氨酰脂脫氫酶(glutamatedehydrogenase)、β-內(nèi)酰胺酶(β-lactamases)和α-淀粉酶(α-amylase)等酶的氨基酸組成表明,嗜冷酶具有較少的脯氨酸和精氨酸,較低的脯氨酸與賴氨酸比,較少的二硫鍵。嗜冷、嗜溫和嗜熱3種DNA連接酶的三維模型分析顯示,其表面疏水殘基含量依次降低(22%、18%、17%),親水殘基含量依次升高(69%、75%、77%),中性氨基酸含量依次降低(21%、18%、14%);同時,低溫連接酶活性位點的表面可接觸中性殘基含量(20%)也高于其他兩種連接酶(18%、9%),表明嗜冷酶氨基酸殘基組成對酶的活性、柔韌性和耐熱性具有綜合影響。另外,其他研究表明減少鹽橋、離子鍵、芳香環(huán)相互作用,減弱結(jié)構(gòu)域的相互作用、增加表面環(huán)狀結(jié)構(gòu)(surfaceloops)也可以提高酶的柔韌性并降低其耐熱性。利用定點突變等手段改造中溫、嗜熱酶,使其具有類似于低溫的特性證明了氨基酸組成對酶的低溫活性具有重要影響,也為生產(chǎn)廣適應溫度蛋白酶奠定了基礎(chǔ)。Tindbaek等人通過定點改造,切除了中溫枯草桿菌蛋白酶(savinase,EC3.4.21.62)活性中心中的12個氨基酸殘基(LSLGSPSPSATL),并插入人工合成的低溫枯草桿菌蛋白酶S39的一段同源高柔韌性性區(qū)域(MSLGSSGESSLI),獲得一種新的蛋白酶H5。該酶在低溫下H5具有更高的催化活性與分子柔韌性,而其熱穩(wěn)定性也高于低溫枯草桿菌蛋白酶S39,而其最適催化溫度及pH值與出發(fā)酶savinase相同。氨基酸組成與結(jié)構(gòu)對比并不能完全解釋嗜冷酶的機制。如從南極分離出一株Arthrobacter屬低溫菌,其β-半乳糖苷酶在18℃具有最大活性,在0℃仍有50%活性,與另一種40℃最大活性的β目前對低溫微生物的應用正處于起步階段,并多為嗜冷酶的利用,但其他方面的研究也在逐步進展中,如膳食不飽和脂肪酸、作為防凍保護劑的抗凍蛋白、食品發(fā)酵中的低溫酵母等。在環(huán)境治理領(lǐng)域,利用低溫微生物可以在冬季等低溫環(huán)境下保持較高代謝活性的優(yōu)勢,一些環(huán)境治理的新方法也得以實現(xiàn),如固定化培養(yǎng)耐冷隱球酵母(Cryptococcussp.)和紅酵母(Rhodotorulasp.)降解工業(yè)苯酚等。另外,古細菌作為一種新興的生物資源,廣泛分布于高寒地帶,而開發(fā)和利用古細菌資源包括其表達的酶、蛋白質(zhì)、脂類等物質(zhì)已經(jīng)成為近年研究的熱點。第四章蛋白酶的檢測方法蛋白酶在一定的溫度和pH條件下,水解底物酪素產(chǎn)生含有酚基的氨基酸(如酪氨酸、色氨酸等),在堿性條件下,將福林試劑(Folin)還原,生成鉬藍與鎢藍,用分光光度計測定,計算其酶活力。1.試劑和溶液1mol/L及0.1mol/L鹽酸(HCl)溶液、100mg/mlL-酪氨酸標準液、0.4mol/L碳酸鈉(Na2CO3)溶液、福林(Folin)試劑、乳酸緩沖液、1.0%酪素溶液、0.4mol/L三氯乙酸(CCl3—COOH)溶液2.儀器和設(shè)備2.1恒溫水浴鍋。2.2分光光度計有10mm比色皿,可在660nm處測量吸光度。3測定步驟3.1標準曲線繪制分別吸取100mg/mlL-酪氨酸標準液0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0ml于10ml容量瓶中,用蒸餾水定容至刻度,制成每ml分別含L-酪氨酸0、10、20、30、40、50、60mg的稀標準液。各取上述溶液1.00ml(須做平行試驗)于試管中,加入0.4mol/L碳酸鈉溶液5.00ml,稀福林試劑1.00ml,置于40℃水浴中顯色20min,取出用10mm3.2待測酶液的制備3.3比色測定精確吸取待測酶液1.0ml(每個樣品3支平行試管),40℃水浴預熱2min。同時取適量1%酪素溶液在40℃水浴預熱3~5min,然后取其1.0ml,加入到經(jīng)預熱的上述酶液中,立即開始計時,于同時進行空白對照測定,其步驟為吸取待測酶液1.0ml,40℃水浴2min后加入2.0ml0.4mol/L三氯乙酸,404.計算X=(A×K×4×n)/(1×10)式中:X-樣品的酶活力,u/g;A-樣品平行試驗的平均吸光度;K-比色常數(shù);4-反應試劑體積(ml);n-樣品稀釋倍數(shù)(制備成的酶液ml數(shù)/2g酶粉),ml/g;1-參與反應的酶液量,ml;10-反應時間,min。第五章低溫蛋白酶的應用前景,存在的問題蛋白酶已廣泛應用在皮革、毛皮、絲綢、醫(yī)藥、食品、釀造等方面。皮革工業(yè)的脫毛和軟化已大量利用蛋白酶,既節(jié)省時間,又改善勞動衛(wèi)生條件。蛋白酶還可用于蠶絲脫膠、肉類嫩化、酒類澄清。臨床上可作藥用,如用胃蛋白酶治療消化不良,用酸性蛋白酶治療支氣管炎,用憚性蛋白酶治療脈管炎以及用胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶對外科化膿性創(chuàng)口的凈化及胸腔間漿膜粘連的治療。加酶洗衣粉是\t

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