第八講干細(xì)胞與iPS技術(shù)

LucasCranach,1472-1553第一頁(yè)，共72頁(yè)。自然界中生物的再生現(xiàn)象將渦蟲(chóng)切斷后，斷面能夠識(shí)別頭部或者尾部的位置，如果切掉的是頭，頭部將在該位置再生；如果切掉的是尾，尾巴將在該位置再生蠑螈的四肢、壁虎的尾巴都具有自然再生的能力青蛙與蠑螈同屬兩棲動(dòng)物，卻不具備再生的能力，但青蛙的前身蝌蚪卻又顯示出四肢再生的能力。

第二頁(yè)，共72頁(yè)。第三頁(yè)，共72頁(yè)。第四頁(yè)，共72頁(yè)。20世紀(jì)初，遺傳學(xué)家ThomasMorgan利用渦蟲(chóng)（flatworm,Planaria）為材料研究過(guò)再生問(wèn)題。研究表明切割下來(lái)的組織塊小到渦蟲(chóng)蟲(chóng)體的1/279時(shí)仍然能夠再生出一條小渦蟲(chóng)。因此,渦蟲(chóng)又被譽(yù)為“切不死的動(dòng)物”。他將這個(gè)過(guò)程稱(chēng)為變形再生（morphallaxis）。再生組織是由傷口處已分化細(xì)胞的去分化衍生而來(lái),還是來(lái)源于稱(chēng)為全能干細(xì)胞的neoblasts(未分化細(xì)胞),這是一個(gè)長(zhǎng)期爭(zhēng)論不休的問(wèn)題。第五頁(yè)，共72頁(yè)。后來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，在渦蟲(chóng)體內(nèi)有一種散布在全身，好似沒(méi)什么功能的非常小的細(xì)胞，它們就是干細(xì)胞。渦蟲(chóng)的干細(xì)胞能夠轉(zhuǎn)變成“其他任何種類(lèi)的細(xì)胞”，具有這種性質(zhì)的細(xì)胞在生物學(xué)上被稱(chēng)為“全能干細(xì)胞”。第六頁(yè)，共72頁(yè)。第一節(jié)干細(xì)胞

一、干細(xì)胞的定義

干細(xì)胞是一類(lèi)具有自我更新和分化潛能的細(xì)胞。第七頁(yè)，共72頁(yè)。二.干細(xì)胞特性及分類(lèi)

干細(xì)胞的特性：1，形態(tài)和生化特征:圓形、體積小、核質(zhì)比例大，端粒酶活性高第八頁(yè)，共72頁(yè)。

2，干細(xì)胞的增殖特點(diǎn)

緩慢性：干細(xì)胞的增殖速度一般比較慢。而一旦機(jī)體需要時(shí)，干細(xì)胞就可以進(jìn)入分化。自穩(wěn)性：會(huì)自我更新維持自身數(shù)目的恒定。（self-maintenance）干細(xì)胞維持自穩(wěn)性的機(jī)制：對(duì)稱(chēng)分裂和不對(duì)稱(chēng)分裂

第九頁(yè)，共72頁(yè)。

干細(xì)胞的對(duì)稱(chēng)分裂和不對(duì)稱(chēng)分裂對(duì)稱(chēng)分裂（symmetrydivision）不對(duì)稱(chēng)分裂（asymmetrydivision）干細(xì)胞

分化細(xì)胞

干細(xì)胞

分化細(xì)胞第十頁(yè)，共72頁(yè)。緩慢性干細(xì)胞若干次分裂過(guò)渡放大細(xì)胞是介于干細(xì)胞和分化細(xì)胞之間的中間態(tài)細(xì)胞。它可以起到通過(guò)較少的干細(xì)胞產(chǎn)生較多的分化細(xì)胞的作用。分化細(xì)胞過(guò)渡放大細(xì)胞第十一頁(yè)，共72頁(yè)。3，干細(xì)胞的分化特點(diǎn)

1）.多潛能性2）.去分化和轉(zhuǎn)分化的能力第十二頁(yè)，共72頁(yè)。在不同生長(zhǎng)因子刺激下干細(xì)胞可表現(xiàn)出不同分化潛能第十三頁(yè)，共72頁(yè)。（內(nèi)胚層）

胃上皮（中胚層）

骨、軟骨、平滑肌、橫紋肌（外胚層）

神經(jīng)表皮、神經(jīng)節(jié)、復(fù)層鱗狀上皮人胚胎干細(xì)胞具分化的多潛能性

小鼠皮下注射

混合組織瘤人胚胎干細(xì)胞第十四頁(yè)，共72頁(yè)。（1）去分化

一種干細(xì)胞向其前體細(xì)胞的逆向轉(zhuǎn)化的過(guò)程。（2）轉(zhuǎn)分化（transdifferentiation）

一種組織類(lèi)型的干細(xì)胞在適當(dāng)條件下分化為另一種組織類(lèi)型細(xì)胞的過(guò)程。

例一：將成年雄性小鼠的造血干細(xì)胞移植到雌鼠體內(nèi)，3天后在雌鼠的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中檢測(cè)到Y(jié)染色體的存在，證明成體動(dòng)物的造血干細(xì)胞可轉(zhuǎn)分化成為神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。2）.去分化和轉(zhuǎn)分化的能力第十五頁(yè)，共72頁(yè)。例二：造血干細(xì)胞向骨骼肌細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化第十六頁(yè)，共72頁(yè)。（二）干細(xì)胞的分離與純化

1.通過(guò)干細(xì)胞表面的標(biāo)記分子進(jìn)行造血干細(xì)胞標(biāo)記物為CD34＋等；神經(jīng)干細(xì)胞的巢素蛋白。2.通過(guò)干細(xì)胞不同于一般分化細(xì)胞的物理特性進(jìn)行

干細(xì)胞不被Hoechst33342和Rhodamine123染色。第十七頁(yè)，共72頁(yè)。三，干細(xì)胞的分類(lèi)（1）全能干細(xì)胞：具有全能性，能夠分化成全身200多種細(xì)胞類(lèi)型，并能進(jìn)一步形成機(jī)體的任何組織和器官。以生殖干細(xì)胞（embryonicgermcells,EG細(xì)胞）為代表。（2）多能干細(xì)胞：具有分化成多種細(xì)胞和組織的潛能，但卻失去了發(fā)育成完整個(gè)體的能力。以胚胎干細(xì)胞（embryonicstemcells,ES細(xì)胞）為代表。（3）專(zhuān)能干細(xì)胞：只能向一種或密切相關(guān)的兩種類(lèi)型的細(xì)胞分化。第十八頁(yè)，共72頁(yè)。第十九頁(yè)，共72頁(yè)。第二十頁(yè)，共72頁(yè)。第二十一頁(yè)，共72頁(yè)。（一）胚胎干細(xì)胞

人體發(fā)生過(guò)程：受精卵裂受精后72h受精后5-7天精子+卵子

合子卵裂球桑椹胚囊胚滋養(yǎng)層胎盤(pán)及胎兒附屬結(jié)構(gòu)囊胚內(nèi)胚層消化道、呼吸道上皮和腺體；肝；膽；胰。內(nèi)細(xì)胞群中胚層結(jié)締組織；血液；肌肉；骨骼；泌尿生殖系統(tǒng)外胚層體表結(jié)構(gòu)；神經(jīng)系統(tǒng)第二十二頁(yè)，共72頁(yè)。胚胎干細(xì)胞的概念胚胎干細(xì)胞（embryonicstemcell,ES細(xì)胞）指從著床前的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)或原始生殖細(xì)胞獲得的一種具有多潛能性、可發(fā)育成為各種細(xì)胞、同時(shí)可保持不分化狀態(tài)而持續(xù)生長(zhǎng)的克隆細(xì)胞系。第二十三頁(yè)，共72頁(yè)。胚胎干細(xì)胞的生物學(xué)特性

(1)ES細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)與核型：

各種動(dòng)物的ES細(xì)胞具有與早期胚胎細(xì)胞相似的形態(tài)結(jié)構(gòu)，細(xì)胞體積小、核大、有1個(gè)或多個(gè)核仁。

第二十四頁(yè)，共72頁(yè)。

(2)ES細(xì)胞的生長(zhǎng)特性：對(duì)于高等脊椎動(dòng)物而言，干細(xì)胞在機(jī)體組織中的居所被稱(chēng)為干細(xì)胞巢第二十五頁(yè)，共72頁(yè)。

(3)ES細(xì)胞高度分化潛能：ES細(xì)胞的全能性是區(qū)別于成纖維細(xì)胞等體細(xì)胞的特點(diǎn)。ES細(xì)胞體外生長(zhǎng)時(shí)應(yīng)該培養(yǎng)在飼養(yǎng)層細(xì)胞上才能維持其未分化狀態(tài)，脫離飼養(yǎng)層就會(huì)自發(fā)地進(jìn)行分化。第二十六頁(yè)，共72頁(yè)。增殖速度：18－24h分裂增殖一次ES必須在含有白血病抑制因子（LIF）的培養(yǎng)基及成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)層(提供干細(xì)胞生長(zhǎng)不可缺少的成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子FGF)條件下才能保持繁殖而不分化。

ES體外培養(yǎng)要解決的關(guān)鍵問(wèn)題是維持細(xì)胞的分裂增殖而抑止其分化。具有分化形成外、中、內(nèi)三個(gè)胚層的潛能。第二十七頁(yè)，共72頁(yè)。（三）人胚胎干細(xì)胞的來(lái)源與鑒定

HumanEmbryonicStemCell

胚胎干細(xì)胞的來(lái)源為早期胚胎內(nèi)細(xì)胞群或原始生殖細(xì)胞。哺乳動(dòng)物早期胚胎的發(fā)育屬于調(diào)整型，每個(gè)胚胎細(xì)胞都具有全能性。第二十八頁(yè)，共72頁(yè)。a.取自體外受精胚胎囊胚期內(nèi)細(xì)胞群。

Thomson法1.來(lái)源

第二十九頁(yè)，共72頁(yè)。b.取自終止妊娠的胎兒的性器官組織。

Gearhart法第三十頁(yè)，共72頁(yè)。c.通過(guò)體細(xì)胞核轉(zhuǎn)移技術(shù)（克隆技術(shù)）獲得第三十一頁(yè)，共72頁(yè)。2.克隆技術(shù)克隆是英文clone的音譯，簡(jiǎn)單講就是一種人工誘導(dǎo)的無(wú)性繁殖方式。但克隆與無(wú)性繁殖是不同的。無(wú)性繁殖是指不經(jīng)過(guò)雌雄兩性生殖細(xì)胞的結(jié)合、只由一個(gè)生物體產(chǎn)生后代的生殖方式，常見(jiàn)的有孢子生殖、出芽生殖和分裂生殖。由植物的根、莖、葉等經(jīng)過(guò)壓條或嫁接等方式產(chǎn)生新個(gè)體也叫無(wú)性繁殖。綿羊、猴子和牛等動(dòng)物沒(méi)有人工操作是不能進(jìn)行無(wú)性繁殖的?？茖W(xué)家把人工遺傳操作動(dòng)物繁殖的過(guò)程叫克隆，這門(mén)生物技術(shù)叫克隆技術(shù)。第三十二頁(yè)，共72頁(yè)。先前一直認(rèn)為，高等動(dòng)物的細(xì)胞分化是一個(gè)不可逆的過(guò)程，因此無(wú)法利用已分化的動(dòng)物細(xì)胞進(jìn)行克隆的。英國(guó)劍橋大學(xué)的約翰?戈登教授首先通過(guò)實(shí)驗(yàn)研究從理論上證明了動(dòng)物細(xì)胞重新編程是完全有可能的，1962年，他通過(guò)實(shí)驗(yàn)把青蛙腸上皮的細(xì)胞的細(xì)胞核移植進(jìn)入去掉核的卵母細(xì)胞質(zhì)中，并培育出成體青蛙。這一實(shí)驗(yàn)首次證實(shí)分化了的細(xì)胞基因組是可以逆轉(zhuǎn)變化的，具有劃時(shí)代的意義，并且為動(dòng)物克隆實(shí)驗(yàn)奠定了基礎(chǔ)，大名鼎鼎的克隆羊多利就是依照戈登所創(chuàng)造的方法被克隆出來(lái)的。第三十三頁(yè)，共72頁(yè)?？寺⊙駾olly的誕生1996年7月5日，位于蘇格蘭愛(ài)丁堡市郊的羅斯林研究所里誕生了一頭大個(gè)頭兒羊羔，實(shí)驗(yàn)室編號(hào)為6LL3，克隆羊項(xiàng)目小組主管伊恩·威爾默特以著名鄉(xiāng)村歌手多利·帕頓的名字命名這頭羊。多利于1997年首次公開(kāi)亮相，震動(dòng)整個(gè)世界，美國(guó)《科學(xué)》雜志把多利的誕生評(píng)為當(dāng)年世界十大科技進(jìn)步的第一項(xiàng)。第三十四頁(yè)，共72頁(yè)。第三十五頁(yè)，共72頁(yè)。第三十六頁(yè)，共72頁(yè)。哺乳動(dòng)物克隆技術(shù)的發(fā)展克隆羊：1996年7月，蘇格蘭克隆鼠：1997年10月，日、美、英克隆牛：1998年7月，日本克隆貓：2002年2月，美國(guó)克隆狗：2005年4月，韓國(guó)，黃禹錫克隆恒河猴：2007年11月，美國(guó)

第三十七頁(yè)，共72頁(yè)。轟動(dòng)世界的黃禹錫造假事件2004年2月黃禹錫在《科學(xué)》雜志上發(fā)表論文，宣布在世界上率先用卵子成功培育出人類(lèi)胚胎干細(xì)胞；2005年5月，他又在《科學(xué)》雜志上發(fā)表論文，宣布攻克了利用患者體細(xì)胞克隆胚胎干細(xì)胞的科學(xué)難題，其研究成果一時(shí)轟動(dòng)全球。2005年4月黃禹錫在《自然》雜志上發(fā)表論文，成功實(shí)現(xiàn)了狗的克隆?！八辜{皮”正是世界上第一條克隆狗。

第三十八頁(yè)，共72頁(yè)。2006年1月首爾大學(xué)調(diào)查委員會(huì)公布了造假事件調(diào)查結(jié)果，稱(chēng)發(fā)表在science上的兩篇論文都屬于造假?？寺」返哪瞧撐谋蛔C明是可信的。首爾大學(xué)隨后宣布解除黃禹錫的教授職務(wù)，韓國(guó)政府也取消了授予黃禹錫的“最高科學(xué)家”稱(chēng)號(hào)。第三十九頁(yè)，共72頁(yè)。黃禹錫東山再起2010年10月17日，黃禹錫及其團(tuán)隊(duì)宣布利用狗的卵子，成功異種克隆了８只郊狼。2012年3月13日，黃禹錫與俄羅斯研究人員13日簽署合作協(xié)議，打算利用克隆技術(shù)復(fù)活大約1萬(wàn)年前滅絕的史前生物猛犸象。第四十頁(yè)，共72頁(yè)?？寺∪?？第四十一頁(yè)，共72頁(yè)。a

胚胎干細(xì)胞具有正常穩(wěn)定的二倍體核型和帶型。b胚胎干細(xì)胞具有較高的端粒酶活性及堿性磷酸酶的表達(dá)。

人胚胎干細(xì)胞系端粒酶活性都很高，說(shuō)明其可在體外未分化狀態(tài)進(jìn)行長(zhǎng)期培養(yǎng)。3.胚胎干細(xì)胞的鑒定第四十二頁(yè)，共72頁(yè)。c.人胚胎干細(xì)胞特異表面抗原的表達(dá)

胚胎階段特異性抗原:SSEA-1SSEA-3SSEA-4

Thmoson分離的hES陰性弱陽(yáng)性強(qiáng)陽(yáng)性Gearhart分離的hES陽(yáng)性弱陽(yáng)性陽(yáng)性小鼠ES陽(yáng)性陰性陰性鼠和人胚胎干細(xì)胞表達(dá)的表面抗原有種屬差異。Gearhart等認(rèn)為SSEA-1陽(yáng)性可能是源于原始生殖細(xì)胞的多能干細(xì)胞分化的標(biāo)志.細(xì)胞膜表面有特殊的標(biāo)記：SSEA-3,SSEA-4,TRA-1-60,TRA-1-81第四十三頁(yè)，共72頁(yè)。d.具有轉(zhuǎn)錄因子Oct-4的表達(dá)

Oct-4只限定在多潛能細(xì)胞中表達(dá)。人和小鼠的胚胎干細(xì)胞都表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子Oct-4，當(dāng)胚胎干細(xì)胞分化時(shí)，其表達(dá)能力大大降低。Oct-4可能是哺乳動(dòng)物不同發(fā)育階段多潛能細(xì)胞所特有的少數(shù)特異的調(diào)控分子之一。第四十四頁(yè)，共72頁(yè)。

e.不被Hoechst33342和Rhodamine123染色f.能分化成三個(gè)胚層的細(xì)胞，將胚胎干細(xì)胞植入免疫缺陷小鼠皮下可產(chǎn)生畸胎瘤g.可誘導(dǎo)分化為各種成體干細(xì)胞第四十五頁(yè)，共72頁(yè)。胚胎干細(xì)胞的誘導(dǎo)分化：胎牛血清，骨髓基質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)胚胎干細(xì)胞－－－－－－－－－－－－－－－造血細(xì)胞 RA胚胎干細(xì)胞－－－－－－－－－－－－－－－神經(jīng)細(xì)胞DMSO胚胎干細(xì)胞－－－－－－－－－－－－－－－肌肉細(xì)胞TGF-B1,VEGF,bFGF胚胎干細(xì)胞－－－－－－－－－－－－－－血管和內(nèi)皮細(xì)胞RA+胰島素+T3胚胎干細(xì)胞－－－－－－－－－－－－－－－脂肪細(xì)胞BMP-2,BMP-4胚胎干細(xì)胞－－－－－－－－－－－－－－－軟骨細(xì)胞地塞米松，磷酸甘油胚胎干細(xì)胞－－－－－－－－－－－－－－－骨細(xì)胞基因轉(zhuǎn)染胚胎干細(xì)胞－－－－－－－－－－－－－－胰島素分泌細(xì)胞第四十六頁(yè)，共72頁(yè)。（二）成體干細(xì)胞

成體干細(xì)胞是成體組織內(nèi)具有自我更新及分化一種或一種以上子細(xì)胞的未成熟細(xì)胞。

在成體組織或器官中，許多細(xì)胞自我更新及分化產(chǎn)生不同組織細(xì)胞的能力，如血液和皮膚細(xì)胞。第四十七頁(yè)，共72頁(yè)?？茖W(xué)家鑒定或分離出多種成體組織的干細(xì)胞，造血干細(xì)胞、神經(jīng)干細(xì)胞、皮膚干細(xì)胞等等。由于分離神經(jīng)干細(xì)胞所需的胎兒腦組織較難取材，加之胚胎細(xì)胞研究的爭(zhēng)議尚未平息，神經(jīng)干細(xì)胞的研究仍處于初級(jí)階段。隨著干細(xì)胞研究領(lǐng)域向深度和廣度不斷擴(kuò)展，人們對(duì)干細(xì)胞的了解也將更加全面。

第四十八頁(yè)，共72頁(yè)。實(shí)際上，克隆羊Dolly的誕生就已經(jīng)證明，通過(guò)體細(xì)胞核移植實(shí)驗(yàn)實(shí)現(xiàn)哺乳動(dòng)物體細(xì)胞的重編程是可能的，將已分化細(xì)胞的細(xì)胞核植入卵細(xì)胞內(nèi)可以使已分化細(xì)胞基因組中處于沉默狀態(tài)的基因再次被激活，形成多能干細(xì)胞，最終發(fā)育形成一個(gè)新的完整的生命體。重編程的體細(xì)胞幾乎能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)胚胎干細(xì)胞的替代。但是，體細(xì)胞核移植試驗(yàn)具有很大的局限性：1.克隆的效率極低2.產(chǎn)生的許多后代在各個(gè)階段都體現(xiàn)出嚴(yán)重的發(fā)育異常3.由于需要卵母細(xì)胞，核移植實(shí)驗(yàn)在人類(lèi)中的應(yīng)用受到強(qiáng)烈的倫理學(xué)質(zhì)疑。

第四十九頁(yè)，共72頁(yè)。有沒(méi)有相對(duì)簡(jiǎn)單，又可擺脫材料來(lái)源和倫理學(xué)諸多限制，重編程的效率和程度都十分可觀的新方法呢？50第五十頁(yè)，共72頁(yè)。第二節(jié)iPS技術(shù)概念：iPS，誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞（inducedpluripotentstemcells,iPScells）iPS技術(shù)，即誘導(dǎo)多能干細(xì)胞技術(shù)，也稱(chēng)細(xì)胞重新編程技術(shù)，是在特定的條件下將成體成熟、分化的體細(xì)胞逆轉(zhuǎn)恢復(fù)到全能分化的狀態(tài)，成為一類(lèi)類(lèi)似胚胎干細(xì)胞（多能干細(xì)胞）的新興技術(shù)。2009年，iPS技術(shù)榮膺《自然-方法》年度生命科學(xué)技術(shù)。

第五十一頁(yè)，共72頁(yè)。iPS技術(shù)的誕生

2006年8月，日本京都大學(xué)的山中伸彌（ShinyaYamanaka)教授領(lǐng)導(dǎo)的研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)，只需要將四個(gè)基因(Oct3/4,Sox2,c-myc和Klf4)送入已分化完全的小鼠纖維母細(xì)胞，即可以把纖維母細(xì)胞重新編排變成全能性的類(lèi)胚胎干細(xì)胞。他們將這種”返老還童”的重新編排細(xì)胞稱(chēng)之為”誘導(dǎo)式多能性干細(xì)胞”，即iPS細(xì)胞。山中伸彌教授

ShinyaYamanakahttp://qnet.nishinippon.co.jp/InductionofPluripotentStemCellsfromMouseEmbryonicandAdult

FibroblastCulturesbyDefinedFactors.Yamanaka,S.,Takahashi,K.Cell126,663–676,August25,2006第五十二頁(yè)，共72頁(yè)。2007年11月20日，美國(guó)的Thomson實(shí)驗(yàn)室在science上發(fā)表文章，第一次成功地由人類(lèi)的體細(xì)胞誘導(dǎo)為IPS細(xì)胞。他們從14個(gè)保持人類(lèi)ES細(xì)胞多能性狀態(tài)的基因篩選出四個(gè)基因OCT3/4,SOX2,NANOG,andLIN28，將之用慢病毒載體轉(zhuǎn)入人類(lèi)體細(xì)胞中，得到了在增殖能力、，形態(tài)學(xué)，核型，端粒酶活性，細(xì)胞表面標(biāo)志，ES特征基因表達(dá)，畸胎瘤擬胚體形成能力上與人類(lèi)ES相似的IPS細(xì)胞。InducedPluripotentStemCellLinesDerivedfromHumanSomaticCells.JUNYINGYU,MaximA.Vodyanik,JamesA.Thomson,SCIENCE21December2007:Vol.318.no.5858,pp.1917-1920第五十三頁(yè)，共72頁(yè)。2007年11月20日，日本Yamanaka實(shí)驗(yàn)室在CELL上發(fā)表了用人類(lèi)的成纖維細(xì)胞（皮膚成纖維細(xì)胞，成纖維細(xì)胞樣滑膜細(xì)胞，BJ細(xì)胞），通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄病毒載體導(dǎo)入Oct3/4,Sox2,Klf4,c-Myc四個(gè)基因，也成功得到了人類(lèi)的IPS細(xì)胞，并證明它們?cè)谛螒B(tài)學(xué)，核型，端粒酶活性，細(xì)胞表面標(biāo)志，ES特征基因表達(dá)，畸胎瘤擬胚體形成方面與ES細(xì)胞相似。同時(shí)，他們還成功的將這些IPS細(xì)胞誘導(dǎo)成神經(jīng)細(xì)胞，心肌細(xì)胞。在這次實(shí)驗(yàn)中，他們通過(guò)對(duì)MEF引入了小鼠的你轉(zhuǎn)錄位點(diǎn)，提高了轉(zhuǎn)到率。

InductionofPluripotentStemCellsfromAdultHumanFibroblastsbyDefinedFactorsYamanaka,S.,Takahashi,K.Cell131,861–872,November30,2007iPS被《自然》和《科學(xué)》雜志評(píng)為2007年第一和第二大科學(xué)進(jìn)展。

第五十四頁(yè)，共72頁(yè)。誘導(dǎo)iPS細(xì)胞四個(gè)基因的選擇體細(xì)胞可藉由將核送入卵中或是和胚胎干細(xì)胞核融合而被重建(Cowanetal.,2005;Tadaetal.,2001)必定有某些基因?qū)⒓?xì)胞維持在多能性的狀態(tài)胚胎細(xì)胞中：Oct3/4、Sox2、Nanog(Nicholsetal.,1998;Niwaetal.,2000;Avilionetal.,2003;Chambersetal.,2003;Mitsuietal.,2003)癌細(xì)胞中：Stat3、E-Ras、c-myc、Klf4、b-catenin

(Matsudaetal.,1999;Niwaetal.,1998;Takahashietal.,2003;Cartwrightetal.,2005;Lietal.,2005;Kielmanetal.,2002;Satoetal.,2004)4/24：Oct3/4、Sox2、c-Myc、Klf4iPScell：inducedpluripotentstemcell第五十五頁(yè)，共72頁(yè)。材料：HDF-Slc7a1高加索36歲女性臉部皮膚0天：轉(zhuǎn)入基因Oct3/4、Sox2、c-Myc、Klf46天：放置于mytomycinC-treatedSNLfeedercell中(5×104~5×105)7天：置換成干細(xì)胞專(zhuān)用培養(yǎng)液實(shí)驗(yàn)材料及誘導(dǎo)方案0天轉(zhuǎn)染10%FBSESmedium+bFGF6天30天培養(yǎng)于feeder上收取colony第五十六頁(yè)，共72頁(yè)。B、HDF形態(tài)D、25天后形成顆粒狀群落(與hES形態(tài)相似)C、14天后形成之顆粒狀群落重建人類(lèi)體細(xì)胞-產(chǎn)生iPS第五十七頁(yè)，共72頁(yè)。從顆粒狀群落中挑出類(lèi)似hES細(xì)胞的群落：7/122，8/84，8/171，5/73，6/122，11/213發(fā)育成緊密堆疊且扁平狀的群落類(lèi)似hES：細(xì)胞核大、細(xì)胞質(zhì)少會(huì)自發(fā)性分化需要feedercell才可生存圖E、培養(yǎng)出的iPS細(xì)胞型態(tài)圖F、放大后的iPS細(xì)胞圖G、iPS細(xì)胞群落中間自發(fā)性分化的細(xì)胞重建人類(lèi)體細(xì)胞-產(chǎn)生iPS第五十八頁(yè)，共72頁(yè)。iPS細(xì)胞檢測(cè)-hESmarker表現(xiàn)stage-specificembryonicantigen-1(SSEA-1)Sell-specificsurfaceantigens(Adewumietal.,2007)第五十九頁(yè)，共72頁(yè)。iPS細(xì)胞檢測(cè)-hESmarker表現(xiàn)RT-PCR：iPS表現(xiàn)hESmarkerES：胚胎干細(xì)胞NTRA-2：人類(lèi)胚胎瘤細(xì)胞HDF：人類(lèi)真皮纖維母細(xì)胞圖一、RT-PCR分析hESmarker基因表現(xiàn)結(jié)果第六十頁(yè)，共72頁(yè)。iPS細(xì)胞檢測(cè)-hESmarker表現(xiàn)Westernblotting：

OCT3/4、SOX2、NANOG、SALL4、E-CADHERIN、hTERT(Adewumietal.,2007)

蛋白質(zhì)表達(dá)量和hES細(xì)胞相似ES：胚胎干細(xì)胞NTRA-2：人類(lèi)胚胎瘤細(xì)胞HDF：人類(lèi)真皮纖維母細(xì)胞圖二、hESmarker的westernblot分析第六十一頁(yè)，共72頁(yè)。端粒酶活性測(cè)試胚胎干細(xì)胞會(huì)高度表達(dá)hTERT基因-：實(shí)驗(yàn)組+：加熱抑制端粒酶活性(陰性對(duì)照)IC：internalcontrol圖三、用TRAP法測(cè)試trlomerase活性第六十二頁(yè)，共72頁(yè)。iPS細(xì)胞培養(yǎng)為類(lèi)胚胎體將iPS細(xì)胞放入懸浮的培養(yǎng)液中生長(zhǎng)8天后形成球狀的類(lèi)胚胎體(embryoidbodies,EBs)將類(lèi)胚胎體置于覆蓋gelatin的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)8天iPScells附著于培養(yǎng)基上并分化成各種細(xì)胞形態(tài)第六十三頁(yè)，共72頁(yè)。類(lèi)胚胎體的分化可在invitro的狀態(tài)下將iPS細(xì)胞分化成三種胚層似神經(jīng)元細(xì)胞表皮細(xì)胞