重組體的篩選與鑒定

關(guān)于重組體的篩選與鑒定第一頁，共九十九頁，編輯于2023年，星期四第六章

重組體克隆的篩選和鑒定第二頁，共九十九頁，編輯于2023年，星期四轉(zhuǎn)化子和重組子轉(zhuǎn)化子：將導(dǎo)入外源DNA分子后能穩(wěn)定存在的受體細胞稱為轉(zhuǎn)化子重組子：含有重組DNA分子的轉(zhuǎn)化子成為重組子。如果重組子中含有外源目的基因則又稱為陽性克隆子或期望克隆子第三頁，共九十九頁，編輯于2023年，星期四選擇(selection)篩選(screening)選擇：通過外來附加壓力（或因素）的辨別作用，呈現(xiàn)具有重組DNA分子的特定克隆類型的一種方法。篩選：通過特定的方法，例如核酸雜交以及免疫測定，從被分析的細胞群體或基因文庫中，鑒定出真正是所需重組DNA分子的特定克隆過程由于被篩選的大量的菌落和噬菌斑當(dāng)中，僅有很少的比例含有期望的重組DNA分子，因此需要使用高度敏感和高度特異的篩選方法。第四頁，共九十九頁，編輯于2023年，星期四

根據(jù)所使用克隆載體的特性不同，重組克隆的篩選方法也多種多樣。比如，用噬菌體DNA作為載體時就不需要篩選，所有正常的噬菌斑都是重組體；當(dāng)使用pUC系列載體時，白色菌落一般都是重組體；如果所用的質(zhì)粒并不具備明顯的鑒別特性，那么我們也可以利用DNA的酶切分析進行直接鑒定。比如，從平板上隨機挑選10個菌落，然后提取其中的質(zhì)粒DNA分子，并對其進行酶切分析，同樣可以準(zhǔn)確地選擇得到所要的重組克隆，而且同時可以鑒定外源片段插入的方向，選擇得到所要的理想克隆。有時，我們不僅想知道哪些是重組體克隆，而且想知道重組體克隆中哪些是含有某個基因的克?。ū热缭赾DNA文庫的篩選中，我們就需要選擇到含有目的基因克隆）。這時我們可以用比較復(fù)雜的核酸雜交或免疫化學(xué)的方法。第五頁，共九十九頁，編輯于2023年，星期四轉(zhuǎn)化率的影像因素1.載體DNA及DNA重組方面載體自身性質(zhì)，不同載體的轉(zhuǎn)化效率不同載體分子的空間構(gòu)象（超螺旋與線性）2.受體細胞受體細胞除了具備限制重組缺陷性狀外，還與所轉(zhuǎn)化載體DNA性質(zhì)相匹配3.轉(zhuǎn)化操作方面受體細胞的預(yù)處理感受態(tài)細胞的制備如：Ca2+誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)化細胞與菌齡、氯化鈣處理時間（12~24h）感受態(tài)的保存期、熱脈沖時間等4.轉(zhuǎn)化后重組子的整合與表達第六頁，共九十九頁，編輯于2023年，星期四遺傳學(xué)選擇法（geneticselection）：主要是根據(jù)受體細胞接受了重組DNA分子后所發(fā)生的遺傳表型變化直接選擇重組體的方法。抗藥性、顯色、營養(yǎng)缺陷等2.物理篩選方法：3.核酸雜交法4.表達產(chǎn)物分析法篩選的兩層含義：將攜帶有外源插入DNA片段的克隆挑選出來，將攜帶有外源插入片段的重組體挑選出來PCR方法建立以后，很快應(yīng)用于基因靶位操作中轉(zhuǎn)化子的篩選。通過在目的突變基因中引人特定的PCR引物順序，利用PCR方法直接檢測轉(zhuǎn)化細胞組份或細胞克隆的DNA結(jié)構(gòu)，以特定擴增DNA片段的有無，鑒別同源重組細胞克隆。Kim和Smithes首先應(yīng)用PCR方法成功篩選出ES細胞Hprt基因的定點突變克隆〔‘〕。隨后，Joyner等應(yīng)用同樣的方法，對小鼠ES細胞的en-2基因進行了定點突變〔’〕；Zimmer等用PCR方法篩選出同源異型盒基因hoxl.l定點突變的ES細胞克隆，并得到含該突變的嵌合體小鼠第七頁，共九十九頁，編輯于2023年，星期四一、抗藥性標(biāo)記及其插入失活選擇法pBR322質(zhì)粒上有兩個抗菌素抗性基因:Tetr和Ampr。

Tetr上有插入位點BamHI和SalI;Ampr上有插入位點PstI。第一節(jié)

載體表型選擇法1.原理：第八頁，共九十九頁，編輯于2023年，星期四pBR322第九頁，共九十九頁，編輯于2023年，星期四（1）四環(huán)素：（2）氨芐青霉素抗性基因：2.pBR322抗菌素標(biāo)記選擇含bla基因的菌體產(chǎn)生-內(nèi)酰胺酶，使氨芐青霉素轉(zhuǎn)變?yōu)榍嗝雇?，使?青霉素指示液（I2-KI-Aampicillin）（藍灰色）褪色。抑制細菌生長，但不殺死細菌。殺死生長的細菌，但不殺死停止生長的細菌。（3）環(huán)絲氨酸：第十頁，共九十九頁，編輯于2023年，星期四3.選擇過程：如果在Tetr上插入外源DNA，導(dǎo)致四環(huán)素抗性基因失活，可用四環(huán)素加環(huán)絲氨酸平板培養(yǎng)基選擇重組克隆。Tetr失活的菌生長被四環(huán)素抑制，不被環(huán)絲氨酸殺死，保留下來；Tetr不失活的菌抗四環(huán)素，能分裂生長，反而被環(huán)絲氨酸殺死。（1）四環(huán)素抗性插入失活第十一頁，共九十九頁，編輯于2023年，星期四無環(huán)絲氨酸培養(yǎng)基第十二頁，共九十九頁，編輯于2023年，星期四（2）氨芐青霉素抗性插入失活選擇過程如果Ampr上插入外源DNA，導(dǎo)致氨芐青霉素抗性基因失活，可用碘-青霉素指示液選擇。第十三頁，共九十九頁，編輯于2023年，星期四二、-半乳糖苷酶顯色反應(yīng)選擇法-半乳糖苷酶乳糖半乳糖葡萄糖Xgal半乳糖5-溴-4-氯靛藍++深藍色1.原理：載體上有一段-半乳糖苷酶基因（LacZ）的片段（氨基端），其上有外源DNA的插入位點。受體菌基因組中有突變的-半乳糖苷酶基因（

片段缺失）?？梢员籌PTG誘導(dǎo)表達。載體和受體菌基因組可以互補形成完整有功能的-半乳糖苷酶。第十四頁，共九十九頁，編輯于2023年，星期四假陽性：如果插入的外源DNA正好是3的倍數(shù)或沒有終止密碼；（不破壞肽）。2.選擇過程第十五頁，共九十九頁，編輯于2023年，星期四-半乳糖苷酶使Xgal分解成蘭色產(chǎn)物。第十六頁，共九十九頁，編輯于2023年，星期四利用插入的外源基因的表達產(chǎn)物特性進行直接選擇。（只在特定條件下）。轉(zhuǎn)化進來的外源基因產(chǎn)物能夠彌補受體菌株的突變型缺陷。一、原理：第二節(jié)

根據(jù)插入基因的表型選擇1.彌補缺陷his-his+受體菌：外源基因：在不含組氨酸的培養(yǎng)基中生長第十七頁，共九十九頁，編輯于2023年，星期四小鼠的二氫葉酸還原酶（DHFR）對三甲氧芐二氨嘧啶(抑制大腸桿菌生長)有抗性。DHFR載體連接轉(zhuǎn)化受體菌三甲氧芐二氨嘧啶培養(yǎng)基平板含DHFR的克隆才能生長例：使被轉(zhuǎn)化的受體菌表現(xiàn)出外源基因的表型。2.增加新性狀降解第十八頁，共九十九頁，編輯于2023年，星期四利用有插入片段的重組載體的分子量比野生型載體分子量大。一、直接電泳檢測法從轉(zhuǎn)化后的菌體克隆中分離質(zhì)粒，電泳、比較其分子量。第三節(jié)

DNA電泳檢測法

分子量Marker載體重組克隆第十九頁，共九十九頁，編輯于2023年，星期四二、酶切電泳篩選法1.原理：根據(jù)已知的外源DNA序列的限制性酶切圖譜，選擇一兩種內(nèi)切酶切割質(zhì)粒，電泳后比較電泳結(jié)果（DNA帶數(shù)和長度）?；蛴煤线m的內(nèi)切酶切下插入片斷，再用其它酶切這個片斷，電泳后比較結(jié)果是否符合預(yù)計的結(jié)果。第二十頁，共九十九頁，編輯于2023年，星期四酶切前酶切后插入片斷載體第二十一頁，共九十九頁，編輯于2023年，星期四ABA或B第二十二頁，共九十九頁，編輯于2023年，星期四第二十三頁，共九十九頁，編輯于2023年，星期四不同克隆的酶切結(jié)果第二十四頁，共九十九頁，編輯于2023年，星期四篩選過程第二十五頁，共九十九頁，編輯于2023年，星期四用EcoRI和HindⅢ分別切割同一來源的染色體DNA,并進行克隆,在前者的克隆中篩選到A基因,但在后者的克隆中未篩選到A基因,請說明原因.

第二十六頁，共九十九頁，編輯于2023年，星期四三、PCR擴增檢測法1.原理PCR能在模板序列上擴增出預(yù)期DNA片斷。2.過程（1）從重組克隆中提取質(zhì)粒（或DNA）。（2）用外源DNA插入片斷引物作PCR。（3）電泳PCR產(chǎn)物。（4）檢查是否有PCR產(chǎn)物。（5）PCR產(chǎn)物的長度是否與外源基因一致。第二十七頁，共九十九頁，編輯于2023年，星期四1.核酸雜交第四節(jié)

核酸雜交檢測法

一、原理：重組克隆與探針雜交。3.識別標(biāo)記32P或

125I。（1）放射性同位素2.檢測用的探針與外源DNA插入片斷互補的序列。（2）非放射性標(biāo)記熒光素第二十八頁，共九十九頁，編輯于2023年，星期四二、核酸雜交檢測方法用DNA（或RNA）探針檢測DNA樣品。1.Southernblotting從宿主細胞中提取DNA（或質(zhì)粒載體），再用探針雜交。只有帶有插入片斷的重組載體才能與探針雜交，在底片上曝光顯示。第二十九頁，共九十九頁，編輯于2023年，星期四酶切前酶切后插入片斷載體第三十頁，共九十九頁，編輯于2023年，星期四Southernblot篩選結(jié)果第三十一頁，共九十九頁，編輯于2023年，星期四（1）原位雜交篩選特點：對應(yīng)的菌斑或噬菌斑位置不變，可以直接找出陽性菌落。第三十二頁，共九十九頁，編輯于2023年，星期四第三十三頁，共九十九頁，編輯于2023年，星期四（2）R-環(huán)檢測法DNA-RNA雜交。1）原理：2）選擇過程在70%甲酰胺中，把DNA雙鏈變性，復(fù)性的時候，DNA-RNA雜交分子比DNA-DNA雙鏈更穩(wěn)定。電鏡下可見一種R-環(huán)形結(jié)構(gòu)。用外源基因的mRNA與重組載體雜交。第三十四頁，共九十九頁，編輯于2023年，星期四缺點：需要電鏡！第三十五頁，共九十九頁，編輯于2023年，星期四2.Northernblotting用DNA（或RNA）探針檢測RNA樣品。主要檢測插入片斷是否被轉(zhuǎn)錄。從宿主細胞中提取RNA，再用探針雜交。第三十六頁，共九十九頁，編輯于2023年，星期四第五節(jié)

免疫化學(xué)檢測法

在某些情況西下,如待測的重組克隆子既無任何可供選擇的基因表型特征,又無理想的核酸雜交探針時,可以考慮采用免疫化學(xué)檢測法.抗體檢測法免疫沉淀檢測法第三十七頁，共九十九頁，編輯于2023年，星期四利用抗體作為“探針”來檢測轉(zhuǎn)入受體菌并且表達出相應(yīng)的蛋白質(zhì)的外源基因。根據(jù)第一抗體（一抗）和第二抗體（二抗）的性質(zhì)可分為幾種作用方式：一、放射性抗體檢測法1.抗體與產(chǎn)物的結(jié)合方式對表達產(chǎn)物的檢測。蛋白——蛋白“雜交”

第三十八頁，共九十九頁，編輯于2023年，星期四待測基因產(chǎn)物蛋白一抗二抗125I標(biāo)記的二抗結(jié)合蛋白固相支持濾膜待測基因產(chǎn)物蛋白一抗125I標(biāo)記的二抗固相支持濾膜待測基因產(chǎn)物蛋白一抗固相支持濾膜固相支持濾膜待測基因產(chǎn)物蛋白一抗二抗125I標(biāo)記的二抗結(jié)合蛋白125I標(biāo)記的二抗第三十九頁，共九十九頁，編輯于2023年，星期四2.放射性抗體檢測法過程第四十頁，共九十九頁，編輯于2023年，星期四3.Broome-Gilbert雙位點檢測法質(zhì)?；駻插入基因B表達質(zhì)粒蛋白A外源蛋白B融合蛋白檢測融合蛋白。既檢測外源基因產(chǎn)物又檢測載體基因產(chǎn)物。第四十一頁，共九十九頁，編輯于2023年，星期四固相支持濾膜抗A抗體125I標(biāo)記的抗B抗體質(zhì)粒蛋白A外源蛋白B質(zhì)粒蛋白A外源蛋白B固相支持濾膜抗A抗體發(fā)光，底片曝光第四十二頁，共九十九頁，編輯于2023年，星期四二、免疫沉淀檢測法1.原理檢測目的基因相對應(yīng)的標(biāo)記抗體。免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）是以抗體和抗原之間的專一性作用為基礎(chǔ)的用于研究蛋白質(zhì)相互作用的經(jīng)典方法。是確定兩種蛋白質(zhì)在完整細胞內(nèi)生理性相互作用的有效方法。其原理是：當(dāng)細胞在非變性條件下被裂解時，完整細胞內(nèi)存在的許多蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)間的相互作用被保留了下來。如果用蛋白質(zhì)X的抗體免疫沉淀X，那么與X在體內(nèi)結(jié)合的蛋白質(zhì)Y也能沉淀下來。這種方法常用于測定兩種目標(biāo)蛋白質(zhì)是否在體內(nèi)結(jié)合；也可用于確定一種特定蛋白質(zhì)的新的作用搭檔。

第四十三頁，共九十九頁，編輯于2023年，星期四2.優(yōu)缺點其優(yōu)點為：（1）相互作用的蛋白質(zhì)都是經(jīng)翻譯后修飾的，處于天然狀態(tài)；（2）蛋白的相互作用是在自然狀態(tài)下進行的，可以避免人為的影響；（3）可以分離得到天然狀態(tài)的相互作用蛋白復(fù)合物。缺點為：（1）可能檢測不到低親和力和瞬間的蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)相互作用；（2）兩種蛋白質(zhì)的結(jié)合可能不是直接結(jié)合，而可能有第三者在中間起橋梁作用；（3）必須在實驗前預(yù)測目的蛋白是什么，以選擇最后檢測的抗體，所以，若預(yù)測不正確，實驗就得不到結(jié)果，方法本身具有冒險性。

第四十四頁，共九十九頁，編輯于2023年，星期四對于不能被分泌到菌體外的蛋白質(zhì)可先進行原位溶菌處理（溶菌酶、原噬菌體誘發(fā)）。

靈敏度不高,實用性差第四十五頁，共九十九頁，編輯于2023年，星期四三、酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）Enzyme-linkedimmunosorbantassay1.原理：一抗（primaryantibody）:

與目標(biāo)分子的特異結(jié)合。二抗（secondaryantibody）：

與一抗的特異性結(jié)合。酶連（enzyme-linke）：

二抗上攜帶一種酶能催化一種反應(yīng)將無色的底物轉(zhuǎn)變?yōu)橛猩奈镔|(zhì)（或發(fā)光），再通過比色測定有色物質(zhì)的含量（或光強度），從而推測目標(biāo)分子的含量。第四十六頁，共九十九頁，編輯于2023年，星期四待測基因產(chǎn)物蛋白一抗二抗酶

待測基因產(chǎn)物蛋白一抗二抗無色的底物有色的產(chǎn)物比色觀察酶

19第四十七頁，共九十九頁，編輯于2023年，星期四2.ELISA檢測的一般步驟（1）固定樣品將待測樣品加入96孔微量滴定板（microtiterplate）的孔中，干燥后就被固定在孔底?？椎椎谒氖隧?，共九十九頁，編輯于2023年，星期四加入一抗，反應(yīng)后沖洗掉未結(jié)合的抗體。（2）一抗結(jié)合一抗第四十九頁，共九十九頁，編輯于2023年，星期四加入二抗，與一抗結(jié)合后再將未結(jié)合的二抗沖洗掉。二抗只識別一抗。二抗上聯(lián)著一種酶（堿性磷酸酶、過氧化物酶、脲酶等）。（3）二抗結(jié)合二抗第五十頁，共九十九頁，編輯于2023年，星期四加入無色的底物，被二抗上所帶的酶催化反應(yīng)轉(zhuǎn)變成有色物質(zhì)（或發(fā)光）。（4）顯色反應(yīng)第五十一頁，共九十九頁，編輯于2023年，星期四第五十二頁，共九十九頁，編輯于2023年，星期四在特殊的分光光度儀（酶標(biāo)儀）上比色，打印出結(jié)果。（5）比色第五十三頁，共九十九頁，編輯于2023年，星期四3.ELISA的局限性有效，但準(zhǔn)確性稍差（主要取決于一抗的特異性）。必須與其他方法一起綜合考慮。最好用單克隆抗體（monoclonalantibody）第五十四頁，共九十九頁，編輯于2023年，星期四臨床檢驗常用的單抗第五十五頁，共九十九頁，編輯于2023年，星期四四、免疫印跡（westernblotting）法1.原理：在蛋白質(zhì)凝膠電泳以后，用轉(zhuǎn)膜和免疫的方法檢測膠上的蛋白質(zhì)泳帶。（1）SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳

是蛋白質(zhì)的變性劑，使煮沸變性的蛋白質(zhì)維持線性狀態(tài)，并與蛋白質(zhì)結(jié)合，使蛋白質(zhì)帶上負(fù)電荷。①SDS:（SDS）：第五十六頁，共九十九頁，編輯于2023年，星期四②聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）：（Polyacrylamidegelelectrophoresis）在電場的作用下線性蛋白質(zhì)鏈在聚丙烯酰胺凝膠介質(zhì)中向正極移動，移動的速率主要取決于其分子量大?。ㄦ湹拈L短），從而把不同分子量的肽鏈分開。電泳buffer電泳buffer第五十七頁，共九十九頁，編輯于2023年，星期四點樣電泳方向第五十八頁，共九十九頁，編輯于2023年，星期四③蛋白質(zhì)電泳的分子量標(biāo)準(zhǔn)已知分子量的蛋白質(zhì)混合液，與待測樣品一起電泳，為樣品蛋白質(zhì)提供分子量估計。商品化供應(yīng)Da道爾頓(質(zhì)量單位,等于一氧原子質(zhì)量的十六分之一。一克約為6×1023道爾頓第五十九頁，共九十九頁，編輯于2023年，星期四DaltonSDSPAGE第六十頁，共九十九頁，編輯于2023年，星期四④凝膠中的蛋白質(zhì)染色：考馬斯亮藍：靈敏度底、只能檢出>0.3-1μg/帶，但可褪色回收。

硝酸銀：靈敏度高、可檢出2-5ng/帶。2）轉(zhuǎn)到膜上進行染色。1）直接染色第六十一頁，共九十九頁，編輯于2023年，星期四直接染色電泳結(jié)果第六十二頁，共九十九頁，編輯于2023年，星期四（2）Westernblotting電泳膠里的蛋白質(zhì)帶可以用電轉(zhuǎn)的方法，轉(zhuǎn)到膜上（硝酸纖維素膜、PVDF膜、中性尼龍膜等）。①Western（轉(zhuǎn)膜）膠里的蛋白質(zhì)帶在電場的作用下橫向轉(zhuǎn)移到正極一側(cè)的膜上。膜膠蛋白第六十三頁，共九十九頁，編輯于2023年，星期四Western裝置第六十四頁，共九十九頁，編輯于2023年，星期四②Blotting原理與ELISA相同。待測蛋白硝酸纖維素膜一抗二抗辣根過氧化物酶底物產(chǎn)物，并發(fā)出光PAGE膠待測蛋白底片曝光辣根過氧化物酶：HRPO第六十五頁，共九十九頁，編輯于2023年，星期四第六十六頁，共九十九頁，編輯于2023年，星期四1）先用一抗（待測蛋白的單克隆抗體）與

膜上的蛋白結(jié)合。2）洗去未結(jié)合的一抗。3）用二抗與一抗結(jié)合（二抗上帶有HRPO）。4）清洗掉未結(jié)合的二抗。5）用HRPO的底物浸泡膜。6）暗室里曝光，沖洗膠片。③Blotting過程ImmunoBlotting第六十七頁，共九十九頁，編輯于2023年，星期四④結(jié)果多克隆抗體Blotting的結(jié)果單抗blotting結(jié)果第六十八頁，共九十九頁，編輯于2023年，星期四轉(zhuǎn)譯篩選法有兩種:

雜交選擇轉(zhuǎn)譯（hybridselectedtranslation,HART)

雜交抑制轉(zhuǎn)譯(hybridarreatedtranslation,HRT)。

轉(zhuǎn)譯篩選法的突出優(yōu)點是將克隆的DNA同所編碼的蛋白質(zhì)產(chǎn)物之間的關(guān)系對應(yīng)起來。

第六節(jié)

轉(zhuǎn)譯篩選法

借助無細胞翻譯系統(tǒng)，通過表達或抑制所選擇的克隆載體上外源基因的轉(zhuǎn)錄，來篩選其產(chǎn)物是否符合預(yù)期。第六十九頁，共九十九頁，編輯于2023年，星期四一、無細胞翻譯系統(tǒng)無細胞系統(tǒng)cell-freesystem指保留蛋白質(zhì)生物合成能力的細胞抽取物。無細胞系統(tǒng)要包含以下成分：核糖體、各種tRNA、各種氨酰-tRNA合成酶、蛋白質(zhì)合成需要的起始因子和延伸因子以及終止釋放因子、GTP、ATP、20種基本的氨基酸。常見的無細胞翻譯系統(tǒng)有：大腸桿菌無細胞翻譯系統(tǒng)、兔網(wǎng)織紅細胞無細胞翻譯系統(tǒng)、麥胚無細胞翻譯系統(tǒng)和某些腫瘤細胞制備成的無細胞翻譯系統(tǒng)。適用于mRNA轉(zhuǎn)錄豐度高的外源基因。第七十頁，共九十九頁，編輯于2023年，星期四二、轉(zhuǎn)譯篩選mRNA無細胞翻譯系統(tǒng)35S標(biāo)記的甲硫氨酸翻譯35S標(biāo)記的肽鏈PAGE電泳放射自顯影比較放射性帶紋的位置載體+外源DNA轉(zhuǎn)錄與預(yù)期的產(chǎn)物分子量相符？第七十一頁，共九十九頁，編輯于2023年，星期四三、雜交抑制轉(zhuǎn)譯法mRNA一旦與DNA雜交成RNA-DNA雙鏈后就不能被核糖體翻譯出蛋白質(zhì)（轉(zhuǎn)譯被抑制）。單鏈mRNA核糖體小亞基核糖體大亞基能翻譯mRNADNA核糖體小亞基核糖體大亞基不能翻譯1.原理第七十二頁，共九十九頁，編輯于2023年，星期四2.過程第七十三頁，共九十九頁，編輯于2023年，星期四四、雜交釋放轉(zhuǎn)譯法1.原理：在高甲酰胺溶液中載體上克隆的cDNA與它的mRNA雜交吸附，然后洗脫，釋放出與它對應(yīng)的mRNA，進行體外轉(zhuǎn)錄。研究其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的性質(zhì)是否是預(yù)期的基因產(chǎn)物（如分子量、免疫源性等）。第七十四頁，共九十九頁，編輯于2023年，星期四2.過程硝酸纖維素濾膜載體和插入的cDNA總mRNAcDNA基因的mRNA雜交洗脫cDNA基因的mRNA體外翻譯cDNA編碼的蛋白電泳凝膠放射自顯影cDNA編碼的蛋白硝酸纖維素濾膜載體和插入的cDNA硝酸纖維素濾膜載體和插入的cDNA收集35S標(biāo)記的氨基酸第七十五頁，共九十九頁，編輯于2023年，星期四專門設(shè)計檢測能同DNA特異結(jié)合的蛋白質(zhì)因子。待測蛋白質(zhì)硝酸纖維素濾膜能與蛋白質(zhì)結(jié)合的DNA序列放射性標(biāo)記待測蛋白質(zhì)硝酸纖維素濾膜能與蛋白質(zhì)結(jié)合的DNA序列放射性標(biāo)記五、DNA-蛋白質(zhì)相互作用篩選法第七十六頁，共九十九頁，編輯于2023年，星期四一般克隆與篩選策略第七十七頁，共九十九頁，編輯于2023年，星期四第七節(jié)

幾種常用的真核生物重組基因選擇方法真核細胞核苷酸的合成需要四氫葉酸提供甲基。二氫葉酸四氫葉酸二氫葉酸還原酶（dihydrofolatereductase，DHFR）一、哺乳動物基因轉(zhuǎn)移的選擇標(biāo)記1.胸苷激酶（thymidinekinase,tk）（1）TK選擇原理①四氫葉酸的必要性DHFR第七十八頁，共九十九頁，編輯于2023年，星期四②氨甲喋啉（Methotrexate）的抑制作用氨甲喋啉（或氨基喋啉）是葉酸的類似物。能抑制二氫葉酸還原酶，從而阻斷dATP、dCTP和dTTP的合成：dUMP

dATP

TTP

dCTP

氨甲喋啉

抑制

抑制

第七十九頁，共九十九頁，編輯于2023年，星期四④胸苷酸激酶的補救作用TK+細胞能產(chǎn)生胸苷酸激酶，所以可以利用培養(yǎng)基中的胸苷（T）合成TTP，存活。Ttk③次黃嘌呤的補救作用細胞可以利用次黃嘌呤合成dATP和dCTP。dUMP

dATP

TTP

dCTP

次黃嘌呤

補救

氨甲喋啉

抑制

抑制

第八十頁，共九十九頁，編輯于2023年，星期四①HAT培養(yǎng)基：Tk-

細胞株。TK基因。②宿主細胞③載體標(biāo)記（2）TK選擇過程含次黃嘌呤、氨基喋啉和胸苷的培養(yǎng)基。(hypoxanthine，aminopterin，thiymidine）只有轉(zhuǎn)入TK基因的細胞才能生存。第八十一頁，共九十九頁，編輯于2023年，星期四20第八十二頁，共九十九頁，編輯于2023年，星期四真核細胞核苷酸的合成需要四氫葉酸提供甲基。2.二氫葉酸還原酶基因（DHFR）（1）

選擇原理①二氫葉酸還原酶的必要性dUMPdATPTTPdCTP四氫葉酸四氫葉酸第八十三頁，共九十九頁，編輯于2023年，星期四DHFR+細胞二氫葉酸四氫葉酸二氫葉酸還原酶二氫葉酸還原酶合成四氫葉酸DHFR+細胞能產(chǎn)生二氫葉酸還原酶，所以能合成四氫葉酸。能在無胸腺嘧啶和次黃嘌呤的培養(yǎng)基中生存不需要補救！第八十四頁，共九十九頁，編輯于2023年，星期四DHFR-

細胞DHFR-

細胞不能產(chǎn)生二氫葉酸還原酶，所以不能合成四氫葉酸。需要補救！不能在無胸腺嘧啶和次黃嘌呤的培養(yǎng)基中生存。第八十五頁，共九十九頁，編輯于2023年，星期四②胸腺嘧啶和次黃嘌呤補救dUMPdATPTTPdATP次黃嘌呤補救胸苷補救無四氫葉酸提供甲基，dNTP合成受阻時，胸腺嘧啶和次黃嘌呤分別補救:第八十六頁，共九十九頁，編輯于2023年，星期四DHFR-細胞株（不能在無核苷酸的培養(yǎng)基中生長）。①

宿主細胞（2）選擇過程透析除去血清中的內(nèi)源性核苷酸，以免補救。②

無核苷酸的培養(yǎng)基需要胸腺嘧啶和次黃嘌呤補救！第八十七頁，共九十九頁，編輯于2023年，星期四③

氨甲喋呤“加壓”添加少量氨甲喋啉抑制內(nèi)源性DHFR的補救作用，可提高選擇。DHFR+基因。④載體標(biāo)記只有轉(zhuǎn)入DHFR+基因的細胞才能生存。DHFR-DHFR-DHFR+DHFR+livedie無核苷酸的培養(yǎng)基第八十八頁，共九十九頁，編輯于2023年，星期四是細菌抗生素，干擾細菌的核糖體，使細菌的蛋白質(zhì)合成不能正常進行，但不影響真核生物。3.新霉素抗性基因（neor）（1）選擇原理①新霉素（neomycin）新霉素的類似物，是一種

氨基糖苷，對真核細胞和原核細胞都有毒性。②G418（geneticin）第八十九頁，共九十九頁，編輯于2023年，星期四③新霉素抗性基因--neor細菌的新霉素抗性基因（neor）編碼一種磷酸轉(zhuǎn)移酶（APH），能使G418失活。G418真核細胞死亡G418存活neor真核細胞第九十頁，共九十