熒光顯微鏡的基本使用方法

關(guān)于熒光顯微鏡的基本使用方法第一頁，共二十二頁，編輯于2023年，星期三實(shí)驗(yàn)?zāi)康?.了解熒光顯微鏡的基本原理；2.掌握熒光顯微鏡的基本結(jié)構(gòu)和使用注意事項(xiàng)；第二頁，共二十二頁，編輯于2023年，星期三自發(fā)性熒光物質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞和心肌細(xì)胞等內(nèi)的脂褐素呈棕黃色熒光。肝貯脂細(xì)胞和視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞內(nèi)的維生素A呈綠色熒光。某些神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞和神經(jīng)纖維內(nèi)的單胺類物質(zhì)（兒茶酚胺、5－羥色胺、組胺等）在甲醛作用下呈不同顏色的熒光。組織內(nèi)含有的奎寧、四環(huán)素等藥物也呈現(xiàn)一定的熒光。嗜中性粒細(xì)胞中脫氫酶輔酶呈現(xiàn)一定的熒光。第三頁，共二十二頁，編輯于2023年，星期三第四頁，共二十二頁，編輯于2023年，星期三優(yōu)點(diǎn)：檢出能力高對細(xì)胞的刺激小能進(jìn)行多重染色用途：物體構(gòu)造的觀察熒光的有無、色調(diào)比較進(jìn)行物質(zhì)判別發(fā)熒光量的測定對物質(zhì)定性、定量分析熒光顯微鏡的優(yōu)點(diǎn)和用途第五頁，共二十二頁，編輯于2023年，星期三實(shí)驗(yàn)原理光源激發(fā)濾色鏡分色鏡發(fā)射濾色鏡（阻擋濾片）第六頁，共二十二頁，編輯于2023年，星期三實(shí)驗(yàn)原理熒光顯微鏡的光路及主要部件光源激發(fā)光擋片激發(fā)濾色鏡分色鏡發(fā)射濾色鏡第七頁，共二十二頁，編輯于2023年，星期三第八頁，共二十二頁，編輯于2023年，星期三Microscopeswithanupright-styleframearecapableofproducingfluorescenceilluminationeitherthroughepiscopicordiascopicopticalpathways,althoughthelatterisrarelyusedtoday.Epi-illuminatorsusuallyconsistofamercuryorxenonlamphousecoupledtoaverticalilluminatorthatispositionedabovethemainframeinaseparateassembly.Themicroscopenosepieceandtransmittedlightcomponents(diascopicilluminator,condenser,fielddiaphragm,filters,etc.)arebuiltintothemainframe,whilefluorescencecomponentsarehousedintheverticalilluminator.Theseilluminatorsoftencontainarevolvingorslidingturretthathousesfourtosix"cubes"thatcontainamixtureofinterferencefiltersincludingabarrierfilter,dichroicmirror,andanexcitationfilter.Asillustratedabove,lightemittedfromthelamppositionedintheepiscopiclamphousepassesthroughacollectorlensandthenthefieldandaperturediaphragmsbeforeenteringthefirstinterferencefilterinthecubeset,theemissionfilter.Thislightisthendirectedthroughtheobjectiveandontothespecimenbyaspecialdichroicmirrorthatreflectscertainwavelengthswhilepassingothers.Secondaryfluorescence,emittedbyfluorophoresresidinginthespecimen,travelsbackthroughtheobjectiveandthedichroicmirrorbeforepassingthroughabarrierfilterandintothemicroscopeeyepiecesorcamerasystem.第九頁，共二十二頁，編輯于2023年，星期三激發(fā)光源高壓汞燈擁有313,337,365,405,436,546,and577

納米的峰值譜。高壓

Xenon燈有連續(xù)的可見光光譜范圍,光源強(qiáng)度比較平均。汞燈光譜第十頁，共二十二頁，編輯于2023年，星期三激發(fā)濾色塊具有多套激發(fā)濾色塊：激發(fā)濾色鏡（ExcitationFilter），分光鏡（DichromaticMirror），發(fā)射濾色鏡（EmissionFilter）。激發(fā)濾色塊六孔激發(fā)塊轉(zhuǎn)盤第十一頁，共二十二頁，編輯于2023年，星期三多用途型BX-RFA(適合多種科研要求)及通用型BX-URA2?？赏瑫r(shí)使用6種熒光激發(fā)塊，“輕撥式”激發(fā)塊轉(zhuǎn)換功能，使不同熒光激發(fā)之間的迅速轉(zhuǎn)換非常方便，并可消除震動(dòng)，有利于復(fù)染樣品的熒光觀察。激發(fā)塊標(biāo)識在暗室環(huán)境中發(fā)光，在暗室中也能很容易地選擇需要的熒光激發(fā)塊。另外，根據(jù)需要還可以選擇6孔濾色片滑塊(U-RSL6/U-RSL6EM)安放激發(fā)濾色片和發(fā)射濾色片進(jìn)行熒光觀察。第十二頁，共二十二頁，編輯于2023年，星期三第十三頁，共二十二頁，編輯于2023年，星期三BX51在鏡基上裝有3個(gè)濾色片（ND6，ND25，LBD），另外，還可以選裝第四個(gè)。鏡基側(cè)面的拉桿可以很容易地插入/取出濾色鏡。SpecimencolorfadingcanbedelayedbyreducingtheexcitationlightintensitywithNDfilters.UsetheNDfiltersasfarastheydonothinderobservations.InserttheNDfilters(U-25ND6and/orU-25ND25)withthemarkedsidefacingtowardtheobserver.第十四頁，共二十二頁，編輯于2023年，星期三第十五頁，共二十二頁，編輯于2023年，星期三1、

該鏡可作為明視場顯微鏡使用，也可作為熒光顯微鏡使用，根據(jù)需要，做相應(yīng)的附件連接，開啟相應(yīng)的電源。禁止亂調(diào)設(shè)置，以免影響他人正常使用。

2、

作為明視場顯微鏡使用；A、接通電源后，打開顯微鏡底座前的電源開關(guān)，按光亮需要調(diào)節(jié)底座右側(cè)的滑竿。B、根據(jù)需要，調(diào)節(jié)底座光柵和聚光器光柵及其高度，可獲得最佳的圖象效果。C、需要圖片，要把鏡體上的相應(yīng)拉桿拉到綠線位子。按下相應(yīng)附件上的照相按扭。

3、

作為熒光顯微鏡使用；A、先關(guān)閉熒光通道，再打開熒光激發(fā)器電源，等待15分鐘。B、等待期間，打開顯微鏡光源，找到需要觀察的樣品，選用合適的物鏡，調(diào)整焦距。C、關(guān)閉顯微鏡光源，打開熒光通道。D、需要圖片，要把鏡體上的相應(yīng)拉桿拉到綠線位子。按下相應(yīng)附件上的照相按扭。第十六頁，共二十二頁，編輯于2023年，星期三細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)DNA的直接熒光染色第十七頁，共二十二頁，編輯于2023年，星期三線粒體GFP轉(zhuǎn)基因擬南芥根（顯示葉綠體）葉片第十八頁，共二十二頁，編輯于2023年，星期三注意事項(xiàng)激發(fā)光擋片的使用----減少淬滅第十九頁，共二十二頁，編輯于2023年，星期三注意事項(xiàng)熒光的淬滅與激發(fā)光的照射時(shí)間成正比，因此應(yīng)盡量減少觀察時(shí)間外激發(fā)光對樣品的照射。激發(fā)光擋片可以部分或完全阻斷激發(fā)光光路。在正式觀察樣品之前，激發(fā)光光路應(yīng)該處于完全阻斷狀態(tài)。否則，在我們將樣品放到載物臺上，移動(dòng)樣品臺將樣品調(diào)整到物鏡位置，找到要觀察的細(xì)胞并進(jìn)行調(diào)焦的過程中，樣品上的熒光可能已經(jīng)發(fā)生了相當(dāng)程度的淬滅。為了避免觀察前不必要的淬滅，上述一系列操作需要在透射光源下進(jìn)行。當(dāng)眼睛離開物鏡進(jìn)行記錄或?qū)@微鏡交給合作實(shí)驗(yàn)者觀察時(shí)，要隨手阻斷激發(fā)光光路。實(shí)踐結(jié)果表明，熟練、規(guī)范和合理的觀察操作可以將樣品淬滅對觀察和記錄造成的影響降低到最小限度。熒光信號的淬滅還與激發(fā)光的強(qiáng)度成正比。因此，在可以觀察到熒光信號的情況下，應(yīng)該盡量降低激發(fā)光的強(qiáng)度。這樣做還有利于降低背景。第二十頁，共二十二頁，編輯于2023年，星期三NOTESTheinsideoftheultrahigh-pressuremercuryburnerisveryhotandhazardousduringlightingandforabout10minutesafterturningoff.Donotopenthelamphousinginthisperiod.Themercuryburnerhasaservicelifeperiodof200hours(USH102D)or300hours(HBD103W/2).Whenthehourcounteronthepowersupplyunitindicatesthisvalue,setthemainswitchto“O”(OFF)andwaitformorethan10minutesbeforereplacingthemercuryburner.Unlikeelectricbulbs,themercuryb