紫外分光光度計(jì)培訓(xùn)教程

紫外分光光度計(jì)

制作日期：2007年7月10日1.紫外可見分光光度法定義：根據(jù)被測(cè)量物質(zhì)分子對(duì)紫外可見波段范圍（180nm-800nm）單色輻射的吸收或反射強(qiáng)度來(lái)進(jìn)行物質(zhì)定性、定量和結(jié)構(gòu)分析的一種方法光的選擇性吸收定義：各種物質(zhì)的內(nèi)部結(jié)構(gòu)決定他們對(duì)不同波長(zhǎng)的光線表現(xiàn)不同的吸收能力，叫做光的吸收選擇性。

各種物質(zhì)對(duì)光的選擇吸收反映它們分子內(nèi)部結(jié)構(gòu)的差異定量分析的基礎(chǔ)-比爾定律1假設(shè)照射到物質(zhì)上光是單色光（能量是固定的）2假設(shè)被測(cè)物質(zhì)是由獨(dú)立的彼此間無(wú)相互作用的吸收粒子組成如果這兩種假設(shè)成立，則物質(zhì)對(duì)光的吸收滿足以下定律：比爾定律

A=lg(Io/I)=kbc其中：

A---表示吸光度

Io—表示入射光強(qiáng)度

I-----表示透射光強(qiáng)度

k----表示吸收系數(shù)或消光系數(shù)，與入射光的波長(zhǎng)、溶液的濃度、溶劑的性質(zhì)及吸收物質(zhì)的性質(zhì)等多種因素有光

b----表示光程，單位cmc----表示溶液濃度，單位mol/L影響比爾定律的因素*1非單色光2雜散光3儀器噪聲4光譜帶寬5化學(xué)因素6其他因素，如溫度、光學(xué)傳感器的非線性等吸光度與透光率的關(guān)系A(chǔ)=-lgT

溶液的透光率越大，溶液對(duì)光的吸收越小，其吸光度越小溶液的透光率越小，溶液對(duì)光的吸收越大，其吸光度越大儀器的分類1單光速紫外可見分光光度計(jì)2準(zhǔn)雙光速紫外可見分光光度計(jì)3雙光速紫外可見分光光度計(jì)4雙波長(zhǎng)紫外可見分光光度計(jì)儀器的結(jié)構(gòu)1電光源系統(tǒng)1光源氘燈紫外波段使用鎢燈可見波段使用光源屬易耗品，能量低時(shí)應(yīng)及時(shí)更換2電源氘燈恒流電源鎢燈恒壓電源電源影響儀器的穩(wěn)定性，儀器開機(jī)應(yīng)先預(yù)熱0.5小時(shí)2外光路系統(tǒng)光源反射鏡透鏡作用：把光源發(fā)出的光集中并均勻的照射到單色器的入射狹縫上3分光系統(tǒng)入射狹縫：限制雜散光進(jìn)入準(zhǔn)直鏡：將入射的復(fù)合光轉(zhuǎn)化為平行光光柵：將復(fù)合光轉(zhuǎn)變?yōu)閱紊馕镧R：將射到物鏡上的平行光會(huì)聚到出射狹縫上出射狹縫：限制光譜帶寬作用：

1分光，將復(fù)合光變成單色光

2轉(zhuǎn)向，將準(zhǔn)直鏡射過(guò)來(lái)的平行光改變方向投射到物鏡上

3能量傳遞，把準(zhǔn)直鏡射過(guò)來(lái)的光能改變方向傳遞到物鏡上4光度室系統(tǒng)1光度室蓋：嚴(yán)防漏光，減少雜散光的影響2聚光透鏡：將單色光變成平行光射到比色皿上3比色皿：比色皿的大小、形狀，透光面的平行度、厚度、透光特性及光路長(zhǎng)度影響測(cè)量的準(zhǔn)確性4比色皿架最佳分析條件的選擇1溶劑的選擇

依據(jù)：溶劑的最大吸收截止波長(zhǎng)一定要小于樣品的測(cè)量波長(zhǎng)2分析波長(zhǎng)的選擇

依據(jù):根據(jù)試樣的吸收?qǐng)D譜，選擇最大吸收波長(zhǎng)作為測(cè)試波長(zhǎng)3吸光度范圍的選擇

大多數(shù)試樣濃度取10-100ug/ml，相當(dāng)于0.3-0.7Abs左右最佳

若樣品濃度過(guò)?。何舛戎堤?，信號(hào)過(guò)低，儀器噪聲干擾大若樣品濃度過(guò)濃：吸光度值太大，偏離比爾定律4光譜帶寬的選擇：

在一定的實(shí)驗(yàn)條件下，測(cè)試吸光度隨光譜帶寬的變化曲線，以獲得最大吸光度的光譜帶寬做為欲選擇的光譜帶寬光譜帶寬太大:靈敏度下降

光譜帶寬太小:入射光強(qiáng)度太弱，信號(hào)過(guò)低，儀器噪聲干擾大5比色皿對(duì)測(cè)量誤差的影響5.1透光面上的油膩、指紋、灰塵將影響比色皿的透光性能5.2使用時(shí)，通光方向要一致5.3清洗過(guò)程中，不能用硬紙纖維或手指摸、擦透光面，只能拿其兩個(gè)毛玻璃面5.4比色皿附著有粘附力強(qiáng)的試樣時(shí)，可用20w的超聲波清洗30min，但不能使用大功率的超聲波5.5比色皿不能放在烘箱、電爐、火焰上加熱干燥5.6分析測(cè)試時(shí)，注入比色皿的量不要超過(guò)比色皿高度的2/3，但也不能太少5.7在紫外光區(qū)，不能用玻璃比色皿進(jìn)行測(cè)量顯色反應(yīng)及其影響因素定義：對(duì)可見光不產(chǎn)生吸收或吸收不大的物質(zhì)不適合用紫外可見分光光度法測(cè)定，但可以通過(guò)適當(dāng)化學(xué)處理使該物質(zhì)變成對(duì)可見光有較強(qiáng)吸收的化合物，這中將無(wú)色物質(zhì)變成有色物質(zhì)的化學(xué)處理過(guò)程稱為顯色反應(yīng)常用的顯色劑為：鄰菲羅琳等鄰菲羅琳在PH2-9的溶液中生成成紅色配位絡(luò)合物，反應(yīng)靈敏度高，生成的絡(luò)合物對(duì)光的吸收明顯，可用來(lái)進(jìn)行微量鐵的測(cè)定影響顯色反映的因素1顯色劑的用量：保證測(cè)定的無(wú)色物質(zhì)全部轉(zhuǎn)化為有色物質(zhì)并適當(dāng)過(guò)量保證絡(luò)合物穩(wěn)定2溶液的PH值3溫度：大多數(shù)絡(luò)合反應(yīng)是在常溫進(jìn)行的，但有些反應(yīng)需在較高溫度下進(jìn)行4放置時(shí)間：包括反應(yīng)時(shí)間和穩(wěn)定時(shí)間分光光度法的定量分析1絕對(duì)法

c=A/kb2標(biāo)準(zhǔn)法：含量=（A樣/m標(biāo)）/（A標(biāo)/m樣）*100%3比吸收系數(shù)法

含量=A1%1cm樣/A1%1cm標(biāo)例題1用分光光度法測(cè)定水中的微量鐵，取3.0ug/ml的鐵標(biāo)準(zhǔn)溶液10.0ml，顯色后稀釋至50ml，測(cè)得吸光度值為0.460；另取水樣25.0ml，顯色后，也稀釋至50ml，測(cè)得吸光度為0.410，求水樣中鐵的含量（mg/L）2純利特靈的A1%1cm367nm=764，在相同測(cè)試條件下，測(cè)定濃度為0.001%的利特靈的吸光度值為0.739，求樣品中利特靈的含量硫酸中鐵離子的測(cè)定1原理試樣蒸干后，殘?jiān)芙庥邴}酸中，用鹽酸羥胺還原溶液中的鐵，在PH為2－9條件下，二價(jià)鐵離子與鄰菲啰啉反應(yīng)生成橙色絡(luò)合物，對(duì)此絡(luò)合物作吸光度測(cè)定。試劑和溶液的配制0.1%鄰菲啰啉鹽酸溶液：稱取0.1g鄰菲啰啉溶于少量水中，加入0.5ml1N鹽酸，溶解后用水稀釋至100ml，避光保存1%鹽酸羥胺溶液乙酸－乙酸鈉緩沖溶液：PH︽4.50.1N鹽酸溶液鐵標(biāo)準(zhǔn)溶液A（1ml含鐵0.100㎎）：稱取0.8635g的硫酸鐵銨（準(zhǔn)確至0.0001g），溶解于200ml水中，移至1000ml容量瓶中，加5ml濃鹽酸，用水稀釋至刻度，搖勻鐵標(biāo)準(zhǔn)溶液B（1ml含鐵0.010㎎）：用鐵標(biāo)準(zhǔn)溶液A稀釋至10倍，此液使用時(shí)配制；硫酸（1＋1）溶液稱樣和試液的制備

稱取10－20g試樣置于50ml燒杯中（稱準(zhǔn)至0.1g），在沙浴上蒸發(fā)至干（若用灼燒后殘?jiān)鼫y(cè)鐵，先用5ml硫酸溶解殘?jiān)?，蒸干），冷卻，加2ml鹽酸和25ml水，加熱使其溶解，移入100ml容量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，備用。標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

1準(zhǔn)顯色液的制備。往11個(gè)50ml容量瓶中，按下表所示，分別加入鐵標(biāo)準(zhǔn)溶液B。對(duì)每一個(gè)容量瓶中的溶液作下述處理：加水至約25ml，加2.5ml鹽酸羥胺溶液，5ml緩沖溶液，5min后加5ml鄰菲啰啉溶液，用水稀釋到刻度，搖勻，放置15－30min，顯色

2吸光度的測(cè)量。在510nm波長(zhǎng)處，用1cm吸收池，以水為參比，將分光光度計(jì)的吸光度調(diào)整到零后，測(cè)出標(biāo)準(zhǔn)顯色溶液的吸光度。3制標(biāo)準(zhǔn)曲線從每一標(biāo)準(zhǔn)顯色溶液的吸光度值，減去空白溶液的吸光度值，以所得吸光度值差為縱坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)的鐵質(zhì)量為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線的鐵質(zhì)量與吸光度的關(guān)系方程

m=K*A樣品測(cè)定

顯色：取一定量的試液，置于50ml容量瓶中，加水至約25ml，加2.5ml鹽酸羥胺溶液，5ml緩沖溶液5min后加5ml鄰菲啰啉溶液，用水稀釋到刻度，搖勻放置15－30min，顯色吸光度的測(cè)量：在510nm波長(zhǎng)處，用1cm吸收池，以水為參比，將分光光度計(jì)的吸光度調(diào)整到零后，測(cè)出標(biāo)準(zhǔn)顯色溶液的吸光度空白試驗(yàn):

在測(cè)定試液的同時(shí)，用同樣的操作、同樣數(shù)量的試劑，但不加試樣，作空白試驗(yàn)。結(jié)果的表示和計(jì)算從試液的吸光度值減去空白