代謝工程中一個乳酸菌雙乳酸脫氫酶敲除提高以乙醇的產(chǎn)生(個人翻譯 僅供參考)

代謝工程中一個乳酸菌雙乳酸脫氫酶敲除以提高乙醇的產(chǎn)量摘要乳酸菌通過Embden-邁耶霍夫-帕納斯（EMP）途徑發(fā)酵葡萄糖：中間代謝物丙酮酸通過乳酸脫氫酶（LDH）的作用轉(zhuǎn)化為乳酸。用丙酮酸脫羧酶（PDC）取代乳酸脫氫酶（LDH）對丙酮酸進行催化作用,可以使丙酮酸生成乙醇從而代替乳酸的產(chǎn)生。將一個革蘭氏陽性菌——胃八疊球菌（Spdc）的丙酮酸脫羧酶（PDC）基因引入到一個植物乳桿菌TF103乳酸脫氫酶缺陷型菌株中，使其中l(wèi)dhL和ldhD基因失活。在胃八疊球菌和S.ventriculi（—種菌株）啟動子或三個乳酸乳球菌啟動子中的四個不同的融合基因中的PTRKH2（厭氧靶向自殺基因）被引入到TF103中。檢測所有四個重組株的丙酮酸脫羧酶（PDC）的活性。通過對工程菌生產(chǎn)乙醇和其他代謝產(chǎn)物在燒瓶中的發(fā)酵來檢驗工程菌。重組菌株的生長略快于親代TF103并且生產(chǎn)90——130毫米的乙醇。雖然產(chǎn)生的略多的乙醇是明顯的，但是碳元素向乙醇代謝的途徑并沒有得到顯著改善，因此建議進一步了解了這個有機體的新陳代謝是必要的。關(guān)鍵字：乙醇發(fā)酵；代謝工程；乳酸菌；丙酮酸脫羧酶；胃八疊球菌（SPDC）正文介紹乳酸菌是一類兼性厭氧的革蘭氏陽性菌。乳酸菌通常缺乏呼吸鏈，它們利用發(fā)酵產(chǎn)生的一系列糖類來提供能量用于細胞的維護和生長。在乳酸菌的發(fā)酵中，乳酸是發(fā)酵的終產(chǎn)物，而在異型乳酸發(fā)酵細菌的發(fā)酵中，通常戊糖通過磷酸乙酮醇酶途徑（PPT途徑）產(chǎn)生的是乙醇、二氧化碳、醋酸和乳酸的混合物。乳酸菌一般被認(rèn)為是安全的，天然的乳酸菌已經(jīng)被應(yīng)用于發(fā)酵工業(yè)中。近年來，人們研究基因改造乳酸菌用于生產(chǎn)乳酸、B族維生素、低熱量糖醇如山梨醇和甘露醇。乳酸菌可以在較低的pH值條件下生長，并且很多菌株是耐乙醇的。這些特點都有助于開發(fā)新的微生物用于發(fā)酵木質(zhì)纖維素生物質(zhì)生產(chǎn)乙醇。將纖維素轉(zhuǎn)化為乙醇，要求微生物能夠，發(fā)酵從水解木質(zhì)纖維素生物質(zhì)中釋放出來的葡萄糖和木糖糖類。許多乳酸菌可以代謝多糖，包括戊糖。因此，對于代謝工程中的生物質(zhì)生產(chǎn)乙醇來說，它們似乎是理想的宿主。但是，乳酸菌不會生產(chǎn)大量的

乙醇，因為它們會將糖發(fā)酵成乳酸。本實驗研究的目的在于，利用植物乳桿菌作為模式菌株，用于探索使其從產(chǎn)生乳酸轉(zhuǎn)而產(chǎn)生乙醇的能力的可能性。負(fù)責(zé)使丙酮酸產(chǎn)生乙醇的酶有丙酮酸脫羧酶（PDC;EC4.1.1.1）和乙醇脫氫酶（ADH;EC1.1.1.1）。丙酮酸脫羧酶（PDC）催化丙酮酸脫羧產(chǎn)生乙醛和二氧化碳，然后乙醛通過乙醇脫氫酶催化變?yōu)橐掖?。Mobilis的運動發(fā)酵單胞菌中生產(chǎn)乙醇的基因pdc和adh被整合在一個便攜式的pet操縱子中。理論上，將pet操縱子引入到大腸桿菌中，乙醇的收益率可能在86——92%。pet操縱子也被引入到革蘭氏陽性菌和乳酸菌菌株中。這些重組的菌株很少或者不能產(chǎn)乙醇，這表明源于革蘭氏陰性菌的pdc基因不能在革蘭氏陽性菌中發(fā)揮適當(dāng)?shù)墓δ?。這可能是由于革蘭氏陰性菌革蘭氏陰性菌種類之間對于密碼子的偏好性和/或基因表達的顯著差異所造成的。與普遍存在于許多生物包括細菌中的乙醇脫氫酶（ADH）不同，雖然丙酮酸脫羧酶（PDC）廣泛的分布在植物中，但是它們只能在少數(shù)種類的細菌中才能被找到。最近才得到描述的在革蘭氏陽性菌中僅有的pdc基因來自于胃八疊球菌（SPDC）。在酸性條件下（pH3.0）,S.ventriculi利用丙酮酸脫羧酶（PDC）使碳元素和電子的流向從流向醋酸、甲酸、和乙醇改變?yōu)橹饕飨蛞掖肌.ventriculi的丙酮酸脫羧酶（PDC）是被丙酮酸激活的并且符合S形動力學(xué)，類似真菌和高等植物的酶符合米氏動力學(xué)。這種革蘭氏陽性菌Spdc基因中G+C密碼子的低頻率使用，為革蘭氏陽性菌工程宿主對于丙酮酸脫羧酶（PDC）高水平的表達和開發(fā)第二代可以使用生物質(zhì)糖產(chǎn)乙醇的微生物提供了可能。本文的目的是確定革蘭氏陽性菌一一胃八疊球菌（Spdc）可以在植物乳桿菌中功能性表達，并且測試是否有一種乳酸缺陷型的植物乳桿菌菌株能夠被采用主要用來發(fā)酵生產(chǎn)乙醇。材料與方法菌株與生長條件Goodwin和Zeikus如上述在厭氧條件下培養(yǎng)S.ventriculiJK。Ferain博士提供了植物乳桿菌NCIMB8826衍生株TF103。TF103菌株是D型和L型乳酸脫氫酶活性的缺陷型菌株，培養(yǎng)在37°C、100rpm（轉(zhuǎn)/每分鐘）添加了氯霉素（10卩g/ml）或紅霉素（5》g/ml）MRS液體培養(yǎng)基中。大腸桿菌DH5a,BL21（DE3）pLysS

（Invitrogen公司，卡爾斯巴德，CA）,和BL21-CodonPlus-RIL（Stratagene公司，拉霍亞，CA）生長在37°C,BHI或Luria-Bertani中，需要時可向培養(yǎng)基中加紅霉素（150》g/ml）,或氨芐青霉素（50》g/ml）或氯霉素（35》g/ml）。Table1OligonucleotidesusedinthisstudyM13Reverse CAGGAAACAGCTATGACT7PromoterSpdc5^XbalT7PromoterSpdc5^XbalSpdc3^XholSpdc5^ATGBamHISpdc3^KpnlSpdc301431Amj5^EcoRVAmj30XbaIGGCTTCTAGATAAAAAATGAATTGGAGGGCGGGCTCGAGATTAGTAGTTATTTTGGCCGGATCCATGAAAATAACAATTGCAGGCCGGTACCATTAGTAGTTATTTTGTCTGCTGCATATCCTGCAACCGATATCATTTTTGGTTGCCATTTGTTCCTCTAGACTAGACAACAAAATAG將胃八疊球菌（Spdc）克隆到pBluescript（原核表達載體）和pTRKH2（大腸桿菌穿梭質(zhì)粒）使用Bactozol試劑盒（分子研究中心，俄亥俄州辛辛那提）從S.ventriculi中分離染色體DNA，按照制造商所描述的擬定方法，額外用氯仿抽提。PCR以S.ventriculi基因組DNA為模板，Spdc5CXbaI和Spdc30XhoI為引物（表1），從Genbank中獲得其儲存的序列AF354297并且這一序列引物的末端具有XbaIandXhoI位點。從基因組DNA中擴增出1.7kb的全長Spdc基因，然后進行純化、消化，并且克隆到pBluescriptSK載體以及穿梭載體pTRKH2的XbaIandXhoI位點以獲得pTRKH2Spdc重組子。Sambrook等將用到的標(biāo)準(zhǔn)的分子生物學(xué)技術(shù)進行了描述。用Qiaprep自旋試劑盒（Qiagen公司，瓦倫西亞，CA）進行大腸桿菌的質(zhì)粒DNA的純化制備。根據(jù)O'Sullivan和Klaenhammer，從植物乳桿菌菌株中分離質(zhì)粒。如上所訴，完成DNA的測序和數(shù)據(jù)分析。在大腸桿菌中表達SpdcPCR引物Spdc5‘端的ATGBamHI酶切位點和Spdc3/端的Kpnl酶切位點用于擴增Spdc基因并且將其克隆到pRSETa（BamHI/KpnI）載體中。由此產(chǎn)生的pRSET-Spdc用來轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3），pLysS，和BL21-CodonPlus-RIL。在體內(nèi)，根據(jù)供應(yīng)商指示進行了IPTG（異丙基-BD-半乳糖苷）誘導(dǎo)和表達。細胞顆粒的裂解使用CelLyticB+試劑盒（Sigma公司，圣路易斯，密蘇里州）。約10》g可溶及不可溶的蛋白提取物（重懸于50》g磷酸鹽緩沖液），進行12.5%的SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳。為了提高過量表達的蛋白質(zhì)的溶解度，在10ml稀釋的TB培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)，培養(yǎng)基中含有不同濃度（0,200,and500mM）的甘氨酸（Sigma公司），培養(yǎng)在37°C、OD=1的條件下。在0.5mMIPTG、27°C的600條件下進行14-16小時的蛋白質(zhì)表達的誘導(dǎo)。在植物乳桿菌TF103中表達Spdc革蘭氏陽性啟動子--SPDC的融合構(gòu)造如下。在pAK80中，以克隆質(zhì)粒AMJ772,AMJ769和AMJ692所含有三個乳酸啟動子作為模板擴增118bp的啟動子序列，引物為Amj5‘EcoRV和Amj3‘Xbal位。這些啟動子序列被克隆到pTRKH2Spdc的EcoRI/XbaI位點，分別生成pTRKH2772Spdc,pTRKH2769Spdc,和pTRKH2692Spdc。上述的這些結(jié)構(gòu)通過電轉(zhuǎn)化被轉(zhuǎn)入到植入乳桿菌TF103，重組子通過紅霉素篩選獲得。丙酮酸脫羧酶檢測如前所述，需進行丙酮酸脫羧酶（PDC）活性的檢測。簡言之，培養(yǎng)的含有SPDC融合基因的重組大腸桿菌和植物乳桿菌TF103細胞在含有2mM（毫摩）TPP和20mM（毫摩）硫酸鎂的50mM磷酸鈉緩沖液（pH值6.5）使用beadbeater研磨珠均質(zhì)器（Biospec產(chǎn)品，巴特爾斯維爾，OK）進行溶解。使用BIORAD蛋白測定試劑盒（BIO-RAD實驗室，大力士，CA）對蛋白濃度進行測定。將蛋白提取物（150-250》g/ml）加入到含有30mM（毫摩）乙醛，40mM（毫摩）甲醛，2mM（毫摩）TPP和20mM（毫摩）硫酸鎂的50mM（毫摩）磷酸鈉緩沖液（pH值6.5）中，定容至500》l,并在25C下培養(yǎng)30分鐘。向反應(yīng)混合物的上清中加入含0.2%的2,3,5-氯化三苯基四氮唑（甲醇溶解）和10》l3M的氫氧化鈉（最終130mM（毫摩））的四氮唑紅20》l,然后進行（R）-PAC的檢測。形成甲臜（大腸菌群在發(fā)育時伴隨產(chǎn)生琥珀酸脫氫酶將紙片上的TTC（紅四碳唑）還原成不可逆的甲?（Formazane）產(chǎn)生紅色色素）的數(shù)量分光光度計在510nm處進行測定。1分鐘1毫克蛋白質(zhì)形成l》mol的甲臜即為具體的一個單位PDC活性。工程菌株TF103的發(fā)酵利用搖瓶發(fā)酵對產(chǎn)乙醇的重組植物乳桿菌TF103菌株進行評估。如上所訴，用加紅霉素的4%葡萄糖MRS培養(yǎng)基進行重復(fù)發(fā)酵。發(fā)酵時間在72小時至240小時之間時，每隔一段時間取出一些樣品。殘余的葡萄糖和發(fā)酵產(chǎn)物，包括乳酸，醋酸和乙醇的濃度，利用高效液相色譜進行測定。通過兩個實驗獲得的數(shù)據(jù)計算代謝產(chǎn)量（g乙醇/g葡萄糖），并且通過反復(fù)發(fā)酵分析其它發(fā)酵產(chǎn)物的產(chǎn)生。結(jié)果SPDC基因在大腸桿菌中的過量表達為了評估是否可以生產(chǎn)具有功能的PDC,將克隆出SPDC的ORF（開放可讀框）亞克隆到具有組氨酸標(biāo)記序列的大腸桿菌表達載體pRSETa中。通過SDS分析用IPTG誘導(dǎo)的帶有pRSETa（表達載體）的大腸桿菌BL21-CodonPlus-RIPL的細胞提取物（BL21-CodonPlus系列：包括BL21-CodonPlus*（DE3）-RIPL,BL21-CodonPlps-RIL，BL21-CodonPlps（DE3）-RIL,BL21-CodonPlps-RP,BL21CodonPlus*（DE3）-RP等。這些受體菌添加了大腸桿菌中編碼精氨酸（R），亮氨酸（L）,異亮氨酸（I）和脯氨酸（P）稀有密碼子的tRNA基因，更多用于表達一些真核生物的基因。其中RIL系列常用于AT含量高的基因，而RP系列主要用于GC含量高的基因（更多信息參考Stratagene公司資料），存在于不可溶組分的Spdc顯示出明顯的條帶，與61kDa的多肽相對應(yīng)。這一過量表達的SPDC的大小，符合所報道的在自然載體中58kDa加大約3kDa。SDS-PAGE結(jié)果表明，SPDC表達為不溶性聚合折疊中間物，也就是包涵體。為了誘導(dǎo)過量表達SPDC蛋白正確折疊，在帶或不帶IPTG誘導(dǎo)的培養(yǎng)基中加入甘氨酰和二肽。用分光光度計檢測PDC酶的活性。如圖3所示，經(jīng)200毫摩甘氨酰、無IPTG誘導(dǎo)處理后細胞裂解液中可溶部分，PDC的活性最高。由此可見，對使用載體pRSETa表達的SPDC來說IPTG的處理是沒有必要的。不溶性組分的酶活性尚未確定。將革蘭氏陽性啟動子-SPDC融合體引入TF103三個革蘭氏陽性啟動子，包括酸誘導(dǎo)的啟動子p692、高表達的啟動子p769,和相對中等強度啟動子p772以及天然的Spdc5'端側(cè)翼序列，與SPDC基因融合在宿主范圍廣泛的載體PTRKH2中。將這些ldhL和ldhD基因失活的結(jié)構(gòu)中引入到植物乳桿菌TF103中。在通過分析從重組菌株分離出質(zhì)粒的限制性內(nèi)切酶發(fā)現(xiàn)，在TF103中有沒有觀察DNA重組的融合基因或pTRKH2（數(shù)據(jù)未顯示）。之后，在測定TF103重組株P(guān)DC酶活性時發(fā)現(xiàn)，所有四個菌株都高于本底水平。在菌株中，PDC活性差異可能是由于在啟動子序列的差異，由于菌株包含SPDC與酸誘導(dǎo)的啟動子融合，pTRKH2-692-Spdc呈現(xiàn)出最高的PDC活性。正如之前報道，酸誘導(dǎo)啟動子在pH值5.5比在pH7.0更活躍，在培養(yǎng)這些菌株pH值應(yīng)介于4.20至5.80，在收獲得時進行酶活性分析。重組株的發(fā)酵分析燒瓶發(fā)酵以研究工程菌產(chǎn)乙醇的能力。高效液相色譜分析發(fā)酵產(chǎn)品表明，攜帶Spdc基因所有四株生產(chǎn)的乙醇的量比僅被pTRKH2載體轉(zhuǎn)化的對照菌株更大。菌株692-SPDC和769-SPDC顯示出比其他測試菌株稍高的乙醇產(chǎn)量。然而，重組菌株也產(chǎn)生大量的乳酸。攜帶PTRKH2載體的對照菌生長速度非常緩慢，生產(chǎn)的主要醋酸（76毫摩），一些乳酸（60毫摩）和乙醇（17毫摩）。通過高效液相色譜法分析兩個獨立發(fā)酵實驗的數(shù)據(jù)表明，乙醇代謝產(chǎn)量（克每克消耗糖生產(chǎn)乙醇）為消耗每克用葡萄糖產(chǎn)生0.15-0.28克乙醇。討論代謝工程的一個主要目標(biāo)是操縱生物系統(tǒng)使用適當(dāng)?shù)乃拗鲗崿F(xiàn)所需工藝流程。在本研究中，革蘭氏陽性的植物乳桿菌菌株作為宿主被引入革蘭氏陽性PDC基因來增加乙醇的產(chǎn)量。以往的研究表明，PDC是以丙酮酸生產(chǎn)乙醇的關(guān)鍵酶，S.ventriculi的PDC基因中低含量的G+C做為一個合理的候選通過基因工程被引入到乳酸菌中。對于大多數(shù)乳酸菌，糖類（己糖和戊糖在某些情況下）是發(fā)酵的主要原料，丙酮酸是糖原料通過不同的途徑形成的中央代謝產(chǎn)物。丙酮酸主要是通過乳酸脫氫酶的催化行動轉(zhuǎn)化為乳酸。植物乳桿菌菌株在TF103包含需基因敲除的LDH（乳酸脫氫酶）基因。植物乳桿菌TF103的代謝分析表明，在丙酮酸的積累過程的同時，乳酸的量是否很低或檢測不到，這取決于生長和發(fā)酵條件的好壞。因此，植物乳桿菌TF103被選定作為基因操縱的宿主菌，通過引入革蘭氏陽性SPDC基因，努力引導(dǎo)丙酮酸進入乙醇發(fā)酵的途徑。據(jù)預(yù)期估計，過量表達的S.ventriculi的PDC基因，在TF103中將中央代謝產(chǎn)物丙酮酸轉(zhuǎn)化為乙醛，乙醛隨后被一些內(nèi)源性的乙醇脫氫酶催化成乙醇。在重組菌株中觀察到不同的PDC酶活性的表明，每個啟動子驅(qū)動TF103SPDC表達的強度是不同的?；赟PDC酶法的檢測，看來，酸誘導(dǎo)啟動子p692使得SPDC表達在TF103中最有效。進一步發(fā)酵分析結(jié)果表明，與轉(zhuǎn)化了PTRKH2的對照菌株TF103（17毫米乙醇和乳酸60毫米）相比，重組菌株表現(xiàn)出較高的產(chǎn)乙醇量（90-130