酶催化反應(yīng)動(dòng)力學(xué)固定化酶演示文稿

酶催化反應(yīng)動(dòng)力學(xué)固定化酶演示文稿當(dāng)前1頁(yè)，總共129頁(yè)。酶催化反應(yīng)動(dòng)力學(xué)固定化酶當(dāng)前2頁(yè)，總共129頁(yè)。酶催化反應(yīng)動(dòng)力學(xué)也稱酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)（kineticsofenzyme-catalyzedreactions），是研究酶促反應(yīng)速度以及影響此速度的各種因素的科學(xué)。在研究酶的結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系以及酶的作用機(jī)制時(shí)，需要酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)提供相關(guān)的實(shí)驗(yàn)證據(jù)；為了找到最有利的反應(yīng)條件從而提高酶催化反應(yīng)的效率以及了解酶在代謝過程中的作用和某些藥物的作用機(jī)制等，也需要我們掌握酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)的相關(guān)規(guī)律。因此，對(duì)于酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)的研究既有重要的理論意義又具有相當(dāng)?shù)膶?shí)踐價(jià)值。當(dāng)前3頁(yè)，總共129頁(yè)。酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)以化學(xué)動(dòng)力學(xué)為基礎(chǔ)，通過對(duì)酶促反應(yīng)速度的測(cè)定來討論諸如底物濃度、抑制劑、溫度、pH和激活劑等因素對(duì)酶促反應(yīng)速度的影響。酶的動(dòng)力學(xué)研究包括哪些內(nèi)容?重要當(dāng)前4頁(yè)，總共129頁(yè)。溫度、pH及激活劑都會(huì)對(duì)酶促反應(yīng)速度產(chǎn)生十分重要的影響，酶促反應(yīng)不但需要最適溫度和最適pH，還要選擇合適的激活劑。而且在研究酶促反應(yīng)速度以及測(cè)定酶的活力時(shí)，都應(yīng)選擇相關(guān)酶的最適反應(yīng)條件。當(dāng)前5頁(yè)，總共129頁(yè)。3.1酶催化反應(yīng)速度如果我們以產(chǎn)物生成量(或底物減少量)來對(duì)反應(yīng)時(shí)間作圖，便可以得到如圖3-1所示的曲線圖。當(dāng)前6頁(yè)，總共129頁(yè)。圖3-1酶促反應(yīng)的速度曲線該曲線的斜率表示單位時(shí)間內(nèi)產(chǎn)物生成量的變化，因此曲線上任何一點(diǎn)的斜率就是相應(yīng)橫坐標(biāo)上時(shí)間點(diǎn)的反應(yīng)速度。從圖中的曲線可以看出在反應(yīng)開始的一段時(shí)間內(nèi)斜率幾乎不變，然而隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，曲線逐漸變平坦，相應(yīng)的斜率也漸漸減小，反應(yīng)速度逐漸降低，顯然這時(shí)測(cè)得的反應(yīng)速度不能代表真實(shí)的酶活力。當(dāng)前7頁(yè)，總共129頁(yè)。引起酶促反應(yīng)速度隨反應(yīng)時(shí)間延長(zhǎng)而降低的原因很多，如底物濃度的降低、產(chǎn)物濃度增加從而加速了逆反應(yīng)的進(jìn)行、產(chǎn)物對(duì)酶的抑制或激活作用以及隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)引起酶本身部分分子失活等等。因此在測(cè)定酶活力時(shí)，應(yīng)測(cè)定酶促反應(yīng)的初速度，從而避免上述各種復(fù)雜因素對(duì)反應(yīng)速度的影響。由于反應(yīng)初速度與酶量呈線性關(guān)系，因此可以用測(cè)定反應(yīng)初速度的方法來測(cè)定相關(guān)制劑中酶的含量。當(dāng)前8頁(yè)，總共129頁(yè)。酶活力測(cè)定時(shí)需注意：1選擇反應(yīng)的最適溫度，根據(jù)不同的底物和緩沖液選擇反應(yīng)的最適pH。2速度要快，取反應(yīng)的初速度3底物濃度要足夠大（一般在10Km以上）使酶被底物飽和，以充分反應(yīng)待測(cè)酶的活力當(dāng)前9頁(yè)，總共129頁(yè)。測(cè)定酶活力的基本原理酶蛋白的含量很低，很難直接測(cè)定其蛋白質(zhì)的含量，且常與其他各種蛋白質(zhì)混合存在，將其提純耗時(shí)費(fèi)力。故不能直接用重量或體積等指標(biāo)來衡量。測(cè)定產(chǎn)物增加量測(cè)定底物減少量當(dāng)前10頁(yè)，總共129頁(yè)。測(cè)定酶活力常用的方法：分光光度法（spectrophotometry）利用底物和產(chǎn)物再紫外或可見光部分的光吸收的不同，選擇某一適當(dāng)?shù)牟ㄩL(zhǎng)，測(cè)定反應(yīng)過程中反應(yīng)進(jìn)行的情況熒光法（fluorometry）根據(jù)酶促反應(yīng)的底物或產(chǎn)物的熒光性質(zhì)的差別來進(jìn)行酶活力的測(cè)定同位素法（isotopemethod）放射性同位素的底物在經(jīng)酶作用后所得到的產(chǎn)物，通過適當(dāng)?shù)姆椒ㄟM(jìn)行分離，從而只需測(cè)定產(chǎn)物的脈沖數(shù)即可換算出酶的活力單位電化學(xué)方法（electrochemicalmethod）其他方法：如旋光法、量氣法、量熱法和層析法等當(dāng)前11頁(yè)，總共129頁(yè)。3.2底物濃度對(duì)酶促反應(yīng)速度的影響中間絡(luò)合物學(xué)說中間絡(luò)合物學(xué)說也稱酶底物中間絡(luò)合物學(xué)說，最早是由Henri和Wurtz兩位科學(xué)家提出的。在1903年，Henri在用蔗糖酶水解蔗糖實(shí)驗(yàn)研究化學(xué)反應(yīng)中底物濃度與反應(yīng)速度的關(guān)系時(shí)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)酶濃度不變時(shí)，可以測(cè)出一系列不同底物濃度下的化學(xué)反應(yīng)速度，以該反應(yīng)速度對(duì)底物濃度作圖，可得到如圖3-2所示的曲線。

當(dāng)前12頁(yè)，總共129頁(yè)。圖3-2底物濃度對(duì)酶促反應(yīng)速度的影響當(dāng)前13頁(yè)，總共129頁(yè)。從該曲線圖可以看出，當(dāng)?shù)孜餄舛容^低時(shí)，反應(yīng)速度與底物濃度的關(guān)系呈正比關(guān)系，反應(yīng)表現(xiàn)為一級(jí)反應(yīng)。然而隨著底物濃度的不斷增加，反應(yīng)速度不再按正比升高，此時(shí)反應(yīng)表現(xiàn)為混合級(jí)反應(yīng)。當(dāng)?shù)孜餄舛冗_(dá)到相當(dāng)高時(shí)，底物濃度對(duì)反應(yīng)速度影響逐漸變小，最后反應(yīng)速度幾乎與底物濃度無關(guān)，這時(shí)反應(yīng)達(dá)到最大反應(yīng)速度（Vmax），反應(yīng)表現(xiàn)為零級(jí)反應(yīng)。當(dāng)前14頁(yè)，總共129頁(yè)。根據(jù)這一實(shí)驗(yàn)結(jié)果，Henri和Wurtz提出了酶促化學(xué)反應(yīng)的酶底物中間絡(luò)合物學(xué)說。該學(xué)說認(rèn)為：當(dāng)酶催化某一化學(xué)反應(yīng)時(shí)，酶(E)首先需要和底物(S)結(jié)合生成酶底物中間絡(luò)合物即中間復(fù)合物(ES)，然后再生成產(chǎn)物(P)，同時(shí)釋放出酶。該學(xué)說可以用下面的化學(xué)反應(yīng)方程式來表示：

S+EES→P+E當(dāng)前15頁(yè)，總共129頁(yè)。我們根據(jù)中間絡(luò)合物學(xué)說很容易解釋圖3-2所示的實(shí)驗(yàn)曲線，在酶濃度恒定這一前提條件下，當(dāng)?shù)孜餄舛群苄r(shí)酶還未被底物所飽和，這時(shí)反應(yīng)速度取決于底物濃度并與之成正比。隨著底物濃度不斷增大，根據(jù)質(zhì)量作用定律，中間復(fù)合物ES生成也不斷增多，而反應(yīng)速度取決于ES的濃度，故反應(yīng)速度也隨之增高但此時(shí)二者不再成正比關(guān)系。當(dāng)前16頁(yè)，總共129頁(yè)。當(dāng)?shù)孜餄舛冗_(dá)到相當(dāng)高的程度時(shí)，溶液中的酶已經(jīng)全部被底物所飽和，此時(shí)溶液中再也沒有多余的酶，雖增加底物濃度也不會(huì)有更多的中間復(fù)合物ES生成，因此酶促反應(yīng)速度變得與底物濃度無關(guān)，而且反應(yīng)達(dá)到最大反應(yīng)速度（Vmax）。當(dāng)我們以底物濃度[S]對(duì)反應(yīng)速度v作圖時(shí)，就形成一條雙曲線。在此需要特別指出的是，只有酶促催化反應(yīng)才會(huì)有這種飽和現(xiàn)象，而與此相反，非催化反應(yīng)則不會(huì)出現(xiàn)這種飽和現(xiàn)象。當(dāng)前17頁(yè)，總共129頁(yè)。酶促反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)方程式（米氏方程）1913年Michaelis和Menten兩位科學(xué)家在前人工作的基礎(chǔ)上，根據(jù)酶促反應(yīng)的中間絡(luò)合物學(xué)說，推導(dǎo)出一個(gè)數(shù)學(xué)方程式，用來表示底物濃度與酶反應(yīng)速度之間的量化關(guān)系，通常把這個(gè)數(shù)學(xué)方程式稱為米氏方程：其中Km稱為米氏常數(shù)當(dāng)前18頁(yè)，總共129頁(yè)。米氏常數(shù)的含義Km值就代表著反應(yīng)速度達(dá)到最大反應(yīng)速度一半時(shí)的底物濃度。當(dāng)前19頁(yè)，總共129頁(yè)。米氏常數(shù)的應(yīng)用價(jià)值Km是酶的一個(gè)特征性常數(shù)：也就是說Km的大小只與酶本身的性質(zhì)有關(guān)，而與酶濃度無關(guān)。Km值還可以用于判斷酶的專一性和天然底物，Km值最小的底物往往被稱為該酶的最適底物或天然底物。Km可以作為酶和底物結(jié)合緊密程度的—個(gè)度量指標(biāo)，用來表示酶與底物結(jié)合的親和力大小。已知某個(gè)酶的Km值，就可以計(jì)算出在某一底物濃度條件下，其反應(yīng)速度相當(dāng)于Vmax的百分比。

Km值還可以幫助我們推斷具體條件下某一代謝反應(yīng)的方向和途徑，只有Km值小的酶促反應(yīng)才會(huì)在競(jìng)爭(zhēng)中占優(yōu)勢(shì)。當(dāng)前20頁(yè)，總共129頁(yè)。3.3抑制劑對(duì)酶促反應(yīng)速度的影響由于酶的本質(zhì)是蛋白質(zhì)，凡可使酶蛋白變性而引起酶活力喪失的作用都稱為失活作用(inactivation)。如果由于酶必需基團(tuán)的化學(xué)性質(zhì)發(fā)生改變，但酶并未發(fā)生變性，而引起酶活力降低或喪失的作用則稱為抑制作用(inhibition)。導(dǎo)致酶發(fā)生抑制作用的物質(zhì)稱為抑制劑(inhibitor)。當(dāng)前21頁(yè)，總共129頁(yè)。由于抑制作用與變性作用從本質(zhì)而言是不同的，因此與變性劑對(duì)酶的變性作用無選擇性不同的是，抑制劑對(duì)酶的抑制作用是有選擇性的，即一種抑制劑只能使某一種酶或?qū)δ骋活惷府a(chǎn)生抑制作用。當(dāng)前22頁(yè)，總共129頁(yè)。對(duì)酶抑制作用的探討是研究酶的結(jié)構(gòu)與功能、酶的催化機(jī)制以及闡明機(jī)體代謝途徑的基本手段，也可以為醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)中設(shè)計(jì)新藥物和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中設(shè)計(jì)新農(nóng)藥提供重要的理論依據(jù)，從這個(gè)角度而言，對(duì)酶抑制作用的研究不僅具有重要的理論意義，而且具有突出的實(shí)踐價(jià)值。當(dāng)前23頁(yè)，總共129頁(yè)。抑制作用的類型根據(jù)抑制劑與酶的作用方式的區(qū)別以及抑制作用是否可逆，我們可以將抑制作用分為兩大類，即：不可逆的抑制作用可逆的抑制作用。當(dāng)前24頁(yè)，總共129頁(yè)。3.3.1.1不可逆的抑制作用由于抑制劑與酶的必需基團(tuán)以共價(jià)鍵的形式結(jié)合而引起酶活力降低或喪失，因此不能用透析、超濾等物理方法去除抑制劑而使酶復(fù)活，這種抑制作用是不可逆的，我們稱之為不可逆抑制。此時(shí)被抑制的酶分子受到抑制劑對(duì)其不同程度的化學(xué)修飾，因此不可逆抑制從本質(zhì)上來說就是酶的修飾抑制。當(dāng)前25頁(yè)，總共129頁(yè)。不可逆抑制劑通常把不可逆抑制劑分為兩種類型，即非專一性不可逆抑制劑和專一性不可逆抑制劑。當(dāng)前26頁(yè)，總共129頁(yè)。①非專一性不可逆抑制劑主要包括以下六大類：a) 有機(jī)磷化合物b) 有機(jī)汞、有機(jī)砷化合物：抑制含巰基的酶。c) 重金屬鹽：能使酶蛋白變性而失活。d) 烷化劑：與酶必需基團(tuán)中的巰基、氨基、羧基、咪唑基和硫醚基等結(jié)合，從而抑制酶活性。e) 硫化物、氰化物和CO：這類物質(zhì)能通過與酶中金屬離子形成較為穩(wěn)定絡(luò)合物的形式，來抑制酶的活性。f) 青霉素（Penicillin）：青霉素可通過與糖肽轉(zhuǎn)肽酶活性部位絲氨酸羥基共價(jià)結(jié)合的方式，使糖肽轉(zhuǎn)肽酶失活，導(dǎo)致細(xì)菌細(xì)胞壁合成受阻，從而損害細(xì)菌生長(zhǎng)。當(dāng)前27頁(yè)，總共129頁(yè)。②專一性不可逆抑制劑可以分為Ks型和Kat型兩大類。a) Ks型不可逆抑制劑：具有與底物相類似的結(jié)構(gòu)b) Kat型不可逆抑制劑：該類抑制劑不但具有與天然底物相類似的結(jié)構(gòu)，而且抑制劑本身也是酶的底物，這類不可逆抑制劑的特點(diǎn)是專一性極高，因此也被稱為自殺性底物（suicidesubstrate）。當(dāng)前28頁(yè)，總共129頁(yè)。3.3.1.2可逆的抑制作用由于抑制劑與酶以非共價(jià)鍵的形式結(jié)合而引起酶活力降低或喪失，但是能用透析、超濾等物理方法除去抑制劑而使酶復(fù)活，這種抑制作用是可逆的，我們稱之為可逆抑制(reversibleinhibition)。當(dāng)前29頁(yè)，總共129頁(yè)。根據(jù)可逆抑制劑與底物的關(guān)系，我們將可逆抑制作用分為三種類型，它們分別是競(jìng)爭(zhēng)性抑制、非競(jìng)爭(zhēng)性抑制和反競(jìng)爭(zhēng)性抑制。當(dāng)前30頁(yè)，總共129頁(yè)。①競(jìng)爭(zhēng)性抑制(competitiveinhibition)：是最常見的一種可逆抑制作用。抑制劑(I)與底物(S)競(jìng)爭(zhēng)酶(E)的同一結(jié)合部位，因此抑制劑的存在直接影響底物與酶的正常結(jié)合。這是由于酶的活性部位不能同時(shí)既與底物結(jié)合又與抑制劑結(jié)合，所以在底物和抑制劑之間會(huì)產(chǎn)生競(jìng)爭(zhēng)，從而形成一定的平衡關(guān)系。當(dāng)前31頁(yè)，總共129頁(yè)。對(duì)于絕大多數(shù)競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑而言，其結(jié)構(gòu)與底物結(jié)構(gòu)十分類似，因此也能與酶的活性部位結(jié)合形成可逆的酶-抑制劑復(fù)合物EI，但酶-抑制劑復(fù)合物EI不能分解成產(chǎn)物P，導(dǎo)致相應(yīng)的酶促反應(yīng)速度下降。其抑制程度取決于底物和抑制劑的相對(duì)濃度，可以通過增加底物濃度的方法來解除這種抑制作用。這類抑制最典型的例子是丙二酸和戊二酸競(jìng)爭(zhēng)與琥珀酸脫氫酶結(jié)合，但不能催化脫氫反應(yīng)。當(dāng)前32頁(yè)，總共129頁(yè)。②非競(jìng)爭(zhēng)性抑制(noncompetitiveinhibition)：這類抑制作用的特點(diǎn)是底物(S)和抑制劑(I)可以同時(shí)與酶(E)結(jié)合，兩者之間不存在競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系。但是在酶與抑制劑結(jié)合后，還可以進(jìn)一步與底物結(jié)合形成酶-底物-抑制劑復(fù)合物ESI；酶與底物結(jié)合后，也可以進(jìn)一步與抑制劑結(jié)合形成酶-底物-抑制劑復(fù)合物ESI。但是這種中間的三元復(fù)合物，即酶-底物-抑制劑復(fù)合物ESI不能進(jìn)一步分解產(chǎn)生產(chǎn)物，因此相應(yīng)的酶促反應(yīng)速度下降。當(dāng)前33頁(yè)，總共129頁(yè)。由于這類抑制劑與酶活性部位以外的基團(tuán)相結(jié)合，因此其結(jié)構(gòu)與底物結(jié)構(gòu)并無相似之處，而且不能用增加底物濃度的方法來解除這種抑制作用，故稱非競(jìng)爭(zhēng)性抑制。這類抑制最典型的例子是亮氨酸是精氨酸酶的一種非競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑。還有某些重金屬離子如Ag+、Cu2+、Hg2+、Pb2+等對(duì)酶的抑制作用也屬于這一類。當(dāng)前34頁(yè)，總共129頁(yè)。③反競(jìng)爭(zhēng)性抑制(uncompetitiveinhibition)：這類抑制作用的特點(diǎn)是只有在酶(E)與底物(S)結(jié)合后，才能與抑制劑(I)結(jié)合，形成酶-底物-抑制劑復(fù)合物ESI，與非競(jìng)爭(zhēng)性抑制相似，這種中間的三元復(fù)合物，即酶-底物-抑制劑復(fù)合物ESI不能進(jìn)一步分解產(chǎn)生產(chǎn)物，因此相應(yīng)的酶促反應(yīng)速度下降。當(dāng)前35頁(yè)，總共129頁(yè)。這種抑制作用在單底物反應(yīng)中比較少見，而常見于多底物反應(yīng)中。目前已經(jīng)證明，肼類化合物對(duì)胃蛋白酶的抑制作用、氰化物對(duì)芳香硫酸酯酶的抑制作用、L-Phe和L-同型精氨酸等多種氨基酸對(duì)堿性磷酸酶的抑制作用都屬于反競(jìng)爭(zhēng)性抑制。當(dāng)前36頁(yè)，總共129頁(yè)。圖3-3酶與底物或抑制劑結(jié)合的中間物當(dāng)前37頁(yè)，總共129頁(yè)。當(dāng)前38頁(yè)，總共129頁(yè)?？赡嬉种谱饔煤筒豢赡嬉种谱饔玫蔫b別鑒別可逆抑制作用和不可逆抑制作用，除了用透析、超濾和凝膠過濾等物理方法能否除去抑制劑來判斷外，還可采用化學(xué)動(dòng)力學(xué)的方法來區(qū)分。當(dāng)前39頁(yè)，總共129頁(yè)。圖3-4可逆抑制劑與不可逆抑制劑的區(qū)別（一）曲線1，無抑制劑；曲線2，不可逆抑制劑；曲線3，可逆抑制劑當(dāng)前40頁(yè)，總共129頁(yè)。在測(cè)定酶活力的系統(tǒng)中加入一定量的抑制劑，然后測(cè)定不同酶濃度條件下的酶促反應(yīng)初速度，以酶促反應(yīng)初速度對(duì)酶濃度作圖。在測(cè)定酶活力的系統(tǒng)中不加抑制劑時(shí)，以酶促反應(yīng)初速度對(duì)酶濃度作圖得到如圖3-4曲線1所示的一條通過原點(diǎn)的直線；當(dāng)測(cè)定酶活力的系統(tǒng)中加入一定量的不可逆抑制劑時(shí)，由于抑制劑會(huì)使一定量的酶失活，因此只有加入的酶量大于不可逆抑制劑的量時(shí)，才表現(xiàn)出酶活力。當(dāng)前41頁(yè)，總共129頁(yè)。以酶促反應(yīng)初速度對(duì)酶濃度作圖得到如圖3-4曲線2所示的一條與曲線1平行的相交于橫坐標(biāo)正側(cè)的直線，所以不可逆抑制劑的作用相當(dāng)于把原點(diǎn)向右移動(dòng)；當(dāng)測(cè)定酶活力的系統(tǒng)中加入一定量的可逆抑制劑時(shí)，由于抑制劑的量是恒定的，因此以酶促反應(yīng)初速度對(duì)酶濃度作圖得到如圖3-4曲線3所示的一條通過原點(diǎn)，但斜率較低于曲線1的直線。當(dāng)前42頁(yè)，總共129頁(yè)?？赡嬉种谱饔脛?dòng)力學(xué)對(duì)于可逆抑制劑與酶結(jié)合后產(chǎn)生的抑制作用，可以根據(jù)米氏學(xué)說基本原理加以推導(dǎo)，來定量說明可逆抑制劑對(duì)酶促反應(yīng)速度的影響，下面著重討論三種類型可逆抑制作用的化學(xué)動(dòng)力學(xué)。當(dāng)前43頁(yè)，總共129頁(yè)。3.3.3.1競(jìng)爭(zhēng)性抑制在競(jìng)爭(zhēng)性抑制中，底物(S)或抑制劑(I)與酶(E)的結(jié)合都是可逆的，因此存在著如下的化學(xué)平衡式：當(dāng)前44頁(yè)，總共129頁(yè)。在加入競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑后，Vmax不變，Km變大，Km’﹥Km，而且Km隨抑制劑濃度[I]的增加而增加。抑制分?jǐn)?shù)與抑制劑濃度[I]成正比，而與成反應(yīng)物濃度[S]反比。雙倒數(shù)作圖所得直線相交于縱軸，這就是競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用的特點(diǎn)。當(dāng)前45頁(yè)，總共129頁(yè)。圖3-5競(jìng)爭(zhēng)性抑制曲線當(dāng)前46頁(yè)，總共129頁(yè)。3.3.3.2非競(jìng)爭(zhēng)性抑制在非競(jìng)爭(zhēng)性抑制中，抑制劑(I)與酶(E)或酶-底物復(fù)合物(ES)以及底物(S)與酶-抑制劑復(fù)合物(EI)的結(jié)合都是可逆的，因此存在著如下的化學(xué)平衡式：當(dāng)前47頁(yè)，總共129頁(yè)。在加入非競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑后，Km值不變，Vmax變小，而且Km’=Km，Vmax隨[I]的增加而減小。抑制分?jǐn)?shù)與抑制劑濃度[I]成正比，而與底物濃度[S]無關(guān)，即[I]不變時(shí)，任何[S]的抑制分?jǐn)?shù)是一個(gè)常數(shù)。雙倒數(shù)作圖所得直線相交于橫軸，這是非競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用的特點(diǎn)。當(dāng)前48頁(yè)，總共129頁(yè)。圖3-6非競(jìng)爭(zhēng)性抑制曲線當(dāng)前49頁(yè)，總共129頁(yè)。3.3.3.3反競(jìng)爭(zhēng)性抑制反競(jìng)爭(zhēng)性抑制的特點(diǎn)是，酶(E)必須先與底物(S)結(jié)合，然后才與抑制劑(I)結(jié)合，即抑制劑(I)與酶-底物復(fù)合物(ES)的結(jié)合是可逆的，因此存在著如下的化學(xué)平衡式：當(dāng)前50頁(yè)，總共129頁(yè)。在加入反競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑后，Km及Vmax都變小，而且Km’﹤Km，Vmax’﹤Vmax，即表觀Km及表觀Vmax，都隨[I]的增加而減小。抑制分?jǐn)?shù)既與抑制劑濃度[I]成正比，也與底物濃度[S]成正比。雙倒數(shù)作圖為一組平行線，這是反競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用的特點(diǎn)。當(dāng)前51頁(yè)，總共129頁(yè)。圖3-7反競(jìng)爭(zhēng)性抑制曲線當(dāng)前52頁(yè)，總共129頁(yè)。為了方便理解和記憶，我們現(xiàn)將無抑制劑和有抑制劑等不同情況下的米氏方程和Vmax及Km的變化總結(jié)歸納在表3-1中。當(dāng)前53頁(yè)，總共129頁(yè)。為了便于比較三種抑制類型的區(qū)別，我們可以用Dixon作圖法求Ki，只要以抑制劑濃度[I]為橫坐標(biāo)，以酶促反應(yīng)速度的倒數(shù)1/v為縱坐標(biāo)，采用一個(gè)以上的底物濃度[S]，然后給出不同[S]時(shí)的直線，再由這些直線的交點(diǎn)即可以得到Ki，如圖3-8所示。當(dāng)前54頁(yè)，總共129頁(yè)。圖3-8Dixon作圖法求Ki（[S2]﹥[S1]）A.非競(jìng)爭(zhēng)性抑制B.競(jìng)爭(zhēng)性抑制C.反競(jìng)爭(zhēng)性抑制當(dāng)前55頁(yè)，總共129頁(yè)。3.4其它因素對(duì)酶促反應(yīng)速度的影響其它各種影響酶促反應(yīng)速度的因素主要包括溫度、pH和激活劑等。當(dāng)前56頁(yè)，總共129頁(yè)。溫度對(duì)酶促反應(yīng)速度的影響和絕大多數(shù)化學(xué)反應(yīng)一樣，酶促化學(xué)反應(yīng)速度也和溫度密切相關(guān)。溫度對(duì)酶促化學(xué)反應(yīng)速度的影響主要表現(xiàn)在兩個(gè)方面，其一是當(dāng)溫度升高時(shí)，與一般化學(xué)反應(yīng)一樣，反應(yīng)速度加快，這種影響可以用反應(yīng)的溫度系數(shù)來衡量。當(dāng)前57頁(yè)，總共129頁(yè)。所謂反應(yīng)的溫度系數(shù)是指反應(yīng)溫度提高10℃，其反應(yīng)速度與原來反應(yīng)速度之比，通常用Q10來表示。對(duì)大多數(shù)酶而言，酶促化學(xué)反應(yīng)的溫度系數(shù)Q10多為2，即溫度每升高10℃，酶促化學(xué)反應(yīng)速度為原反應(yīng)速度的2倍。其二是由于酶的本質(zhì)是蛋白質(zhì)，因此隨著溫度逐漸升高，酶蛋白會(huì)因逐漸變性而失活從而導(dǎo)致酶促化學(xué)反應(yīng)速度下降。當(dāng)前58頁(yè)，總共129頁(yè)。在不同溫度條件下進(jìn)行某種酶促化學(xué)反應(yīng)，然后將所測(cè)得的酶促反應(yīng)速度相對(duì)于溫度來作圖，即可得到如圖3-9所示的鐘罩形曲線。從該曲線我們可以看出，在較低的溫度范圍內(nèi)，酶促化學(xué)反應(yīng)速度隨溫度升高而增大，但在超過一定溫度后，酶促化學(xué)反應(yīng)速度不見上升反而下降，因此只有在某一溫度條件下，酶促化學(xué)反應(yīng)速度達(dá)到最大值，通常把這個(gè)溫度稱為酶促化學(xué)反應(yīng)的最適溫度(optimumtemperature)。在一定條件下每種酶都有其催化反應(yīng)的最適溫度。當(dāng)前59頁(yè)，總共129頁(yè)。酶所表現(xiàn)的最適溫度是上述兩種影響綜合作用的結(jié)果。在酶促化學(xué)反應(yīng)的最初階段，酶蛋白的變性尚未表現(xiàn)出來，第一個(gè)方面的影響占主導(dǎo)地位，因此反應(yīng)速度隨溫度升高而增加；但當(dāng)反應(yīng)溫度逐漸高于最適溫度時(shí)，酶蛋白變性逐漸突出，第二個(gè)方面的影響逐漸取代第一個(gè)方面的影響從而占主導(dǎo)地位，反應(yīng)速度隨溫度升高的效應(yīng)也將逐漸被酶蛋白變性效應(yīng)所抵消，反應(yīng)速度開始迅速下降，因此表現(xiàn)出酶促化學(xué)反應(yīng)的最適溫度。當(dāng)前60頁(yè)，總共129頁(yè)。一般來說，動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)的酶最適溫度一般為35～40℃，植物細(xì)胞中的酶最適溫度較動(dòng)物細(xì)胞中稍高，通常在40～50℃之間，而微生物中的酶最適溫度差別則較大，如用于進(jìn)行PCR反應(yīng)的TaqDNA聚合酶的最適溫度可高達(dá)70℃。當(dāng)前61頁(yè)，總共129頁(yè)。需要指出的是，最適溫度不是酶的特征物理常數(shù)，相反它常常受到其他各種條件如底物種類、作用時(shí)間、pH和離子強(qiáng)度等因素影響。如最適溫度隨酶促反應(yīng)進(jìn)行時(shí)間的長(zhǎng)短而改變，這是因?yàn)闇囟仁姑傅鞍装l(fā)生變性效應(yīng)是隨時(shí)間而逐步累加的。一般而言，酶促反應(yīng)進(jìn)行時(shí)間長(zhǎng)時(shí)酶的最適溫度低，酶促反應(yīng)進(jìn)行時(shí)間短則最適溫度高，所以只有在規(guī)定的酶促反應(yīng)時(shí)間內(nèi)才可確定酶的最適溫度。當(dāng)前62頁(yè)，總共129頁(yè)。圖3-9溫度對(duì)酶促反應(yīng)速度的影響

酶在固體狀態(tài)下比在溶液中對(duì)溫度的耐受力更高。酶的冰凍干粉制劑通常在冰箱中可存放幾個(gè)月以上，而酶溶液一般在冰箱中只能保存數(shù)周。所以酶制劑以固體保存為佳。當(dāng)前63頁(yè)，總共129頁(yè)。4.5.2pH對(duì)酶促反應(yīng)速度的影響除溫度影響之外，酶的活力還受到環(huán)境pH的影響。通常在一定pH下，酶會(huì)表現(xiàn)出最大活力，而一旦高于或低于此pH，酶活力就會(huì)降低，我們把表現(xiàn)出酶最大活力時(shí)的pH稱為該酶的最適pH，在不同pH條件下進(jìn)行某種酶促化學(xué)反應(yīng)，然后將所測(cè)得的酶促反應(yīng)速度相對(duì)于pH來作圖，即可得到如圖3-10所示的鐘罩形曲線。當(dāng)前64頁(yè)，總共129頁(yè)。圖3-10pH對(duì)酶活力的影響當(dāng)前65頁(yè)，總共129頁(yè)。與酶促化學(xué)反應(yīng)的最適溫度不同的是，各種酶在一定條件下都有其特定的最適pH，因此最適pH是酶的特性之一。但是酶的最適pH并不是一個(gè)常數(shù)，它受諸如底物種類和濃度、緩沖液種類和濃度等眾多因素的影響，因此只有在一定條件下最適pH才有意義。當(dāng)前66頁(yè)，總共129頁(yè)。絕大多數(shù)酶的最適pH在5～8之間，動(dòng)物體內(nèi)的酶最適pH多在6.5～8.0之間，植物及微生物中的酶酶最適pH多在4.5～6.5左右。但并不排除例外，如胃蛋白酶的最適pH為1.5，肝中精氨酸酶最適pH為9.7等等。當(dāng)前67頁(yè)，總共129頁(yè)。pH影響酶活力的原因可能包括以下幾個(gè)方面：(1)過酸或過堿使酶的空間結(jié)構(gòu)遭到破壞，引起酶變性從而導(dǎo)致酶構(gòu)象的改變、酶活性隨之喪失。(2)當(dāng)pH改變不是十分劇烈時(shí)，酶雖未發(fā)生變性，但其活力已經(jīng)受到影響。這是由于pH影響了底物的解離狀態(tài)或酶分子活性部位上有關(guān)基團(tuán)的解離狀態(tài)或酶-底物復(fù)合物的解離狀態(tài)，而使底物不能與酶結(jié)合形成酶-底物復(fù)合物，或者形成酶-底物復(fù)合物后不能生成產(chǎn)物，使酶活性降低。當(dāng)前68頁(yè)，總共129頁(yè)。(3)pH影響了與維持酶分子空間結(jié)構(gòu)有關(guān)的基團(tuán)解離，從而改變酶活性部位的構(gòu)象，進(jìn)而降低了酶的活性。當(dāng)前69頁(yè)，總共129頁(yè)。4種pH-酶活性曲線當(dāng)前70頁(yè)，總共129頁(yè)。激活劑對(duì)酶促反應(yīng)速度的影響與抑制劑相對(duì)的是，凡是能提高酶活性的物質(zhì)都稱為激活劑(activator)，而激活劑中大部分是無機(jī)離子或簡(jiǎn)單的有機(jī)化合物。作為激活劑的金屬離子主要包括K+、Na+、Ca2+、Mg2+、Zn2+及Fe2+等離子，無機(jī)陰離子主要包括Cl-、Br-、I-、CN-、PO4-等。如Mg2+可以作為多種激酶及合成酶的激活劑，Cl-可以作為唾液淀粉酶的激活劑。當(dāng)前71頁(yè)，總共129頁(yè)。激活劑對(duì)酶的作用具有一定程度的選擇性，即一種激活劑只對(duì)某種酶起激活作用，而對(duì)另一種酶可能不起任何作用或起抑制作用，如對(duì)脫羧酶而言有激活作用的Mg2+對(duì)肌球蛋白腺三磷酶卻有抑制作用；而對(duì)脫羧酶而言有抑制作用的Ca2+對(duì)肌球蛋白腺三磷酶卻有激活作用。有時(shí)各種離子之間有拮抗作用，如被K+激活的酶會(huì)受Na+的抑制，被Mg2+激活的酶會(huì)受Ca2+的抑制。有時(shí)金屬離子的作用也可以相互替代，如作為激酶的激活劑的Mg2+可被Mn2+所代替。當(dāng)前72頁(yè)，總共129頁(yè)。除此以外，可因濃度不同，同一種激活劑對(duì)于同一種酶會(huì)起不同的作用，如對(duì)于NADP+合成酶，當(dāng)Mg2+濃度為(5～10)×10-3mol／L時(shí)起激活作用酶活性上升，但當(dāng)濃度升高到30×10-3mol／L時(shí)酶活性下降；如果用Mn2+代替Mg2+，則在1×10-3mol／L起激活作用酶活性上升，高于此濃度時(shí)則起抑制作用酶活性下降。當(dāng)前73頁(yè)，總共129頁(yè)。除了上面提到的金屬離子之外，有些小分子有機(jī)化合物也可作為酶的激活劑。例如對(duì)木瓜蛋白酶和甘油醛3-磷酸脫氫酶等含巰基的酶而言半胱氨酸，還原型谷胱甘肽等還原劑對(duì)其有激活作用，它們可使酶中二硫鍵還原成巰基從而提高酶活性。因此在分離純化木瓜蛋白酶和甘油醛3-磷酸脫氫酶等含巰基的酶過程中，往往需加半胱氨酸，還原型谷胱甘肽等還原劑，以保護(hù)巰基不至于在分離純化過程中被氧化。當(dāng)前74頁(yè)，總共129頁(yè)。第4章固定化酶和固定化細(xì)胞（2學(xué)時(shí)）主要內(nèi)容：

4.1固定化酶的定義與優(yōu)點(diǎn)

4.2酶固定化技術(shù)發(fā)展史

4.3固定化酶的制備方法

4.4固定化酶的特性

4.5固定化活細(xì)胞

4.6酶催化反應(yīng)器及其類型當(dāng)前75頁(yè)，總共129頁(yè)。本章主要介紹了固定化技術(shù)的發(fā)展史、酶和細(xì)胞的固定化方法以及酶經(jīng)固定化后性質(zhì)的變化，從動(dòng)力學(xué)方面分析了固定化后酶特性變化的原因，并簡(jiǎn)要介紹了酶反應(yīng)器的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)。當(dāng)前76頁(yè)，總共129頁(yè)。固定化酶、固定化細(xì)胞是一種在空間運(yùn)動(dòng)上受到完全約束或局部約束的酶、細(xì)胞。近代工業(yè)化利用始于1969年固定化氨基?；傅膽?yīng)用。利用固定化技術(shù)，解決了酶應(yīng)用過程中的很多問題，為酶的應(yīng)用開辟了新的前景。如可使所使用的酶、細(xì)胞能反復(fù)使用，使產(chǎn)物分離提取容易，并在生產(chǎn)工藝上可以實(shí)現(xiàn)連續(xù)化和自動(dòng)化，故在20世紀(jì)70年代后得到迅速發(fā)展。其新的功能和新的應(yīng)用正在迅速不斷地?cái)U(kuò)展，是一項(xiàng)研究領(lǐng)域?qū)拸V、應(yīng)用前景極為引人矚目的新研究領(lǐng)域和新技術(shù)。當(dāng)前77頁(yè)，總共129頁(yè)。4.1固定化酶的定義與優(yōu)點(diǎn)所謂固定化酶(immobilizedenzyme)，是指在一定的空間范圍內(nèi)起催化作用，并能反復(fù)和連續(xù)使用的酶。當(dāng)前78頁(yè)，總共129頁(yè)。固定化酶的優(yōu)點(diǎn)：（1）同一批固定化酶能在工藝流程中重復(fù)多次地使用；（2）固定化后，和反應(yīng)物分開，有利于控制生產(chǎn)過程，同時(shí)也省去了熱處理使酶失活的步驟；（3）穩(wěn)定性顯著提高；（4）可長(zhǎng)期使用，并可預(yù)測(cè)衰變的速度；（5）提供了研究酶動(dòng)力學(xué)的良好模型。當(dāng)前79頁(yè)，總共129頁(yè)。4.2酶固定化技術(shù)發(fā)展史

酶作為一種生物催化劑，因其催化作用具有高度專一性、催化條件溫和、無污染等特點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于食品加工、醫(yī)藥和精細(xì)化工等行業(yè)。但在使用過程中，人們也注意到酶的一些不足之處，如酶穩(wěn)定性差、不能重復(fù)使用，并且反應(yīng)后混入產(chǎn)品，純化困難，使其難以在工業(yè)中更為廣泛的應(yīng)用。為適應(yīng)工業(yè)化生產(chǎn)的需要，人們模仿人體酶的作用方式，通過固定化技術(shù)對(duì)酶加以固定改造，來克服游離酶在使用過程中的一些缺陷。當(dāng)前80頁(yè)，總共129頁(yè)。將酶固定化以后，既保持了酶的催化特性，又克服了游離酶的不足之處，使其具有一般化學(xué)催化劑能回收反復(fù)使用的優(yōu)點(diǎn)，并在生產(chǎn)工藝上可以實(shí)現(xiàn)連續(xù)化和自動(dòng)化。事實(shí)上，早在1916年，Nelson和Griffin就用吸附的方法實(shí)現(xiàn)了酶的固定化，他們將蔗糖酶吸附在骨炭粉上，發(fā)現(xiàn)吸附以后酶不溶于水而且具有和液體酶同樣的活性，可惜這個(gè)重要的發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)期以來沒有得到酶學(xué)家的重視。當(dāng)前81頁(yè)，總共129頁(yè)。系統(tǒng)地進(jìn)行酶的固定化研究則是從20世紀(jì)50年代開始的。1953年Grubhofer和Schleith將聚氨基苯乙烯樹氮脂重化，然后將淀粉酶、羧肽酶、、胃蛋白酶和核糖核酸酶等酶與這種載體結(jié)合，制成了固定化酶。六十年代后期，酶固定化技術(shù)迅速發(fā)展，出現(xiàn)了很多新的酶固定化方法。1969年，日本的著名學(xué)者千畑一郎等將固定化氨基酰化酶應(yīng)用于DL-氨基酸的光學(xué)拆分上，來生產(chǎn)L-氨基酸，開創(chuàng)了固定化酶應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)的先例。當(dāng)前82頁(yè)，總共129頁(yè)。在20世紀(jì)60年代后期對(duì)酶的固定化研究主要是將酶與水不溶性載體結(jié)合起來，成為不溶于水的酶衍生物，所以最初曾稱為水不溶酶（waterinsolubleenzyme）和固相酶（solidphaseenzyme）。但是隨著理論與技術(shù)的發(fā)展，后來發(fā)現(xiàn)也可以將溶解狀態(tài)的酶固定在一個(gè)有限的空間使其不能自由移動(dòng)，也能達(dá)到固定酶的作用。如把酶包埋在凝膠內(nèi)，酶本身是可溶的，因此，用水不溶酶和固相酶的名稱就不恰當(dāng)了。所以在1971年召開的第一屆國(guó)際酶工程會(huì)議上，建議采用統(tǒng)一的英文名稱ImmobilizedEnzyme。當(dāng)前83頁(yè)，總共129頁(yè)。用于固定化的酶，起初都是采用經(jīng)提取和分離純化后的酶，后來隨著固定化技術(shù)的發(fā)展，作為固定化的對(duì)象已不一定是酶，也可對(duì)含酶細(xì)胞或細(xì)胞器進(jìn)行固定化。1973年，日本的千畑一郎等成功的使用固定化大腸桿菌菌體中的天冬氨酸酶，由反丁烯二酸連續(xù)生產(chǎn)L-天冬氨酸，將固定化微生物細(xì)胞首次應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)，使細(xì)胞固定化技術(shù)迅速發(fā)展1986年，我國(guó)科學(xué)家利用固定化原生質(zhì)體發(fā)酵生產(chǎn)堿性磷酸酶和葡萄糖氧化酶等相繼獲得成功。當(dāng)前84頁(yè)，總共129頁(yè)。目前，固定化技術(shù)已經(jīng)取得了許多重要成果，充分發(fā)揮了固定化酶和固定化細(xì)胞在改革工藝和降低成本方面的巨大潛力。但從目前的發(fā)展?fàn)顩r來看，盡管酶種類繁多，但已經(jīng)固定化的酶卻相對(duì)有限，采用固定化酶技術(shù)大規(guī)模生產(chǎn)的企業(yè)尚屬少數(shù)，真正在工業(yè)上使用的固定化酶還僅限于葡萄糖異構(gòu)酶、葡萄糖氧化酶和青霉素?；傅葹閿?shù)不多的十幾個(gè)酶種，故仍需大力研究開發(fā)使更多的固定化酶和細(xì)胞能適用于工業(yè)規(guī)模生產(chǎn)。當(dāng)前85頁(yè)，總共129頁(yè)。4.3固定化酶的制備方法固定化酶的制備方法、制備材料多種多樣，不同的制備方法和材料，固定化后酶的特性不同。對(duì)于特定的目標(biāo)酶，要根據(jù)酶自身的性質(zhì)、應(yīng)用目的、應(yīng)用環(huán)境來選擇固定化載體和方法。當(dāng)前86頁(yè)，總共129頁(yè)。在具體選擇時(shí)，一般應(yīng)遵循以下幾個(gè)原則。

（1）必須注意維持酶的構(gòu)象，特別是活性中心的構(gòu)象。酶的催化反應(yīng)取決于酶本身蛋白質(zhì)分子所特有的高級(jí)結(jié)構(gòu)和活性中心，為了不損害酶的催化活性及專一性，酶在固定化狀態(tài)下發(fā)揮催化作用時(shí)，既需要保證其高級(jí)結(jié)構(gòu)，又要使構(gòu)成活性中心的氨基酸殘基不發(fā)生變化。當(dāng)前87頁(yè)，總共129頁(yè)。這就要求酶與載體的結(jié)合部位不應(yīng)當(dāng)是酶的活性部位，應(yīng)避免活性中心的氨基酸殘基參與固定化反應(yīng)；另外，由于酶蛋白的高級(jí)結(jié)構(gòu)是憑借疏水鍵、氫鍵、鹽鍵等較弱的鍵維持的，所以固定化時(shí)應(yīng)采取盡可能溫和的條件，避免那些可能導(dǎo)致酶蛋白高級(jí)結(jié)構(gòu)破壞的條件，如高溫、強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、有機(jī)溶劑等處理。當(dāng)前88頁(yè)，總共129頁(yè)。（2）酶與載體必須有一定的結(jié)合程度。酶的固定化既不影響酶的原有構(gòu)象，又能使固定化酶能有效回收貯藏，利于反復(fù)使用。（3）固定化應(yīng)有利于自動(dòng)化、機(jī)械化操作。這要求用于固定化的載體必須有一定的機(jī)械強(qiáng)度，才能使之在制備過程中不易破壞或受損。（4）固定化酶應(yīng)有最小的空間位阻。固定化應(yīng)盡可能不妨礙酶與底物的接近，以提高催化效率和產(chǎn)物的量。當(dāng)前89頁(yè)，總共129頁(yè)。（5）固定化酶應(yīng)有最大的穩(wěn)定性。在應(yīng)用過程中，所選載體應(yīng)不和底物、產(chǎn)物或反應(yīng)液發(fā)生化學(xué)反應(yīng)。（6）固定化酶的成本適中。工業(yè)生產(chǎn)必須要考慮到固定化成本，要求固定化酶應(yīng)是廉價(jià)的，以利于工業(yè)使用。當(dāng)前90頁(yè)，總共129頁(yè)。酶的固定化方法主要可分為四類：吸附法、包埋法、共價(jià)鍵結(jié)合法和交聯(lián)法等。吸附法和共價(jià)鍵結(jié)合法又可統(tǒng)稱為載體結(jié)合法。當(dāng)前91頁(yè)，總共129頁(yè)。吸附法吸附法（adsorption）是通過載體表面和酶分子表面間的次級(jí)鍵相互作用而達(dá)到固定目的的方法，是固定化中最簡(jiǎn)單的方法。酶與載體之間的親和力是范德華力、疏水相互作用、離子鍵和氫鍵等。吸附法又可分為物理吸附法和離子吸附法。當(dāng)前92頁(yè)，總共129頁(yè)。物理吸附法(physicaladsorption)是通過物理方法將酶直接吸附在水不溶性載體表面上而使酶固定化的方法。是制備固定化酶最早采用的方法，如α-淀粉酶、糖化酶、葡萄糖氧化酶等都曾采用過此法進(jìn)行固定化。物理吸附法常用的有機(jī)載體如纖維素、膠原、淀粉及面筋等；無機(jī)載體如活性炭、氧化鋁、皂土、多孔玻璃、硅膠、二氧化鈦、羥基磷灰石等。（1）物理吸附法當(dāng)前93頁(yè)，總共129頁(yè)。物理吸附法制備固定化酶，優(yōu)點(diǎn)：操作簡(jiǎn)單、價(jià)廉、條件溫和，載體可反復(fù)使用，酶與載體結(jié)合后，活性部位及空間構(gòu)象變化不大，故所制得的固定化酶活力較高。缺點(diǎn)：由于靠物理吸附作用，酶和載體結(jié)合不牢固，在使用過程中容易脫落，所以使用受到限制。常與交聯(lián)法結(jié)合使用。當(dāng)前94頁(yè)，總共129頁(yè)。離子吸附法(ionadsorption)是將酶與含有離子交換基團(tuán)的水不溶性載體以靜電作用力相結(jié)合的固定化方法，即通過離子鍵使酶與載體相結(jié)合的固定化方法。此法固定的酶有葡萄糖異構(gòu)酶、糖化酶、β-淀粉酶、纖維素酶等，在工業(yè)上用途較廣。如最早應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)的氨基?；?，就是使用多糖類陰離子交換劑二乙基氨基乙基(DEAE)-葡聚糖凝膠固定化的。此外，DEAE-纖維素吸附的α-淀粉酶、蔗糖酶已作為商品固定化酶。（2）離子吸附法當(dāng)前95頁(yè)，總共129頁(yè)。離子吸附法所使用的載體是某些離子交換劑。常用的陰離子交換劑有DEAE-纖維素、混合胺類(ECTEOLA)-纖維素、四乙氨基乙基(TEAE)-纖維素、DEAE-葡聚糖凝膠、AmberliteIRA-93、410、900等；陽(yáng)離子交換劑有羧甲基(CM)-纖維素、纖維素檸檬酸鹽、AmberliteCG-50、IRC-50、IR-200、Dowex-50等。其吸附容量一般大于物理吸附劑。離子吸附法優(yōu)點(diǎn)：具有操作簡(jiǎn)便、條件溫和、酶活力不易喪失等優(yōu)點(diǎn)。此外，吸附過程同時(shí)可以純化酶。當(dāng)前96頁(yè)，總共129頁(yè)。包埋法包埋法（entrapment）是將酶包埋在高聚物的細(xì)微凝膠網(wǎng)格中或高分子半透膜內(nèi)的固定化方法。前者又稱為凝膠包埋法，酶被包埋成網(wǎng)格型；后者又稱為微膠囊包埋法，酶被包埋成微膠囊型。當(dāng)前97頁(yè)，總共129頁(yè)。（1）凝膠包埋法凝膠包埋法常用的載體有海藻酸鈉凝膠、角叉菜膠、明膠、瓊脂凝膠、卡拉膠等天然凝膠以及聚丙烯酰胺、聚乙烯醇和光交聯(lián)樹脂等合成凝膠或樹脂。（2）微膠囊包埋法微膠囊包埋即將酶包埋在各種高聚物制成的半透膜微膠囊內(nèi)的方法。它使酶存在于類似細(xì)胞內(nèi)的環(huán)境中，可以防止酶的脫落，防止微囊外的環(huán)境直接接觸，從而增加了酶的穩(wěn)定性。常用于制造微膠囊的材料有聚酰胺、火棉膠、醋酸纖維素等。當(dāng)前98頁(yè)，總共129頁(yè)。用微膠囊包埋法制得的微囊型固定化酶的直徑通常為幾微米到數(shù)百微米，膠囊孔徑為幾埃至數(shù)百埃，適合于小分子為底物和產(chǎn)物的酶的固定化。如脲酶、天冬酰胺酶、尿酸酶、過氧化氫酶等。其制造方法有界面聚合法、界面沉淀法、二級(jí)乳化法、液膜（脂質(zhì)體）法等。當(dāng)前99頁(yè)，總共129頁(yè)。共價(jià)鍵結(jié)合法共價(jià)鍵結(jié)合法(covalentbinding）是將酶與聚合物載體以共價(jià)鍵結(jié)合的固定化方法。酶蛋白上可供載體結(jié)合的功能基團(tuán)有以下幾種：當(dāng)前100頁(yè)，總共129頁(yè)。（1）酶蛋白N末端的α-氨基或賴氨酸殘基的ε-氨基。（2）酶蛋白C末端的α-羧基、天門冬氨酸殘基的β-羧基以及谷氨酸殘基的γ-羧基。（3）半胱氨酸殘基的巰基。（4）絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸殘基的羥基。（5）組氨酸殘基的咪唑基。（6）色氨酸殘基的吲哚基。（7）苯丙氨酸和酪氨酸殘基的苯環(huán)。當(dāng)前101頁(yè)，總共129頁(yè)。其中最普遍的共價(jià)鍵結(jié)合基團(tuán)是氨基、羧基以及苯環(huán)。常用來和酶共價(jià)偶聯(lián)的載體的功能基團(tuán)有芳香氨基、羥基、羧基和羧甲基等。這種方法是固定化酶研究中最活躍的一大類方法，但必須注意，參加共價(jià)結(jié)合的氨基酸殘基應(yīng)當(dāng)是酶催化活性非必需基團(tuán)，如若共價(jià)結(jié)合包括了酶活性中心有關(guān)的基團(tuán)，會(huì)導(dǎo)致酶的活力損失。當(dāng)前102頁(yè)，總共129頁(yè)。使載體活化的方法（1）重氮法重氮法是將酶蛋白與水不溶性載體的重氮基團(tuán)通過共價(jià)鍵相連接而固定化的方法，是共價(jià)鍵法中使用最多的一種。常用的載體有多糖類的芳族氨基衍生物、氨基酸的共聚體和聚丙烯酰胺衍生物等。當(dāng)前103頁(yè)，總共129頁(yè)。（2）疊氮法即載體活化生成疊氮化合物，再與酶分子上的相應(yīng)基團(tuán)偶聯(lián)成固定化酶。含有羥基、羧基、羧甲基等基團(tuán)的載體都可用此法活化。如CMC、CM-sephadex（交聯(lián)葡聚糖）、聚天冬氨酸、乙烯-順丁烯二酸酐共聚物等都可用此法來固定化酶，其中使用最多的是羧甲基纖維素疊氮法。當(dāng)前104頁(yè)，總共129頁(yè)。（3）溴化氰法即用溴化氰將含有羥基的載體，如纖維素、葡聚糖凝膠、瓊脂糖凝膠等，活化生成亞氨基碳酸酯衍生物，然后再與酶分子上的氨基偶聯(lián)，制成固定化酶。任何具有連位羥基的高聚物都可用溴化氰法來活化。由于該法可在非常緩和的條件下與酶蛋白的氨基發(fā)生反應(yīng)，近年來已成為普遍使用的固定化方法。尤其是溴化氰活化的瓊脂糖已在實(shí)驗(yàn)室廣泛用于固定化酶以及親和層析的固定化吸附劑。

當(dāng)前105頁(yè)，總共129頁(yè)。（4）烷化法和芳基化法以鹵素為功能團(tuán)的載體可與酶蛋白分子上的氨基、巰基、酚基等發(fā)生烷基化或芳基化反應(yīng)而使酶固定化。此法常用的載體有鹵乙酰、三嗪基或鹵異丁烯基的衍生物。當(dāng)前106頁(yè)，總共129頁(yè)。從上面介紹的四種制備方法可看出，用共價(jià)鍵結(jié)合法制備的固定化酶，酶和載體之間都是通過化學(xué)反應(yīng)以共價(jià)鍵偶聯(lián)。由于共價(jià)鍵的鍵能高，酶和載體之間的結(jié)合相當(dāng)牢固，即使用高濃度底物溶液或鹽溶液，也不會(huì)使酶分子從載體上脫落下來，具有酶穩(wěn)定性好、可連續(xù)使用較長(zhǎng)時(shí)間的優(yōu)點(diǎn)。當(dāng)前107頁(yè)，總共129頁(yè)。但是采用該方法時(shí)，載體活化的難度較大，操作復(fù)雜，反應(yīng)條件較劇烈，制備過程中酶直接參與化學(xué)反應(yīng)，易引起酶蛋白空間構(gòu)象變化，酶活回收率一般為30%左右，甚至酶的底物的專一性等性質(zhì)也會(huì)發(fā)生變化，往往需要嚴(yán)格控制操作條件才能獲得活力較高的固定化酶。當(dāng)前108頁(yè)，總共129頁(yè)。現(xiàn)在已有不少活化的商品化酶固定化載體，它們的使用不需做大量的處理工作，商品一般以干的固定相或預(yù)裝柱的形式供應(yīng)，一般情況下這些固定相已經(jīng)活化好，酶的固定化只要將酶在合適的pH和其它相關(guān)條件下，讓酶循環(huán)通過柱子便可完成。

當(dāng)前109頁(yè)，總共129頁(yè)。交聯(lián)法交聯(lián)法（cross-linking）是使用雙功能或多功能試劑使酶分子之間相互交聯(lián)呈網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的固定化方法。由于酶蛋白的功能團(tuán)，如氨基、酚基、巰基和咪唑基，參與此反應(yīng)，所以酶的活性中心構(gòu)造可能受到影響，而使酶失活明顯。但是盡可能地降低交聯(lián)劑濃度和縮短反應(yīng)時(shí)間將有利于固定化酶活力的提高。當(dāng)前110頁(yè)，總共129頁(yè)。常用的雙功能試劑有戊二醛、己二胺、異氰酸衍生物、雙偶氮聯(lián)苯和N,N′-乙烯雙順丁烯二酰亞胺等，其中使用最廣泛的是戊二醛。戊二醛和酶蛋白中的游離氨基發(fā)生Schiff反應(yīng)，形成薛夫堿，從而使酶分子之間相互交聯(lián)形成固定化酶。當(dāng)前111頁(yè)，總共129頁(yè)。以上四種固定化酶方法各有其優(yōu)缺點(diǎn)（見表4-1）。往往一種酶可以用不同方法固定化，但沒有一種固定化方法可以普遍地適用于每一種酶。在實(shí)際應(yīng)用時(shí)，常將兩種或數(shù)種固定化方法并用，以取長(zhǎng)補(bǔ)短。當(dāng)前112頁(yè)，總共129頁(yè)。當(dāng)前113頁(yè)，總共129頁(yè)。4.4固定化酶的特性當(dāng)前114頁(yè)，總共129頁(yè)。固定化酶的形狀固定化酶的形式多樣，依不同用途有顆粒、線條、薄膜和酶管等形狀。其中顆粒占絕大多數(shù)，它和線條主要用于工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)，如裝成酶柱用于連續(xù)生產(chǎn)，或在反應(yīng)器中進(jìn)行批式攪拌反應(yīng)；薄膜主要用于酶電極，應(yīng)用于分析化學(xué)；酶管機(jī)械強(qiáng)度較大，亦宜用于工業(yè)生產(chǎn)。當(dāng)前115頁(yè)，總共129頁(yè)。固定化酶的性質(zhì)酶在水溶液中以自由的游離狀態(tài)存在，但是固定后酶分子便從游離的狀態(tài)變?yōu)槔喂痰亟Y(jié)合于載體的狀態(tài)，其結(jié)果往往引起酶的性質(zhì)的改變。為此，在固定化酶的應(yīng)用過程中，必須了解固定化酶的性質(zhì)與游離酶之間的差別，并對(duì)操作條件加以適當(dāng)調(diào)整。由于固定化的方法不同，固定化酶的活力和性質(zhì)也有所不同。當(dāng)前116頁(yè)，總共129頁(yè)。酶活力固定化酶的活力在多數(shù)情況下比天然酶的活力低，其原因可能是：①酶活性中心的重要氨基酸殘基與水不溶性載體相結(jié)合；②當(dāng)酶與載體結(jié)合時(shí)，它的高級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化，其構(gòu)象的改變導(dǎo)致了酶與底物結(jié)合能力或催化底物轉(zhuǎn)化能力的改變；③酶被固定化后，雖不失活，但