第章基因操作技術(shù)

DNA和蛋白質(zhì)是細胞中最重要的生物大分子.

細胞中蛋白質(zhì)種類繁多,但大多數(shù)含量稀少,難以分離提取和進行分析.基因是編碼蛋白質(zhì)的DNA區(qū)段,DNA在同一個體的不同細胞中都是相同的,

容易分離提取和純化.所以,對DNA的研究能提供大量有關(guān)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能的信息(可從堿基序列推導(dǎo)出氨基酸序列，模擬蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能，或進行體外基因表達獲得相應(yīng)的蛋白質(zhì)).基因操作包括一系列的技術(shù)和程序:DNA分離提取、DNA克隆、DNA重組和DNA轉(zhuǎn)化.

需要載體、宿主細胞、和工具酶等.當(dāng)前1頁，總共29頁。

第一節(jié)

DNA克隆

1DNA克隆克隆是指遺傳上同一的生物體群體或由無性繁殖所產(chǎn)生的無性繁殖系(如株系,細胞系,菌株)DNA克隆是指含有相同DNA分子或DNA片段的的細胞群體.通過分離基因組DNA,擴增某個特定DNA片段,轉(zhuǎn)化到受體細胞中增殖，可制備出一個特定DNA克隆.

DNA制備是DNA克隆及其他DNA操作的第一步驟.DNA克隆的基本程序如下:當(dāng)前2頁，總共29頁。DNA提取

→

分離和擴增特定DNA片段(PCR)

載體連接

↓

↓

重組體DNA

↓轉(zhuǎn)化宿主細胞

↓

細胞培養(yǎng)(細胞克隆)

克隆篩查↓(分子雜交)

↓

靶DNA克隆

↓

表達分析與功能分析

當(dāng)前3頁，總共29頁。1.1DNA制備(提取)

組織細胞---→研磨破細胞---→

萃取

↓↓離心↓

分離

↓純化↓DNA樣品(

WithDNA

)當(dāng)前4頁，總共29頁。1.2DNA擴增(PCR)當(dāng)前5頁，總共29頁。1.3

轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化是把外源DNA（重組體DNA）轉(zhuǎn)移到宿主細胞中復(fù)制的過程。靶DNA

重組載體轉(zhuǎn)化細胞

分子克隆載體DNA當(dāng)前6頁，總共29頁。2宿主細胞,載體及亞克隆宿主?宿主生物或細胞能夠高速率復(fù)制外源DNA.?

多數(shù)宿主是細菌(如E.coli),培養(yǎng)細胞或原生質(zhì)體.

?

宿主細胞通常需經(jīng)感受態(tài)處理才能吸收外源DNA.

載體?載體是獨立于宿主細胞的復(fù)制子.

?載體易分離,帶有選擇標記,并容易插入外源DNA.

?

常用的載體有:質(zhì)粒,噬菌體,粘粒,細菌人工染色體和酵母人工染色體.當(dāng)前7頁，總共29頁。亞克隆:

亞克隆是從一個載體中將特定克隆DNA片段轉(zhuǎn)移到另一載體的過程.克隆DNA分離→

限制酶切

→靶DNA片段分離收集

靶DNA片段純化

→

載體連接

轉(zhuǎn)化,篩選,克隆分析

亞克隆當(dāng)前8頁，總共29頁。3DNA文庫

DNA文庫由一個基因組的全部DNA克隆所構(gòu)成,每個DNA克隆含有基因組DNA(基因組文庫)或總cDNA(cDNA文庫)的一個隨機片段.

?基因組文庫:

基因組DNA→隨機片段→重組體DNA→轉(zhuǎn)化↓

基因組DNA克隆

?cDNA文庫:

提取總mRNA→反轉(zhuǎn)錄為cDNA→重組體DNA

↓

轉(zhuǎn)化

↓

cDNA克隆

vectors當(dāng)前9頁，總共29頁?；蛭膸旌Y選是用分子探針或特殊蛋白質(zhì)從基因文庫中尋找特定DNA克隆的過程.DNA探針

每一克隆DNA

分子雜交(SouthernorWesternblot)

檢測與定性

克隆分析:結(jié)構(gòu)(序列)分析,功能分析(編碼蛋白質(zhì))

比對分析(同源基因).當(dāng)前10頁，總共29頁。第二節(jié)質(zhì)粒載體制備DNA載體是能獨立復(fù)制并能插入外源DNA的小分子DNA理想載體的要求:

?高復(fù)制率;

?多個限制性內(nèi)切酶識別位點(每種酶一個識別位點);

?帶有選擇性標記(克隆篩選標記和重組體篩選標記);

?能容納較大的DNA片段插入.質(zhì)粒是存在于細菌染色體外的小DNA分子,是最早用于基因操作的載體分子,主要用于攜帶外源基因進入細菌細胞中復(fù)制和表達.通常將攜帶外源基因的載體稱為重組載體

(重組DNA)當(dāng)前11頁，總共29頁。1質(zhì)粒?質(zhì)粒是染色體外的環(huán)狀DNA分子.

絕大多數(shù)質(zhì)粒發(fā)現(xiàn)于細菌細胞中,但對細菌的代謝和生命周期是非必需的.

?質(zhì)粒的存在可能賦予宿主細胞一些特性,如抗藥性、耐逆性、接合性等.

?質(zhì)粒能獨立于宿主DNA復(fù)制.

?質(zhì)粒賦予宿主的一些特性,可作為選擇性標記.?質(zhì)粒根據(jù)其復(fù)制特性可分為兩類:

嚴謹型質(zhì)粒(低復(fù)制率);

松馳型質(zhì)粒(高復(fù)制率).

當(dāng)前12頁，總共29頁。重組體篩選

雙標記,負選擇當(dāng)前13頁，總共29頁。重組體篩選

藍白斑當(dāng)前14頁，總共29頁。2質(zhì)粒制備

培養(yǎng)含所需質(zhì)粒的細菌株系;離心收集細菌沉淀物,再懸浮;堿裂解部分破壁增加細胞透性:

懸浮培養(yǎng)→裂解液→中和→離心→收集上清液

酚萃取除去蛋白質(zhì);乙醇沉淀,收集質(zhì)粒DNA;DNA純化:CsCl2

梯度離心(大量制備用)

緩沖液溶解,酚/仿萃取,乙醇沉淀

當(dāng)前15頁，總共29頁。質(zhì)粒

DNA

制備工藝當(dāng)前16頁，總共29頁。質(zhì)粒DNA瓊脂糖凝膠電泳+當(dāng)前17頁，總共29頁。第三節(jié)限制性內(nèi)切酶及酶切片段凝膠電泳1限制性DNA內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶催化從DNA分子內(nèi)部水解磷酸二酯鍵,切斷雙鏈DNA限制性內(nèi)切酶有特定的識別位點,且不同的限制性內(nèi)切酶的識別位點的序列各不相同.

限制

-

修飾系統(tǒng)是生物體的主要防御機制:

?限制性內(nèi)切酶在特定位點切割外來DNA,切割后的DNA片段再被其他的DNase完全水解;?甲基化酶給自身DNA的識別位點上的C或A堿基加上甲基,使限制性內(nèi)切酶不能催化該位點DNA水解,從而保護宿主DNA免受破壞.

當(dāng)前18頁，總共29頁。限制性內(nèi)切酶的分類:TypeI有特定識別位點但隨機切割.TypeII有特定識別位點且在同一位置切割.TypeIII有特定識別位點但在之外幾個堿基處切割DNA.

限制性內(nèi)切酶TypeII

的作用特點：識別位點是回文序列.切割后產(chǎn)生粘性末端(3`-突出或5`-突出),可進行退火堿基配對并用DNA連接酶修復(fù)連接.少數(shù)限制性內(nèi)切酶切割后可產(chǎn)生平端(鈍端),須用特殊的DNA連接酶(如T4

DNA連接酶)連接.當(dāng)前19頁，總共29頁。

當(dāng)前20頁，總共29頁。2瓊脂糖凝膠電泳反應(yīng)體系:瓊脂糖(0.5-2.0%);緩沖液(約pH8.0);DNA樣品(上樣緩沖液

+

DNA

+

EB

或其他染色劑);電場(

約100V

).當(dāng)前21頁，總共29頁。注意事項:在高pH條件下,所有DNA分子在緩沖液中均帶負電荷,在電泳過程中將向正極遷移.遷移率與DNA分子的大小(長度)成正相關(guān).相同大小的DNA在超螺旋狀態(tài)下的電泳遷移快于線性DNA和環(huán)狀DNA,線性DNA的電泳遷移快于環(huán)狀DNA.較大的DNA分子須在較低濃度的凝膠上進行電泳,較小的DNA分子可用較高濃度的凝膠.當(dāng)DNA與蛋白質(zhì)結(jié)合時,其電泳遷移明顯地減緩（凝膠阻滯）.當(dāng)前22頁，總共29頁。Electrophoretogram酶切片段的電泳分離當(dāng)前23頁，總共29頁。從瓊脂糖凝膠中分離特定的DNA片段:

?切膠,熔解凝膠和去除EB;

?酚/仿萃取、離心收集和純化DNA。

熔膠和去EB

Targetfragment當(dāng)前24頁，總共29頁。第四節(jié)

DNA片段連接,重組與轉(zhuǎn)化1DNA連接酶?DNA連接酶能修復(fù)雙鏈DNA上的缺刻，形成磷酸二酯鍵。T4DNA連接酶甚至能將兩個平端的雙鏈DNA片段連接起來.

?DNA連接酶的催化作用需要前一個核苷酸上有3`-OH、后一個核苷酸上有5`-Pi才能起反應(yīng)，還需要腺苷化試劑(NAD+,ATP等)活化磷酸基團并提供能量.━━━AATT-OH

P-CCGG━━━━━━━AATTCCGG━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━DNA連接酶當(dāng)前25頁，總共29頁。2重組

重組反應(yīng):

?用同一限制性內(nèi)切酶分別切割載體DNA和靶

DNA分子或片段,產(chǎn)生互補配對的粘性末端或平端;

?將酶切后的靶DNA和載體DNA進行退火配對，